缺氧環(huán)境下白細(xì)胞介素8通過(guò)Akt-STAT3通路提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬和增殖能力

沈雷，張善強(qiáng)，張曉東，張彧婷，謝立平，姜楊，馬勇，李國(guó)峰

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缺氧環(huán)境下白細(xì)胞介素8通過(guò)Akt-STAT3通路提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬和增殖能力

沈雷，張善強(qiáng)，張曉東，張彧婷，謝立平，姜楊，馬勇，李國(guó)峰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

探討缺氧環(huán)境下，白細(xì)胞介素8 (Interleukin-8, IL-8) 對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC) 增殖和自噬能力的影響以及機(jī)制。在缺氧模型下，未進(jìn)行刺激的hBMSC為缺氧對(duì)照組；以100 μmol/L 人IL-8蛋白刺激的MSC為IL-8組；若先添加50 μmol/L MK2206 (Akt蛋白抑制劑) 培養(yǎng)30 min，然后再添加100 μmol/L IL-8則為Akt抑制劑組，在正常條件下培養(yǎng)的MSC為正常對(duì)照組。利用EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Western blotting或ELISA等實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組MSC細(xì)胞EdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞凋亡、自噬蛋白 (LC-3) 和Akt/STAT3等蛋白的表達(dá)。相對(duì)于缺氧對(duì)照組和Akt抑制劑組，IL-8明顯提高h(yuǎn)BMSC增殖和細(xì)胞自噬，并降低hBMSC的凋亡率，IL-8組hBMSC的Akt、STAT3和VEGF等蛋白表達(dá)增高。結(jié)果表明，缺氧環(huán)境下，IL-8通過(guò)Akt-STAT3通路發(fā)揮對(duì)MSC的保護(hù)作用，對(duì)保護(hù)MSC抗缺血缺氧性損傷，促進(jìn)MSC在再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用具有重要意義。

缺氧，白細(xì)胞介素8，間充質(zhì)干細(xì)胞，自噬，Akt-STAT3通路

研究發(fā)現(xiàn)，由于動(dòng)脈粥樣硬化、血栓等原因?qū)е碌难塥M窄等癥狀，常伴隨著機(jī)體組織的缺血缺氧改變，心、腦、肺等重要器官發(fā)生的缺氧性疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]；缺氧問(wèn)題也是從事高原工作、航天事業(yè)的重要難題[2]。如何迅速糾正組織缺氧狀態(tài)，是各國(guó)醫(yī)學(xué)研究者一直探索的科學(xué)課題。雖然在臨床使用了高壓氧、抗自由基、擴(kuò)血管、增加血容量等糾正缺氧的治療手段，但是大多數(shù)療法都是外因性補(bǔ)救措施，未能徹底糾正缺氧造成的嚴(yán)重?fù)p傷[3]。

人體內(nèi)含有大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等重要的參與血管再生和組織修復(fù)的細(xì)胞，如果激活這些細(xì)胞積極參與抗缺氧損傷，將對(duì)逆轉(zhuǎn)缺氧性傷害具有積極的、持續(xù)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cell，MSC) 具有多分化特性和低免疫性，是組織工程中具有廣泛應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[4]。持續(xù)的缺氧環(huán)境會(huì)對(duì)MSC造成損傷，降低MSC的再生修復(fù)能力[5]，如果提高M(jìn)SC在缺氧環(huán)境的生存能力，將對(duì)利用MSC促進(jìn)缺氧性疾病的損傷修復(fù)具有重要意義。

白細(xì)胞介素-8 (Interleukin -8，IL-8) 又稱為趨化因子-8 (CXCL-8)，是趨化因子家族的重要成員[6]。細(xì)菌等微生物感染導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生大量IL-8等細(xì)胞因子，有利于促進(jìn)局部炎癥灶形成病理性鈣化等結(jié)果[7]。IL-8在腫瘤、炎癥等疾病中也會(huì)大量表達(dá)，具有招募中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞歸巢，促進(jìn)組織增生和血管新生等重要作用[8]。這提示我們，如果在缺氧環(huán)境，應(yīng)用IL-8可能會(huì)發(fā)揮保護(hù)MSC的作用，并對(duì)體內(nèi)MSC等細(xì)胞具有重要的招募作用，對(duì)促進(jìn)缺血缺氧組織的修復(fù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC菌種保存中心。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

