哺乳動物非經典分泌信號肽介導重組EGFP蛋白向畢赤酵母細胞壁轉運

覃玉鳳，陳瑤生，劉志國，張英，劉海龍，何祖勇

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哺乳動物非經典分泌信號肽介導重組EGFP蛋白向畢赤酵母細胞壁轉運

覃玉鳳，陳瑤生，劉志國，張英，劉海龍，何祖勇

中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006

為探索哺乳動物非經典分泌信號肽在畢赤酵母表達系統中引導重組蛋白分泌的作用，本研究將一段來源于小鼠同源異型框蛋白 (En2) 的分泌信號序列 (SS) 融合至EGFP蛋白的N端，在畢赤酵母中表達。實驗結果顯示SS信號肽能通過一種不同于經典的內質網-高爾基體分泌通路的方式將EGFP蛋白分泌至細胞膜表面，與α交配因子前導肽相比，顯著降低了細胞的內質網壓力。本研究提示哺乳動物非經典分泌信號肽可作為遞送重組蛋白至酵母膜表面的一項工具。

內質網壓力，非經典分泌，畢赤酵母，qPCR

嗜甲醇畢赤酵母表達系統作為一種廣泛應用的高效蛋白表達系統，已被證明適用于多種外源重組蛋白的表達[1-3]。畢赤酵母能直接將外源重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中，而且只分泌少量的內源性蛋白，非常有利于后續(xù)的外源重組蛋白的純化。此外，一些胞內過表達的特殊外源蛋白的分泌能降低其對宿主細胞的毒害作用[4-5]。目標蛋白的分泌依賴于分泌信號肽，在畢赤酵母系統中，釀酒酵母交配因子α前導肽是被使用最為廣泛的一種分泌信號肽[6]。該信號肽由19個氨基酸的前端信號序列連接后面包含3個潛在的N端糖基化位點和1個二元的Kex2內肽酶切位點在內的66個氨基酸序列而組成的[2,7]。越來越多的研究表明[8]，α前導肽引導的過表達外源重組蛋白的分泌會引起細胞內質網壓力，尤其是在表達多拷貝外源基因的時候，這種現象更為明顯。Zhu等[9]報道在表達豬胰島素前體時，當整合到酵母基因組的表達載體拷貝數大于12時，蛋白表達量明顯降低，這種現象被認為是由于內質網壓力引起的未折疊蛋白應答效應增強[10]。

大多數的真核細胞蛋白通過經典的內質網-高爾基體分泌途徑進行分泌，但是也有一些胞質和核蛋白因缺少內質網定位信號而通過非經典的分泌途徑分泌到細胞表面[11-12]。Engrailed 同源異型框蛋白就是其中一種核蛋白[13]，該蛋白上一段短肽(AQELSLNESQ) 已被證明具有介導該蛋白通過非經典途徑進行分泌的功能 (以下稱SS信號肽)[14-15]。在我們前期的研究中，與經典分泌信號肽牛β酪蛋白信號肽相比較，SS信號肽能顯著提高重組蛋白在CHO細胞中的分泌表達水平[16]。本研究通過構建SS信號肽融合EGFP蛋白酵母表達載體，以α前導肽作為對照，研究SS信號肽在畢赤酵母中引導外源重組蛋白分泌的效率和對內質網壓力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌 (DH5α)、畢赤酵母表達菌株X33均為本實驗室保存。pEGFP-N1及酵母表達載體pPICZA和pPICZαA均為本實驗室保存。T-A克隆所用的載體為TaKaRa公司的pMD18-T Simple Vector。

1.1.2 試劑

高保真LA酶、定量PCR試劑SYBR Premix ExqPCR均購自TaKaRa公司。核酸檢測用SYBRGreen I、核酸電泳上樣緩沖液購自廣州東盛生物公司。質粒小提中量試劑盒和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技公司。T4 DNA連接酶，Ⅰ、R Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ等限制性內切酶購自NEB公司。Yeast DNA Kit和Yeast RNA Kit均購自OMEGA公司。酵母提取物 (Yeast extract)、胰蛋白胨 (Trypton) 購自OXOID公司。YNB購自廣州翔博生物科技有限公司。蛋白胨 (Peptone) 購自Sigma公司。蛋白預染Marker購自Fermentas公司。PVDF膜購自Bio-Rad公司?？?×His標簽的鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司。HRP標記的羊抗鼠IgG二抗購自廣州優(yōu)寧維公司。含有HRP底物ECL發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo公司。

1.1.3 儀器

垂直電泳儀和電泳槽、轉膜儀、電轉化儀均購自Bio-Rad公司。多功能酶標儀為美國Bio-Tek公司。流式細胞分析儀為美國BD公司。激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆

