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    基于LC-MS的小兒哮喘發(fā)作期痰熱阻肺與非痰熱阻肺證代謝標(biāo)記物研究

    2016-11-14 08:39:36陶嘉磊汪受傳戴啟剛
    世界中醫(yī)藥 2016年9期
    關(guān)鍵詞:肺證熱阻代謝物

    陶嘉磊 汪受傳 田 曼 梁 慧 戴啟剛

    (1 江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室,南京,210023; 2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市兒童醫(yī)院呼吸科,南京,210008)

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    基于LC-MS的小兒哮喘發(fā)作期痰熱阻肺與非痰熱阻肺證代謝標(biāo)記物研究

    陶嘉磊1汪受傳1田曼2梁慧2戴啟剛1

    (1 江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室,南京,210023; 2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市兒童醫(yī)院呼吸科,南京,210008)

    目的:分析小兒支氣管哮喘發(fā)作期痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證尿液代謝譜,探索中醫(yī)不同證候生物學(xué)標(biāo)記物差異。方法:收集24例痰熱阻肺證、20例非痰熱阻肺證患兒尿液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測,運用XCMS Online和MetaboAnalyst分析平臺確定差異性代謝物及代謝通路。結(jié)果:痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證間能夠良好區(qū)分,一系列有機(jī)酸、氨基酸、脂、酮類等差異性代謝物及代謝通路被確定。與痰熱阻肺證相比,非痰熱阻肺證組患兒尿中蛋氨酸、琥珀酸、賴氨酸、肌酸、犬尿氨酸、環(huán)腺苷酸等多種有機(jī)酸、氨基酸,以及多種脂類、酮類化合物含量升高,僅有羥基吲哚乙醛含量降低,主要涉及生物素代謝、色氨酸代謝等5條代謝通路異常。結(jié)論:小兒支氣管哮喘不同證型間存在代謝標(biāo)記物與代謝通路基礎(chǔ),可能是中醫(yī)不同證候區(qū)別的本質(zhì)。

    代謝組學(xué);小兒支氣管哮喘;痰熱阻肺證;中醫(yī)證候?qū)W;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

    支氣管哮喘以反復(fù)發(fā)作性痰鳴喘息、胸悶、呼吸困難或咳嗽為主要表現(xiàn)。由于環(huán)境污染等因素,我國小兒支氣管哮喘發(fā)病呈逐年上升趨勢,2010年,14歲以下兒童的患病率較10年前上升32.70%[1],造成了巨大的家庭和社會負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥防治小兒哮喘歷史悠久,療效明顯,有著完善的理法方藥體系。目前臨床辨證多以南京中醫(yī)藥大學(xué)汪受傳教授主編的《全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十二五”規(guī)劃教材·中醫(yī)兒科學(xué)》為藍(lán)本將小兒哮喘分為發(fā)作期、遷延期與緩解期三期,2012年由中華中醫(yī)藥學(xué)會制定的《中醫(yī)兒科常見病診療指南》將小兒哮喘發(fā)作期分為風(fēng)寒束肺證、痰熱阻肺證、外寒內(nèi)熱證、肺實腎虛證[2]。在實際臨床工作中,哮喘證型的辨別多依據(jù)醫(yī)師的個人經(jīng)驗,尚缺乏明確統(tǒng)一的客觀化、量化指標(biāo),這是制約中醫(yī)藥防治哮喘,走向世界的重要因素。

    自系統(tǒng)生物學(xué)興起以來,以整體為核心的組學(xué)研究逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點,其整體性、動態(tài)性、時相性等特點與中醫(yī)“整體觀念、辨證論治”的思維方式相吻合,為解決中醫(yī)藥建立屬于自己的標(biāo)準(zhǔn)化體系問題提供了契機(jī)[3]。證的物質(zhì)基礎(chǔ)應(yīng)是一組相關(guān)的物質(zhì),這些特殊物質(zhì)群的高低決定著證的發(fā)生發(fā)展,是證動態(tài)變化產(chǎn)生的內(nèi)在原因?;诖x產(chǎn)物研究的代謝組學(xué)技術(shù)正是檢測這一組物質(zhì)群高低、動態(tài)變化的優(yōu)良方法。近年來,國內(nèi)外眾多學(xué)者應(yīng)用各種代謝組學(xué)研究技術(shù),在中醫(yī)證候客觀化研究方面進(jìn)行了有益的探索。早在2005年,Chen MJ等[4]就利用GC/MS技術(shù)研究氫化可的松導(dǎo)致腎陽虛模型動物的代謝情況,發(fā)現(xiàn)腎陽虛模型組的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常組,而用溫陽中藥肉蓯蓉干預(yù)后,模型動物的代謝譜回歸至正常范圍,呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的結(jié)果。本課題采用液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù),以小兒支氣管哮喘為例,探索痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證分型的物質(zhì)基礎(chǔ),試圖揭示基于代謝組學(xué)的小兒哮喘不同中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)。