胎牛血清 (美國(guó)Gbico公司)，α-MEM培養(yǎng)基 (美國(guó)Hyclone公司)，人IL-8重組蛋白、人VEGF、IL-6蛋白ELISA試劑盒 (均購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，MK2206和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) (均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，EdU試劑盒 (廣州銳博生物公司)，GFP-LC3質(zhì)粒 (Invivogen公司)，X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑和TUENL細(xì)胞凋亡試劑盒 (均購(gòu)自美國(guó)羅氏公司)，小鼠抗人LC-3抗體 (英國(guó)Abcam公司)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (英國(guó)Abcam公司)，β-actin (英國(guó)Abcam公司)，Akt和STAT3活性檢測(cè)試劑盒 (美國(guó)Bio Vision公司)，Emax酶標(biāo)儀 (美國(guó)Molecular Devices公司)，BX50型顯微鏡 (日本OLYMPUS公司)，Nikon A1激光共聚焦顯微鏡 (日本尼康公司)，Calibur流式細(xì)胞儀 (美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

hBMSC用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以5% CO2、92% N2和3% O2混合氣體建立細(xì)胞缺氧模型。在缺氧模型下，未進(jìn)行刺激的hBMSC為缺氧對(duì)照組；以100 μmol/ L IL-8刺激的hBMSC為IL-8組；先添加50 μmol/L 的Akt蛋白抑制劑 (MK2206) 培養(yǎng)30 min，然后再添加100 μmol/L IL-8則為Akt抑制劑組；若在95%空氣和5% CO2的條件下培養(yǎng)hBMSC，則為正常對(duì)照組。

1.3.2 EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

在96孔板內(nèi)培養(yǎng)1×104hBMSC，0.01 mol/ L PBS清洗3次，每孔以150 μL含1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后；按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置，每孔加入100 μL，50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h；4%多聚甲醛固定；0.5% TritonX-100孵育10 min；Apollo?染色反應(yīng)液進(jìn)行染色，DAPI細(xì)胞核復(fù)染，激光共聚焦顯微鏡觀察各組hBMSC中EdU標(biāo)記陽(yáng)性 (紅色) 的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.3 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LC-3等蛋白的表達(dá)情況

按照實(shí)驗(yàn)分組情況，培養(yǎng)各組5×106細(xì)胞，裂解細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min，離心10 min，提取蛋白液，測(cè)定蛋白濃度；取25 μg各組蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳90 min (100 V)；然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜 (300 mA，40 min)；蛋白膜在封閉液中封閉60 min；添加小鼠抗人LC-3抗體 (1∶200)、p-Akt (1∶250)、p-STAT3 (1∶200) 等抗體，再使用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (1∶200)，室溫孵育90 min；洗膜，ECL試劑等步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)，Image-Pro Plus 6.0.1軟件分析各帶吸光度值作定量計(jì)算，β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.3.4 GFP-LC3熒光強(qiáng)度分析

GFP-LC3質(zhì)粒用X-treme GENE HP DNA試劑轉(zhuǎn)染到2×106hBMSC中，按照實(shí)驗(yàn)分組要求，以不同的條件進(jìn)行刺激12 h后，加入20 μmo/L氯喹，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用0.25%胰蛋白酶- EDTA消化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均LC3-GFP熒光強(qiáng)度[9]。

1.3.5 VEGF、IL-6等蛋白的檢測(cè)

培養(yǎng)6×106各組hBMSC，0.01 mol/L PBS清洗，按照實(shí)驗(yàn)分組情況，以含1% 胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞上清液，0.22 μm濾器抽濾，按照VEGF、IL-6等蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

在載玻片上培養(yǎng)3×104經(jīng)DiL標(biāo)記的各組hBMSC，0.01 mol/L PBS清洗，按照實(shí)驗(yàn)分組情況，以含1% 胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性 (綠色) 的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每次試驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以±表示，進(jìn)行檢驗(yàn)或2檢驗(yàn)，<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組hBMSC的增殖情況