設計帶有RⅠ、Ⅰ兩個酶切位點的引物，將EGFP序列從pEGFP-N1質粒上擴增。源于家鼠Engrailed2蛋白的SS信號肽序列從NCBI序列文庫中下載，帶有SS信號肽的EGFP基因序列通過設計的SS-EGFP引物經PCR擴增獲得，相關引物序列見表1。PCR擴增反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，38個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。反應產物連接T載體，并轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆并提出質粒，獲得α-EGFP-T和SS-EGFP-T質粒。

1.2.2 酵母表達載體的構建和轉化

通過對重組α-EGFP-T質粒和pPICZαA質粒進行R Ⅰ和Ⅰ的雙酶切反應，膠回收α-EGFP片段和相同酶切的pPICZαA質粒，按照一定比例連接，轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，最終質粒提取獲得pPICZαA-EGFP表達載體。同理，通過R Ⅰ和Ⅰ的雙酶切反應，獲得SS-EGFP片段和相同酶切的pPICZA質粒，經過連接轉化反應以及質粒提取獲得PICZA-SS-EGFP表達載體。載體構建圖譜見 圖1，通過測序確定構建載體的準確性。

用Ⅰ對5?20 μg表達載體進行線性化，之后2 000 V和4.9 ms電轉化至畢赤酵母X33感受態(tài)細胞，并將200 μL菌體懸液涂布于含有Zeocin抗生素的YPDS平板上，將平板置于30 ℃培養(yǎng)，3?10 d左右，直至單個菌落出現。挑取陽性克隆于液體YPD中擴增，分別用Yeast DNA Kit試劑盒提取酵母基因組，用表1中引物進行陽性克隆PCR鑒定。用Yeast RNA Kit提取陽性克隆酵母菌RNA，置于–80 ℃冰箱中保存。

表1 EGFP序列擴增的引物序列

The underlined sequences correspond to theR Ⅰrestriction site in α-EGFP forward, theⅠ site in α-EGFP reverse, and SS sequences in SS-EGFP forward, theⅠsite in SS-EGFP reverse.

1.2.3 陽性克隆酵母的誘導表達

挑取SS-EGFP與α-EGFP陽性轉化菌株各3個，分別置于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的 100 mL搖瓶中，于28–30 ℃、275 r/min培養(yǎng)至600=2?6。室溫下2 000×離心5 min，收集菌體，用BMMY重懸菌體至600=1.0左右，并置于1 L的搖瓶中，用四層紗布封口，放置于28–30 ℃、275 r/min的搖床上繼續(xù)生長。每24 h向培養(yǎng)基中添加過濾過的100%甲醇至終濃度為1%。每隔24 h取一次菌液樣品，取樣量為 1 mL，置于1.5 mL EP管中，并置于–80 ℃保存。取樣時間點為：24、48、72、96和120 h，每次取樣取3批，以用于后期的流式分析、Western blotting等檢測。

1.2.4 蛋白提取

將收集的不同時間點的菌液1 500×離心 5 min，分別收集上清并保存作為胞外蛋白樣品。酵母菌則用PBS漂洗3次，1 500×離心5 min，棄上清，用含有0.1 mol/L K3PO4和1 mol/L山梨醇的酵母等滲緩沖液懸浮細胞，加入 2.5 mg/mL的破壁酶溶液至終濃度1 mg/mL，37 ℃孵育1 h裂解細胞壁，700×離心1 min，分別收集不同時間點的上清和球形原生質體，收集到的上清將用于細胞壁蛋白的檢測。收集到的球形原生質體，用酵母蛋白提取試劑盒提取獲得細胞內蛋白。

1.2.5 蛋白檢測

通過SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍染液檢測不同時間點上清重組EGFP蛋白分泌情況。將收集的不同時間點的上清、細胞壁和細胞內蛋白SDS-PAGE蛋白電泳凝膠在蛋白電轉移緩沖液中浸泡5 min，15 V恒壓電轉移50 min至PDVF膜，用3% BSA封閉過夜，稀釋比為 1∶1 000的6×His一抗孵育2 h，TBST漂洗 3次，稀釋比為1∶3 000的HRP二抗孵育1 h，TBST漂洗3次后ECL顯色和拍照。

另外，收集到的5個時間點的培養(yǎng)基蛋白各吸取100 μL樣品加入96孔色酶標板中，用多功能酶標儀(Bio-Tek公司) 在485 nm/528 nm (激發(fā)光/發(fā)射光) 處檢測。收集到的酵母細胞則用流式分析儀進行分析，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等觀察。

