兩種磷蝦油在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及生物利用度研究

孫艷賓，劉　云，姜國(guó)良，王　超

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210）

兩種磷蝦油在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及生物利用度研究

孫艷賓，劉云，姜國(guó)良，王超

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210）

為了研究?jī)煞N磷蝦油在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及生物利用度評(píng)價(jià)，將18只家兔隨機(jī)分成3組，分別單劑量灌服南極磷蝦油（受試制劑T1），太平洋磷蝦油（受試制劑T2），魚油（參比制劑R）。用GC-MS檢測(cè)血漿中EPA，DHA的濃度，采用3p97程序計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果對(duì)EPA而言，參比制劑R與受試制劑T1，T2的峰濃度（Cmax）分別為（190.03± 4.21 μg/mL），（192.79±3.64 μg/mL），（218.35±5.47 μg/mL）；達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為（8.02±0.65）、（12.04±0.31）、（12.10± 0.24）h；藥時(shí)曲線下面積（AUC）分別為（23.32±6.72），（20.43±4.58），（19.23±6.24 mg）h/mL。對(duì)DHA而言，參比制劑R與受試制劑T1，T2的峰濃度（Cmax）分別為（243.50±3.47 μg/mL）、（219.52±2.04 μg/mL）、（233.27±2.87 μg/mL）；達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為（7.04±0.52）、（10.06±0.60）、（7.10±0.29）h；藥時(shí)曲線下面積（AUC）分別為（16.08±4.98）、（23.49±4.84）、（9.70±0.67 mg）h/mL。以魚油做為對(duì)照物，南極磷蝦油中EPA和DHA的相對(duì)生物利用度（F）分別為（83.27±10.21）%、（134.56±20.51）%。太平洋磷蝦油中EPA和DHA的相對(duì)生物利用度（F）分別為（84.73±12.03）%，（49.26±8.79）%。結(jié)論表明與魚油相比，南極磷蝦油顯著提高了DHA的相對(duì)生物利用度。

磷蝦油；GC-MS；藥動(dòng)學(xué)；相對(duì)生物利用度

EPA（二十碳五烯酸），DHA（二十二碳六烯酸）是ω-3類脂肪酸中兩種主要高度不飽和脂肪酸，不僅是高等動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞膜磷脂雙分子層的重要組成成分，同時(shí)對(duì)防治心腦血管疾病的功效已被國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界所公認(rèn)，對(duì)多種自體免疫性疾病的療效也已被證實(shí)［1］。但是這兩種脂肪酸人體無(wú)法自身合成，必須從食物中攝取。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上EPA和DHA保健產(chǎn)品的原料主要來(lái)自深海魚類的魚油［2］，磷蝦油中EPA，DHA含量極高，與在魚油中以甘油三酯或脂肪酸乙酯形式存在有所不同，EPA，DHA在磷蝦油中主要以磷脂的形式存在，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，磷脂形式與甘油三酯形式相比，前者大腦生物利用率更高［3-4］。現(xiàn)在有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)EPA，DHA體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究比較少［5-6］。本試驗(yàn)以家兔為研究對(duì)象，考察了魚油，南極磷蝦油，太平洋磷蝦油用藥后其在家兔體內(nèi)的血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，為進(jìn)一步臨床研究提供參考。

1　儀器與材料

1.1儀器氣質(zhì)聯(lián)用儀:包括Agilent 7890A氣相色譜儀、7683B自動(dòng)進(jìn)樣器和5975C質(zhì)譜檢測(cè)器（安捷倫公司）；氮吹儀（N.EVAP 112）。振蕩器、渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；電子天平（德國(guó)梅特勒公司）；0.45 μm濾膜。

1.2試藥藥物：維妥立牌魚油軟膠囊（每粒1.0 g，含EPA 0.18 g，DHA 0.12 g，廣東仙樂(lè)制藥有限公司）；南極磷蝦油軟膠囊（每粒1.0 g，含EPA 0.15 g，DHA 0.11 g，山東科芮爾生物制品有限公司）；太平洋磷蝦油（每1.0 g，含EPA 0.17 g，DHA 0.15 g）；正己烷（色譜純）美國(guó)Merck公司；甲醇（色譜純）美國(guó)Merck公司；KOH（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EPA，DHA甲酯混合物標(biāo)樣（MIDI公司提供）；用正己烷配置成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置冰箱冷凍保存。

1.3動(dòng)物新西蘭大白兔，雄性，體重2.5～3.0 kg，動(dòng)物和飼料由青島市藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（魯）20140001，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度60%±15%。

2　方法

2.1GC/MS條件［7-8］HP毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm× 0.25 μm）；程序升溫：柱初溫120℃保持1 min，以8℃/min的速度升至160℃，保持2 min，以5℃/min的速度升至200℃，保持5 min，以2℃/min的速度升至220℃，保持35 min。進(jìn)樣口溫度240℃；載氣為高純氦氣，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流，進(jìn)樣量1 μL。GC/MS接口溫度240℃；離子源溫度250℃；電離方式EI源，電離能量70 eV；電子倍增電壓1 400 V；溶劑延遲16 min；掃描質(zhì)量范圍30 amu～400 amu。

2.2給藥與血樣采集家兔18只，適應(yīng)環(huán)境一周后隨即分為3組。給藥前均禁食12 h，灌胃魚油、南極磷蝦油、太平洋磷蝦油，按照正常人服用EPA，DHA的劑量以及實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)中家兔與人用藥量系數(shù)換算，保證最終EPA的量98.53 mg/ kg，DHA的量89.68 mg/kg的劑量灌胃，于給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 h耳緣靜脈取血3.0 mL，4 200 r/min離心10 min，分離血漿于-20℃冰箱中待測(cè)。