相對(duì)于正常對(duì)照組，缺氧對(duì)照組的EdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞明顯降低，二者相比具有顯著差異 (<0.01)。在缺氧條件下，與缺氧對(duì)照組相比較，IL-8組EdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞明顯升高，二者相比具有顯著差異 (<0.01)；與IL-8組相比，Akt抑制劑組EdU陽(yáng)性細(xì)胞則明顯降低，二者相比具有顯著差異 (<0.01)，如圖1所示。

2.2 各組hBMSC的細(xì)胞凋亡情況

缺氧對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組相比明顯升高，二者相比具有顯著差異 (<0.01)。缺氧環(huán)境下，IL-8組TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞凋亡率明顯比缺氧對(duì)照組降低，二者相比具有顯著差異 (<0.01)；與IL-8組相比，Akt抑制劑組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，二者相比具有比較顯著性差異 (<0.01)，如圖2所示。

圖1 IL-8對(duì)缺氧環(huán)境下hBMSC增殖的影響

圖2 IL-8對(duì)缺氧環(huán)境下hBMSC凋亡的影響

2.3 各組hBMSC的細(xì)胞自噬情況

缺氧對(duì)照組的LC-3蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組增加，二者相比具有比較顯著差異 (<0.05)。在缺氧環(huán)境下，與缺氧對(duì)照組相比，IL-8組LC-3蛋白表達(dá)較高，具有比較顯著差異 (<0.01)，而Akt抑制劑組LC-3蛋白的表達(dá)則比IL-8組降低，二者相比具有比較顯著差異 (<0.05)，如圖3A、B所示。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)GFP-LC-3也發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組的LC3的GFP熒光強(qiáng)度增加，二者相比具有顯著差異 (<0.01)。在缺氧環(huán)境下，IL-8組細(xì)胞LC3的GFP熒光強(qiáng)度比缺氧對(duì)照組表達(dá)高，具有比較顯著差異 (<0.01)，而Akt抑制劑組細(xì)胞LC3的GFP熒光強(qiáng)度則比IL-8組降低，二者相比具有比較顯著差異 (<0.01)，如圖3C、D所示。

2.4 各組hBMSC的Akt、STAT3蛋白表達(dá)

缺氧對(duì)照組的Akt、STAT3蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組增加，二者相比具有比較顯著差異 (<0.05)。在缺氧環(huán)境下，與缺氧對(duì)照組相比，IL-8組Akt、STAT3蛋白的相對(duì)密度明顯升高，二者相比均具有顯著差異 (<0.01)；但與IL-8組相比，Akt抑制劑組Akt、STAT3蛋白表達(dá)降低，二者相比具有比較顯著差異 (<0.05)，如圖4所示。

2.5 各組hBMSC上清液中VEGF、IL-6等蛋白表達(dá)

缺氧對(duì)照組的VEGF、IL-6蛋白含量比正常對(duì)照組增高，二者相比具有比較顯著差異(<0.01)。缺氧環(huán)境下，與缺氧對(duì)照組相比，IL-8組MSC細(xì)胞上清液中VEGF、IL-6等蛋白含量明顯升高，均具有顯著性差異 (<0.01)；相對(duì)于IL-8組，Akt抑制劑組VEGF、IL-6表達(dá)顯著降低，均具有顯著性差異 (<0.01)，如表1所示。

圖3 IL-8對(duì)缺氧環(huán)境下hBMSC自噬的影響

圖4 缺氧環(huán)境下IL-8對(duì)hBMSC的Akt、STAT3蛋白表達(dá)的影響

表1 各組hBMSC的VEGF、IL-6含量(pg/mL,±s，n=36)

Table 1 The contents of VEGF, IL-6 of hBMSC in each group (pg/mL,, n=36)

表1 各組hBMSC的VEGF、IL-6含量(pg/mL,±s，n=36)

ItemNormalHypoxia Control groupControl groupIL-8 groupAkt inhibitors group VEGF5.08±0.14*6.32±0.16*, #16.57±0.12#, **12.59±0.24** IL-63.64±0.17△5.15±0.11△, ▲11.78±0.14▲,□7.16±0.13□

*=24.745 1,=0.000 01,#307.5,0.000 01,**=82.063 7,0.001,

△=31.638 9,0.000 01,▲=223.426 7,0.000 1,□=145.093 1,0.000 1.