1.2.6 內質網壓力相關因子表達量的定量分析

將前面提取的酵母RNA通過反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA，以基因為內參基因對內質網壓力Marker基因和基因進行qPCR檢測。用羅氏LightCycler 480 qPCR儀上進行實時定量信號檢測，用Roche LightCycler 480分析軟件分析SS-EGFP和α-EGFP酵母轉化子的內質網功能相關因子的表達差異。相關引物序列見表2。

2 結果與分析

2.1 載體表達構建

PCR反應從pEGFP-N1載體上擴增出RⅠ- SS-EGFP-Ⅰ片段和RⅠ-EGFP-Ⅰ片段，并與T載體連接。通過雙酶切反應回收的SS-EGFP片段并直接連接到pPICZA載體上的AOX Ⅰ啟動子后面，構成畢赤酵母X33的載體pPICZA-SS-EGFP，圖1A。而T載體上的RⅠ- EGFP-Ⅰ片段則連接到pPICZαA載體的α信號肽后面，構成pPICZαA-EGFP載體 (圖1B)。測序結果表示，所構建的這兩個載體序列正確無誤。

表2 定量PCR引物序列

2.2 陽性轉化子鑒定

將pPICZαA-EGFP和pPICZA-SS-EGFP表達質粒分別電轉化畢赤酵母X33菌株，待單克隆轉化子長起來后，分別挑取SS-EGFP和α-EGFP單克隆菌落，提取基因組。通過對基因組AOXⅠ基因的PCR來鑒定陽性轉化子 (圖2)。

圖1 pPICZA-SS-EGFP酵母表達質粒 (A) 和pPICZαA-EGFP (B) 酵母表達質粒示意圖

圖2 酵母陽性轉化子基因組PCR鑒定

2.3 胞外蛋白檢測

通過SDS-PAGE (圖3A)、Western blotting (圖3B) 和熒光值檢測(圖3C) 等方法分別對3個α-EGFP轉化子和3個SS-EGFP轉化子誘導表達的培養(yǎng)基分泌蛋白進行檢測。結果顯示，α-EGFP轉化子培養(yǎng)基中含有大量重組EGFP蛋白，且重組EGFP蛋白分泌量隨誘導表達時間增長而不斷累積。而SS-EGFP轉化子培養(yǎng)基中檢測不到重組EGFP蛋白 (圖3)。說明α信號肽引導重組外源蛋白大量分泌至胞外，而SS信號肽則不能引導外源蛋白分泌至胞外。

圖3 通過SDS-PAGE (A)、Western blotting (B) 和熒光值 (C) 等方法對分泌至胞外的EGFP蛋白進行分析

2.4 細胞壁蛋白檢測

通過破壁酶對酵母細胞壁進行酶解獲得細胞壁蛋白。分別對兩種轉化子各3個陽性單克隆誘導表達96 h和120 h的酵母細胞壁酶解產物進行Western blotting檢測，結果發(fā)現SS-EGFP轉化子的細胞壁上都檢測到重組EGFP蛋白的存在，而α-EGFP轉化子細胞壁上沒有檢測到重組蛋白 (圖4)。說明SS信號肽能引導重組EGFP蛋白穿過酵母細胞膜到達細胞壁上，但未穿過細胞壁。

2.5 細胞內蛋白檢測

對去掉細胞壁的酵母細胞中提取的細胞內蛋白進行Western blotting 檢測表明，α-EGFP轉化株的細胞內外源蛋白含量很少，而SS-EGFP轉化株酵母細胞中，由于重組EGFP蛋白不能分泌到細胞外而大量累積在細胞內 (圖5A)。對5個時間點酵母細胞流式分析的結果與Western blot結果一致 (圖5B、5C)。

圖4 Western blotting檢測96 h (A)和120 h (B) 細胞壁上重組EGFP蛋白含量

2.6 顯微觀察

圖6A和6B顯示了在熒光顯微鏡下直接觀察兩種轉化株菌液的結果，進一步證明了α-EGFP轉化株重組EGFP被大量分泌到培養(yǎng)基中，導致其培養(yǎng)基熒光高于SS-EGFP轉化株，但是酵母細胞個體熒光亮度低于SS-EGFP轉化株細胞。

激光共聚焦顯微鏡為能清晰觀察兩種轉化子酵母細胞內的熒光分布，對兩種轉化子細胞采用不同的電壓強度進行觀察。發(fā)現在α-EGFP轉化子細胞中的熒光集中分布在大的熒光斑點中 (圖6C)，這種現象與裂殖酵母中觀察到的現象一致[17]。但是SS-EGFP轉化株細胞中 (圖6D)，熒光均勻分布在細胞質和細胞膜周邊，而非集中在細胞核周邊，說明SS信號肽能在酵母細胞中通過非高爾基體-內質網依賴的蛋白分泌途徑引導外源蛋白分泌。