    1 資料與方法

    1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2014年全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)方案兒童哮喘內(nèi)容[5]、中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2008年修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[6]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)兒科常見病診療指南》[2](2012)發(fā)作期痰熱阻肺證:主癥,氣喘、聲高息涌、喉間哮鳴、咳嗽痰壅、胸悶。兼癥,痰黏、色黃、難咯、鼻塞、流涕黃稠、身熱、面紅唇干、夜臥不安、煩躁不寧、口渴、小便黃赤、大便干、咽紅。舌脈,舌質(zhì)紅;苔薄黃或黃膩;脈浮數(shù)或滑數(shù),指紋紫。具備主癥2項、兼癥至少5項,并參照舌脈。發(fā)作期其他證型歸為非痰熱阻肺證。

    1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):符合支氣管哮喘發(fā)作期診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)發(fā)作期證候診斷標(biāo)準(zhǔn)的6~11歲患兒。排除標(biāo)準(zhǔn):合并心腦血管、肝腎及造血系統(tǒng)等其他原發(fā)疾病及精神、神經(jīng)疾病患兒。伴有呼吸道感染的患兒,有其他肺部疾病患兒,取標(biāo)本前靜脈滴注或口服過激素者。

    1.3一般資料選取2015年3—8月在南京市兒童醫(yī)院哮喘??崎T診、江蘇省中醫(yī)院兒科門診確診為支氣管哮喘發(fā)作期,經(jīng)中醫(yī)辨證為哮喘痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證6~11歲患兒。中醫(yī)辨證均由2名主治及以上職稱醫(yī)師判定。共納入哮喘發(fā)作期痰熱阻肺證24例、非痰熱阻肺證20例,一般情況見表1。組間患兒年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)、身高、體重、塵螨過敏、患兒哮喘病程、是否吸入類固醇治療、肺功能、伴有變應(yīng)性鼻炎、父母患有過敏性疾病方面均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),組間具有可比性。肺功能作為哮喘診斷的重要檢查手段,可以進(jìn)一步了解氣道阻塞的程度,本研究所納入的兒童均處于哮喘發(fā)作期,肺功能異?;純赫急?4.4%,有80.7%患兒伴有過敏性鼻炎,同時有84.8%患兒對螨蟲過敏,與14年GINA方案小兒哮喘內(nèi)容相符[5]。

    表1 哮喘患兒基本情況

    1.4研究方法

    1.4.1主要儀器與試劑UltiMate 3000 RS液相色譜儀(UPLC)Dionex,America;二維線性離子阱高分辨靜電場組合質(zhì)譜儀(LTQ/Orbitrap XL):Thermo Fisher,America;Allegra 64R centrifuge型離心機(jī):Beckman Coulter,America。HPLC級甲醇、乙腈(Merck,Germany);HPLC級甲酸銨、甲酸(ROE,America);N,N-二甲基-L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(sigma-Aldrich,America)。

    1.4.2標(biāo)本收集留取上午8:30—11:00、下午14:30—17:00期間,門診患兒中段隨機(jī)尿約10 mL,保存于-80 ℃冰箱內(nèi),避免反復(fù)凍融。

    1.4.3尿液進(jìn)樣前處理取180 μL尿樣室溫溶解,加入N,N-二甲基-L-苯丙氨酸(160 μg/mL)10 μL作為內(nèi)標(biāo),再加入400 μL甲醇對尿樣進(jìn)行稀釋,振蕩渦旋10 min,17 000 r/min離心10 min,取上清液100 μL進(jìn)樣。