3 討論

航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常涉及缺氧問(wèn)題，缺氧給宇航員、乘客等乘坐飛行器人員帶來(lái)了嚴(yán)重的問(wèn)題，甚至威脅人員的生命安全。在臨床醫(yī)學(xué)中，由于缺氧而導(dǎo)致的心臟、腦、肺等重要器官發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。由此可見(jiàn)，缺氧及其導(dǎo)致的并發(fā)癥的治療和預(yù)防，不僅是臨床常見(jiàn)疾病的治療手段，也是航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要攻關(guān)課題[2]。如何持續(xù)地改善缺氧癥狀、促進(jìn)器官功能恢復(fù)是治療缺血缺氧性疾病的研究熱點(diǎn)。

人體含有間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等許多細(xì)胞，這些細(xì)胞 (或干細(xì)胞) 在傷口、炎癥等疾病的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。但是由于體內(nèi)缺氧，會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基或活性氧，在活性氧等作用下，細(xì)胞脂質(zhì)會(huì)發(fā)生過(guò)氧化作用，從而使多不飽和脂肪酸分解成丙二醛 (MDA) 等許多細(xì)胞毒性產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞活性降低，影響宿主細(xì)胞功能[10]。如果動(dòng)員人體宿主細(xì)胞積極參與修復(fù)人體組織，將發(fā)揮機(jī)體自身的修復(fù)機(jī)制，并能縮短治療進(jìn)程或費(fèi)用。

間充質(zhì)干細(xì)胞在人體骨髓、臍帶、脂肪等部位大量存在，具有低免疫性、多分化等特性。糖尿病往往導(dǎo)致組織血管發(fā)生嚴(yán)重病變，眼、腦、骨等部位缺血缺氧而發(fā)生糖尿病性眼病、糖尿病性腎病等多種病變。在糖尿病性皮膚潰瘍組織，移植MSC可以很好地分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生而加速皮膚潰瘍的愈合[11]。但是，移植的MSC仍然無(wú)法擺脫缺氧帶來(lái)的損傷，如果提高M(jìn)SC的抗缺氧能力將加大MSC的再生修復(fù)效果。雖然，有的學(xué)者將超氧化物歧化酶、VEGF等抗自由基的基因轉(zhuǎn)染入MSC，對(duì)一些缺氧性疾病的確發(fā)揮了較好的治療效果[12-13]，但是，隨著移植MSC的衰老或死亡，治療效果逐漸降低。對(duì)于種類多樣，數(shù)量龐大的宿主體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等修復(fù)性細(xì)胞，仍然缺乏有效的動(dòng)員作用。因此，我們提出：既保護(hù)MSC抗缺氧損傷，又發(fā)揮招募宿主細(xì)胞歸巢，共同抗缺氧傷害的策略，將對(duì)抗缺氧狀態(tài)，促進(jìn)組織損傷修復(fù)具有重要意義。