2.3血漿中EPA，DHA的測(cè)定

2.3.1樣品處理方法取血漿樣品2 mL，加0.4 mol/L的KOH-CH3OH 2 mL，加入1 mL正己烷，渦旋混合30 s，收集正己烷層部分并用氮?dú)獯蹈?，殘余相中加入一點(diǎn)無(wú)水硫酸鈉去除水分，加5% H2SO4-CH3OH 2 mL，70℃水浴30 min，加1 mL正己烷，渦旋混合30 s，與前面用氮?dú)獯蹈珊蟮臍堄嘞嗷旌显儆玫獨(dú)獯蹈?，? mL正己烷復(fù)溶，微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍配制EPA，DHA對(duì)照品系列溶液，精密量取EPA，DHA標(biāo)準(zhǔn)液適量于離心管中，揮干溶劑，加入1 mL家兔空白血漿，渦旋混勻，配置成每毫升血漿中含250、125、62.5、41.67、31.25、25、20.83 μg EPA的儲(chǔ)備液，配成每毫升血漿中含375、187.5、93.75、62.5、46.87、37.5、31.25 μg DHA的儲(chǔ)備液，按2.3項(xiàng)下操作。以EPA，的峰面積對(duì)應(yīng)其濃度進(jìn)行線性回歸，求得直線回歸方程為Y=0.0213X-0.00111，r=0.998。結(jié)果表明，EPA，DHA在20.83～250μg/ml的線性關(guān)系良好，以DHA的峰面積對(duì)應(yīng)其濃度進(jìn)行線性回歸，求得直線回歸方程為Y=0.0333X-0.0216，r=0.999。DHA在31.25～375 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3.3回收率和精密度EPA制備低、中、高20.83，41.67，250 μg/mL三個(gè)濃度的血漿樣本。按2.3項(xiàng)下操作。計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度。其回收率分別為96.03%，97.21%，98.05%，表明該方法回收率符合要求；其日內(nèi)和日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.8%、1.0%，表明該方法精密度符合要求。DHA制備低、中、高31.25，62.5，375 μg/mL三個(gè)濃度的血漿樣本。按2.3項(xiàng)下操作。計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度。其回收率分別為98.21%，97.35%，99.12%，表明該方法回收率符合要求；其日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為2.5%，1.9%，表明該方法精密度符合要求。

3　結(jié)果

血藥濃度曲線和藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)18只家兔一次性服用受試制劑和參比制劑后不同時(shí)間的血藥濃度曲線見(jiàn)圖1，2，將藥-時(shí)數(shù)據(jù)輸入藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件3P87，采用非房室模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理［9］，確定藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。其中Cmax和Tmax為實(shí)測(cè)值，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，2。

圖1　新西蘭大白兔灌胃2種磷蝦油與魚油后的血藥（EPA）濃度曲線

圖2　新西蘭大白兔灌胃2種磷蝦油與魚油后的血藥（DHA）濃度曲線

4　討論與結(jié)論

4.1國(guó)內(nèi)外關(guān)于EPA，DHA在體內(nèi)吸收情況的實(shí)驗(yàn)，大部分都是長(zhǎng)期服用建立模型后，檢測(cè)血液中EPA，DHA的含量，以及對(duì)患者身體健康狀況的改善［10-14］。EPA可以明顯降低高甘油三酯患者血漿中甘油三酯的含量［10］，甘油三酯與脂肪酸乙酯兩種形式的DHA對(duì)高膽固醇的大鼠的代謝效應(yīng)也存在明顯差異［1］，Kevin C.Makiai等發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期供給南極磷蝦油可以明顯比供給魚油提高肥胖者血漿中EPA和DHA的含量，但是對(duì)二者的提高程度存在顯著差異［3］。

表1　新西蘭大白兔灌胃2種磷蝦油與魚油后的血藥（EPA）主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)構(gòu)

表2　新西蘭大白兔灌胃2種磷蝦油與魚油后的血藥（DHA）主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)構(gòu)

4.2本文檢測(cè)的是短期效應(yīng)，從藥代動(dòng)力學(xué)方面檢測(cè)服用制劑24 h內(nèi)的血藥濃度變化，藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，對(duì)EPA的吸收而言，南極磷蝦油與太平洋磷蝦油藥代參數(shù)AUC與魚油之間無(wú)顯著性差異，即生物利用度無(wú)顯著差異，表明磷脂形式的EPA與普通的甘油三酯形式的EPA在短期內(nèi)對(duì)體內(nèi)的EPA含量影響并無(wú)差異。對(duì)DHA的吸收而言，南極磷蝦油與太平洋磷蝦油藥代參數(shù)AUC與魚油之間存在顯著性差異，顯示南極磷蝦油吸收顯著高于魚油，太平洋磷蝦油吸收顯著低于魚油，推測(cè)原因可能是南極磷蝦極地適冷性甲殼類與普通海域的太平洋磷蝦體內(nèi)其他活性物質(zhì)的差異對(duì)DHA吸收的影響。但磷脂形式的DHA與普通的甘油三酯形式的DHA相比較，短期內(nèi)對(duì)體內(nèi)的DHA含量究竟是提高還是降低，無(wú)法做出判斷，還有待進(jìn)一步研究和探索，這也有利于為進(jìn)一步的人體藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)和保健品臨床用藥的長(zhǎng)期與短期效應(yīng)提供參考。

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S968.22

B

0529-6005（2016）04-0114-03

2014-10-09

孫艷賓（1990-），女，助教，碩士，從事生物化學(xué)與海洋生物活性物質(zhì)研究，E-mail：sunyanbin1990@126.com