    1.4.4尿樣本液相色譜及質(zhì)譜條件色譜柱Hypersil GOLD aQ柱(型號:2.1 mm×150 mm,3 μm I.D.)。流動相:A為含0.01%甲酸、5 mM甲酸銨水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0—2 min:95%A,5%B;2—4 min:95%~50%A,5%~50%B;4—15 min:50%~10%A,50%~90%B;15—18 min:10%A,90%B;18—20 min:10%~95%A,90%~5%B;20—25 min:95%A,5%B;流速為0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜離子源類型為ESI,正離子模式檢測,噴霧電壓4.5kv,掃描范圍80~1 000m/z。

    1.4.5統(tǒng)計學(xué)方法主要通過XCMS Online分析平臺一次性完成物質(zhì)的分析、鑒別,通過MetaboAnalyst平臺分析差異性代謝通路,XCMS Online平臺數(shù)據(jù)分析相關(guān)參設(shè)置為:polarity:positive,retention time format:minutes,Parameter ID:2 JOBID:10976952;Feature detection,method:centWave,ppm:2.5,peakwidth:5~20,mzdiff:0.01,prefilter peaks:3,prefilter intensity:5 000,noise:1 000;Statistics:Unpaired parametric t-test(Welch t-test),根據(jù)P≤0.05和倍數(shù)變化≥1.5,比對Metlin、HMDB、MassBank、KEGG等代謝物譜庫,自動鑒定差異性內(nèi)源性代謝物。

    2 結(jié)果

    2.1LC-MS分析結(jié)果痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證LC-MS分析總離子流圖(TIC)見圖1。橫軸為保留時間,縱軸為相對峰強(qiáng)度。從圖1可看出組間內(nèi)源性代謝物的差異,非痰熱阻肺證大部分代謝物相對含量高于痰熱阻肺證組。平臺通過計算給出2組共計44個樣本的原始總離子流重疊圖和校正后疊加圖(圖2),從圖上可看出2組樣本的峰時間和離子形態(tài)基一致,系統(tǒng)相對穩(wěn)定。平臺共分析出3062個特征峰,與數(shù)據(jù)庫匹配初篩的可能性代謝物包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、組氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、賴氨酸、亮氨酸等多種氨基酸;鄰氨基苯甲酸、胍基乙酸、氨基丁酸、丁酸、戊酸、酮戊酸、氨基戊酸、肌酸、苯酸、辛酸、尿刊酸、苯丙酮酸、檸檬酸、牛磺酸、棕櫚酸、馬尿酸、硬脂酸、龍膽酸鹽、乙酰乙酸鹽、谷氨酸鹽、戊酸鹽等多種有機(jī)酸鹽;苯乙醇胺、谷氨酰胺、酪胺、甲基組胺、色胺、甲氧酪胺、苯乙胺等多種胺類化合物;木糖、阿拉伯糖、核酮糖、木酮糖、核糖、脫氧核糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、山梨糖、蔗糖等多種糖類,以及尿素、尿苷、丙三醇、琥珀酸半醛、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、多巴胺、次黃嘌呤、卟膽原、肌醇、肉堿等其他多種小分子代謝物。

    2.2代謝輪廓分析平臺根據(jù)P≤0.05和倍數(shù)變化≥1.5,分析處理2組患兒尿3062個特征峰,篩選出1556個差異峰,并自動生成組間的互動云圖(圖3)。互動云圖中每一個圓點經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索比對后生成,都代表一個差異性物質(zhì),其直觀的反應(yīng)了小兒哮喘發(fā)作期不同證型之間的差異。如圖可見,與痰熱阻肺證相比,非痰熱阻肺證大部分代謝物相對含量上調(diào),與總離子流色譜疊加圖一致。通過有監(jiān)督PCA得分圖以及PCA荷載圖(圖4)可見,2組樣本具有明顯的分離趨勢,其代謝表型發(fā)生了變異,痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證組樣本在多維的平面分布圖中有良好區(qū)分。有監(jiān)督PCA荷載圖中每個點代表一個特征性離子峰,依據(jù)其對整體分度貢獻(xiàn)的大小從“0”軸依次向兩邊排列分布,顯示了特征離子峰參數(shù)對方差貢獻(xiàn)率,從圖中可見荷載圖各點位分離趨勢良好。

    圖1 痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證總離子流色譜圖及疊加圖

    圖2 44個樣本的原始總離子流重疊圖和校正后疊加圖

    圖3 痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證患兒尿液代謝物互動云圖

    圖4 痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證有監(jiān)督PCA得分圖以及PCA荷載圖