在宮頸癌、惡性星形細(xì)胞瘤等腫瘤組織，隨著瘤體迅速增大，腫瘤組織會(huì)出現(xiàn)血管匱乏，發(fā)生缺氧等改變[14]。缺氧刺激HeLa細(xì)胞高表達(dá)白細(xì)胞介素-8(IL-8)，IL-8又稱為趨化因子-8 (Chemokines-8，CXCL-8)，IL-8會(huì)促進(jìn)HeLa細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素 (IL)-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF) 等因子，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞歸巢，加速血管新生而逆轉(zhuǎn)腫瘤組織的缺氧環(huán)境，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-8等因子在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中可以招募MSC、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞歸巢，對(duì)促進(jìn)血管新生的作用具有重要效果[15]。如果在缺氧環(huán)境下，IL-8與MSC細(xì)胞膜上的CXCR1/2 受體相作用[16]，可能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞歸巢，將對(duì)動(dòng)員宿主細(xì)胞參與修復(fù)缺氧性組織損傷，加速血管新生，逆轉(zhuǎn)缺氧性血管病變導(dǎo)致的組織損傷等具有重要意義[16]，但是，在缺氧環(huán)境下CXCL-8對(duì)MSC自噬等影響，尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的凋亡率明顯升高等結(jié)果與Liu等研究類似[17]，說(shuō)明成功建立了細(xì)胞缺氧模型。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-8組MSC上清液中VEGF、IL-6等蛋白表達(dá)增高，而Akt抑制劑組MSC上清液中VEGF、IL-6等蛋白表達(dá)降低。這可能是由于IL-8與MSC表面的CXCR1/2受體結(jié)合[18]，可能通過(guò)PI3K/Akt、JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)MSC分泌VEGF、IL-6等蛋白的緣故。Piperi 等研究也發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤由于瘤組織生長(zhǎng)過(guò)快，血管生長(zhǎng)速度相對(duì)減弱，致使瘤組織出現(xiàn)局部缺氧形象，缺氧促進(jìn)惡性膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CXCL-8，CXCL-8通過(guò)JAK-Akt-STAT3途徑促進(jìn)惡性膠質(zhì)細(xì)胞膜分泌白細(xì)胞介素6 (IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF) 等因子而促進(jìn)血管新生和腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。此外還發(fā)現(xiàn)，IL-8也可以通過(guò)IL-8/CXCR1/2軸，STAT3通路影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性或調(diào)控血管、淋巴管生成[20]，并發(fā)現(xiàn)IL-8尚能夠激活MSC表面的CXCL-8受體 (CXCR1/2)，通過(guò)Akt通路促進(jìn)MSC歸巢或促進(jìn)MSC分泌VEGF等細(xì)胞因子，加速血管新生[21]。結(jié)合這些文獻(xiàn)和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共同佐證了IL-8能夠激活A(yù)kt-Stat3等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)MSC等細(xì)胞旁分泌VEGF、IL-6等細(xì)胞因子。

IL-8促進(jìn)MSC分泌VEGF等細(xì)胞因子導(dǎo)致IL-8組的細(xì)胞增殖數(shù)目較高，TUNEL凋亡標(biāo)記細(xì)胞降低，這是因?yàn)閂EGF具有促進(jìn)MSC等細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞凋亡等相關(guān)[22]。當(dāng)然，細(xì)胞自噬的增多，也為細(xì)胞提供了較多代謝產(chǎn)物或能力，保證細(xì)胞在缺氧等環(huán)境中生存[23]。

MK2206是一種新型高特異性及非ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的Akt變構(gòu)抑制劑，與Akt結(jié)合而發(fā)揮抑制Akt蛋白活化的效果[24]。Akt和Erk等信號(hào)通路之間具有廣泛的聯(lián)系，這些信號(hào)通路之間并不是彼此孤立的，而是互相影響、互相作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性[25]。因此，我們分析僅以MK2206影響Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致Akt蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而IL-8會(huì)激活Erk等其他信號(hào)通路，當(dāng)然具體的機(jī)制還需要深入研究。

在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，IL-8組MSC自噬能力提高。這可能是由于細(xì)胞在缺氧等條件下，細(xì)胞膜內(nèi)折于細(xì)胞漿內(nèi)，而形成類似“脂質(zhì)體”樣的膜性結(jié)構(gòu)的“自噬體”。自噬體與溶酶體融合會(huì)降解內(nèi)部的細(xì)胞器，而使周圍細(xì)胞獲得氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)或ATP等能量，供細(xì)胞重新利用，進(jìn)而保證細(xì)胞群體在高糖或缺氧等惡劣環(huán)境中的存活[26-27]。研究還發(fā)現(xiàn)，Akt-STAT3-mTOR信號(hào)通路在自噬發(fā)生的機(jī)制中具有重要作用[28]。我們發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下，IL-8可以活化Akt-STAT3通路，也可能激活了下游的mTOR蛋白而促進(jìn)MSC自噬的發(fā)生。提高細(xì)胞自噬行為，使MSC獲得較多能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步提高了MSC增殖能力。雖然PI3K/Akt-Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在IL-8作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用，但是我們也不排除IL-8對(duì)MSC的作用尚存在MAPK/Erk等其他分子作用機(jī)制[29]，相關(guān)機(jī)制還有待深入研究。

在皮膚傷口愈合過(guò)程中，巨噬細(xì)胞會(huì)分泌大量IL-8，IL-8對(duì)皮膚缺損區(qū)域周圍的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞等細(xì)胞具有強(qiáng)大捕獲作用，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，加速血管新生，增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積而促進(jìn)傷口愈合，說(shuō)明IL-8在傷口愈合中具有重要意義[6]。如果在抗缺氧性疾病中應(yīng)用IL-8，將對(duì)保護(hù)移植細(xì)胞、促進(jìn)宿主細(xì)胞歸巢和參與修復(fù)組織損傷帶來(lái)機(jī)遇。人體內(nèi)含有成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等眾多細(xì)胞[6]，我們僅探討了IL-8對(duì)MSC增殖和自噬的作用效果，關(guān)于IL-8對(duì)其他宿主細(xì)胞的作用，還需要深入研究。

綜上所述，IL-8通過(guò)Atk/STAT3通路激活細(xì)胞自噬或旁分泌途徑，提高M(jìn)SC增殖，抑制缺氧性MSC損傷。目前利用間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞修復(fù)人體組織損傷具有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值，若從激活宿主細(xì)胞角度入手，發(fā)揮IL-8等趨化因子對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性作用，并招募體內(nèi)細(xì)胞歸巢參與修復(fù)缺氧性疾病，將有利于提高抗缺氧的治療效果。后續(xù)我們將會(huì)利用IL-8轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，用于缺血性心臟病或糖尿病等動(dòng)物模型的治療，觀察IL-8轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺血性疾病的作用效果和機(jī)制，為拓展干細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Enhancing the ability of autophagy and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells by interleukin-8 through Akt-STAT3 pathway in hypoxic environment

Lei Shen, Shanqiang Zhang, Xiaodong Zhang, Yuting Zhang, Liping Xie, Yang Jiang, Yong Ma, and Guofeng Li

,,161006,,

To study the effects and mechanisms of interleukin-8 (IL-8) on the proliferation and autophagy of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSC) under hypoxic condition. In the hypoxia model, we set the non-stimulated hBMSC as the hypoxia control group; the hBMSC stimulated by 100 μmol/L human IL-8 as the IL-8 group; the hBMSC stimulated by 50 μmol/L MK2206 (Akt protein inhibitor) and 100μmol/L IL-8 as the Akt inhibitor group; and the normal cultured hBMSC as the normal control group. The experiments of EdU cell proliferation and TUNEL apoptosis were respectively used to detect the number of positive cells that were labeled by EdU and apoptosis in each group, and Western blotting and ELISA were used respectively to detect the expression of autophagy protein (LC-3), Akt/STAT3 and other proteins in each group. The results indicated that the proliferation and autophagy of hBMSC in IL-8 group was higher than that in hypoxia control group and Akt inhibitor group, and the apoptosis rate in IL-8 group decreased. These results and the high expression of Akt, STAT3 and VEGF protein of IL-8 group show that under the hypoxic condition, IL-8 played a protective role on MSC through the Akt-STAT3 pathway. It had important significance in the protection of MSC against the injury due to ischemia and hypoxia, and promoted the application of MSC in regenerative medicine.

hypoxia, interleukin-8, mesenchymal stem cell, autophagy, akt-STAT3 pathway

January 15, 2016; Accepted: March 4, 2016

Lei Shen. Tel: +86-452-2663205; Fax: +86-452-2663121; E-mail: shenleiby@126.com

時(shí)間：2016-03-28

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160328.1517.001.html

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81541137).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81541137) 資助。