    系統(tǒng)平臺通過分析、比對,共確定痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證差異性代謝物共計38個。見表2,與痰熱阻肺證組相比,非痰熱阻肺證患兒尿中蛋氨酸、琥珀酸、賴氨酸、肌酸、犬尿氨酸、環(huán)腺苷酸等多種有機(jī)酸、氨基酸,乙酸異丁酯、對羥基氨酯、視黃醇乙酸酯等多種脂類化合物,去氧皮質(zhì)酮、甲氧基雌酮、孕烯醇酮、雄烯二酮、醛固酮等多種酮類化合物含量升高,僅有羥基吲哚乙醛含量降低。

    表2 痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證組38個差異性代謝物

    圖5 痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證組差異代謝通路分析圖

    2.3代謝通路分析使用MetaboAnalyst 3.0將篩選的差異性化合物進(jìn)行代謝通路分析,根據(jù)通路影響值>0.1得到痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證組:A生物素代謝,B賴氨酸降解,C甾類激素生物合成,D硫胺素新陳代謝,E色氨酸代謝共5條相關(guān)的差異性代謝通路,如圖5。

    3 討論

    呼吸系統(tǒng)疾病是目前兒科臨床上就診最多最頻繁的病種,代謝組學(xué)技術(shù)在該領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用,其研究成果將有助于臨床診斷與治療[7]。如Bos等[8]利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測呼出氣中的化合物群,認(rèn)為這種非侵入性的檢測方法對診斷急性呼吸窘迫綜合征顯示出良好的準(zhǔn)確性,值得臨床推廣。哮喘是小兒常見病,代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛運用于哮喘的研究,Chang C[9]等通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)對輕度持續(xù)性哮喘患者的血清進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)輕度持續(xù)性哮喘患者血清代謝物能夠與正常組很好區(qū)分,琥珀酸鹽、肌苷、3,4-二羥基苯甲酸、苯基丙氨酸等表達(dá)明顯增高,提示哮喘患者呈低氧應(yīng)激狀態(tài),并認(rèn)為這些差異性代謝物可以作為臨床哮喘診斷及治療的重要參考指標(biāo)。Michael J等[10]通過LC-MS聯(lián)用技術(shù)對20名哮喘患者血樣進(jìn)行分析,認(rèn)為鞘脂類代謝改變是反映哮喘控制,細(xì)胞對沙丁胺醇反應(yīng)的一個基本特性。

    眾所周知,辨證論治是中醫(yī)學(xué)的主要特色,整個疾病診斷、處方、用藥都是以“證”為核心,它是基礎(chǔ)理論和中醫(yī)臨床連接的橋梁。因此,有關(guān)證候的研究一直是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的一個核心科學(xué)問題。一方面,中醫(yī)辨證論治的理念使得疾病治療過程中重視個體化、時相化,重視整體,這是中醫(yī)療效顯著、不良反應(yīng)少,又富含人文情懷的主要原因;另一方面,由于中醫(yī)注重整體,重視個體化的辨證論治理念使得中醫(yī)很難做到標(biāo)準(zhǔn)化,這又嚴(yán)重限制了中醫(yī)學(xué)臨床客觀化數(shù)據(jù)資料的積累分析,難以將中醫(yī)優(yōu)良的有效方劑進(jìn)行臨床推廣和傳承,難以被遵循循證醫(yī)學(xué)理念的國際社會認(rèn)可。這種矛盾的產(chǎn)生并非是中醫(yī)理論體系的落后,而是目前利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)水平仍然無法準(zhǔn)確詮釋中醫(yī)證候的內(nèi)在本質(zhì),證候是疾病與人這個生命體“綜合作用”反應(yīng)的結(jié)果,包含了疾病與生命體本身兩者的屬性特征,更具有全面性,是先進(jìn)的理論體系?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)越來越注重中醫(yī)的這種整體理念,積極推行個體化治療,以期能夠提高療效,減少不良反應(yīng)[11]。目前,以組學(xué)為主要技術(shù)核心的中醫(yī)證候?qū)W研究是中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化,現(xiàn)代化取得突破的關(guān)鍵點之一。

    本項研究以患兒門診隨機(jī)尿為樣本,臨床隨機(jī)樣本的收集是基于患兒當(dāng)前階段證候判斷后即刻進(jìn)行的,反映的是患兒當(dāng)前狀態(tài),更符合中醫(yī)證候?qū)崟r性這個特點。研究結(jié)果顯示,非痰熱阻肺證患兒尿中的多種有機(jī)酸、氨基酸,多種脂類化合物,多種酮類,以及維生素H、維生素B1等生物素含量升高,僅羥基吲哚乙醛含量降低;生物素代謝,賴氨酸降解,甾類激素生物合成,硫胺素新陳代謝,色氨酸代謝,5條異常代謝通路構(gòu)成了有別于痰熱阻肺證特征性的代謝群。因此,支氣管哮喘發(fā)作期不同證型間存在特征性代謝標(biāo)記物與代謝通路基礎(chǔ)。需要說明的是,中醫(yī)臨床證候?qū)W研究實施有一定的難度,其受藥物干預(yù)、臨床證候復(fù)雜等多種因素干擾;此外,雖然中醫(yī)辨證有診斷標(biāo)準(zhǔn),但醫(yī)者臨診判斷證候類型時不可避免的帶有個人主觀性,如何突破這一瓶頸,仍是一個需要解決的問題,主觀的證候判斷通過組學(xué)技術(shù)的反復(fù)驗證或許是一條有效的解決途徑。

    [1]沙莉,邵明軍,劉傳合,等.2010年與2000年中國城市兒童支氣管哮喘患病率比較[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2015,38(9):664-668.

    [2]中華中醫(yī)藥學(xué)會.中醫(yī)兒科常見病診療指南[S].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2012:22-23.

    [3]陶嘉磊,張宗明,汪受傳.從辯證的視角看中醫(yī)科學(xué)性問題爭論[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué),2015,36(15):85-87.

    [4]Chen M,Zhao L W.Metabonomic Study on the Biochemical Profiles of A Hydrocortisone-Induced Animal Model[J].J Proteome Res,2005,4(6):2391-2396.

    [5]Global Initiative for Asthma.Global strategy for asthma management and prevention[EB/OL].Revised,2014.(Assessed May 2014,at www.ginasthma.org.).

    [6]中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組,《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志,2008,46(10):745-753.

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    (2016-09-09收稿責(zé)任編輯:洪志強(qiáng))

    Biomarkers Research on Different Syndromes of Children with Exacerbated Asthma:A LC-MS-based Metabolomics Analysis

    Tao Jialei1,Wang Shouchuan1,Tian Man2,Liang Hui2,Dai Qigang1

    (1 Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2RespiratoryDepartmentofNanjingChildren′sHospitalaffilliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

    Objective:By analyzing urinary metabolic profiles of heat-phlegm obstructing lung syndrome and non-heat-phlegm obstructing lung syndrome in children with exacerbated asthma to explore potential metabolic biomarkers between different syndromes.Methods:Twenty-four sick children with Heat-phlegm obstructing lung syndrome and twenty sick children with non-heat-phlegm obstructing lung syndrome were enrolled.Urine samples were collected,and urine metabolites profiles were analyzed by LC-MS coupled with a suite of statistical analyses.Results:Clear separations between heat-phlegm obstructing lung syndrome and non-heat-phlegm obstructing lung syndrome existed.Differential metabolites and several metabolic pathways related organic acids,amino acids,fat,ketone compound were identified.Compared with heat-phlegm obstructing lung syndrome group,the levels of organic acids,amino acids,fat,ketone compound were upregulated,such as methionine,succinic acid,lysine,creatine,kynurenine,and cyclic AMP,and only hydroxy indole acetaldehyde were down in urine with non-heat-phlegm obstructing lung syndrome.Furthermore,five abnormal metabolic pathways,such as biotin metabolism,tryptophan metabolism were identified.Conclusion:The basis of metabolic biomarkers and pathways in children with bronchial asthma exists in different syndrome types,which may be the essence of different TCM syndromes.

    Metabolomics; Children with bronchial asthma; Heat-phlegm obstructing lung syndrome;Syndrome of Traditional Chinese Medicine; Liquid chromatography-mass spectrometry

    江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室開放課題(編號:JKLPRD201401)

    戴啟剛(1977.07—),南京中醫(yī)藥大學(xué)副教授,研究方向:小兒肺脾系疾病,E-mail:Qgdai2006@163.com

    R241.6

    A doi:10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.007

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