圖5 Western blotting (A) 檢測和流式分析(B、C)細胞內重組EGFP蛋白含量

圖6 熒光顯微鏡 (A、B) 和激光共聚焦顯微鏡(C、D) 觀察

2.7 內質網壓力相關基因表達檢測

未折疊蛋白應答是由于外源蛋白表達過多而大量累積在內質網上，產生內質網壓力而引起的蛋白錯誤折疊，最終降低蛋白表達的現 象[8-9]。基因編碼蛋白折疊相關的重要分子伴侶，基因編碼二硫化物異構酶，二者被認為是內質網壓力Maker基因。我們前期的實驗表明在酵母基因組中整合一至多個α-EGFP表達質粒，都可以使內質網壓力顯著提高[18]。圖7比較了在酵母基因組整合α-EGFP表達載體和SS-EGFP表達載體后引起的內質網壓力Marker基因表達變化。結果表明整合SS-EGFP轉化子引起的內質網壓力顯著低于α-EGFP轉化子。同時進一步說明SS信號肽介導外源蛋白通過非高爾基體-內質網途徑進行分泌，因而產生較低的內質網壓力。

圖7 定量PCR分析內質網壓力相關基因表達

3 討論

在之前的研究中，SS信號肽通過非高爾基體-內質網分泌途徑介導外源蛋白分泌至哺乳動物細胞表面，與經典的N端分泌信號肽不同，SS信號肽不會被內質網上的蛋白酶所切割[16]。本研究中，SS信號肽介導分泌的細胞內重組EGFP蛋白稍微大于商品化的EGFP蛋白 (圖4和圖5)，可能是由于SS信號肽融合在重組蛋白N端導致的。SS信號肽能在酵母細胞過表達外源蛋白時產生較少的內質網壓力 (圖7)，但是不能引導外源蛋白穿過酵母細胞壁到達培養(yǎng)基中 (圖3)。

據報道SS信號肽能通過胞外體來源的運輸小泡將外源蛋白轉運至哺乳動物細胞外[13,19]。這種現象與在網柄菌屬酵母中非經典分泌的Acb1蛋白相似，Acb1先與自噬體相作用，再融合不斷循環(huán)再生的胞內體，最后與細胞膜融合并釋放到細胞外[19]。與哺乳動物細胞不同，在酵母細胞中，外源蛋白的分泌不僅需要穿過細胞膜還要穿過細胞壁[20-21]。研究認為，外源蛋白通過經典或非經典分泌途徑運輸到細胞膜上后，細胞膜通過出芽形成運輸小泡，這些小泡具有水解細胞壁的酶組分以便形成通道穿過細胞壁[22-24]。在α-EGFP轉化子中EGFP蛋白大量地分泌到了細胞外 (圖3)。但是在α-EGFP轉化子酵母細胞壁酶解產物中并未檢測到重組EGFP蛋白 (圖4)，而SS-EGFP轉化子細胞壁中不僅能檢測到重組EGFP蛋白，且重組EGFP蛋白會隨著誘導表達時間增加而得到累積 (圖6)。表明α-EGFP轉化子酵母細胞中重組EGFP的運輸小泡能十分高效地將EGFP蛋白轉運至胞外，不會明顯地在細胞周質外殘留，相反SS-EGFP轉化子細胞中的運輸小泡被細胞壁阻擋而不能釋放到細胞外 (圖3和圖4)。可能的機制是SS-EGFP轉化子細胞形成的運輸小泡缺失水解酵母細胞壁的酶的組分，也可能是與酵母細胞外表面的某些膜蛋白相似，因缺失經典分泌信號肽，SS-EGFP融合蛋白運輸到細胞質外周后仍然松散地結合在細胞壁上[25]。詳細的機制尚未明確。

總結全文，哺乳動物非經典分泌信號肽可介導外源蛋白分泌到畢赤酵母細胞外周隙中，但不能分泌到培養(yǎng)基中，同時產生較低的內質網壓力。暗示了此信號肽可作為一項用于研究穿過酵母細胞壁必需組分的工具，且可作為遞送重組蛋白至酵母外源蛋白分泌機制膜表面的一種工具。

REFERENCES：

[1] Daly R, Hearn MTW. Expression of heterologous proteins in: a useful experimental tool in protein engineering and production. J Mol Recognit, 2005, 18(2): 119–138.

[2] Damasceno LM, Huang CJ, Batt CA. Protein secretion inand advances in protein production. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(1): 31–39.

[3] Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, et al. Heterologous protein production using theexpression system. Yeast, 2005, 22(4): 249–270.

[4] Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast. FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(1): 45–66.

[5] Gasser B, Prielhofer R, Marx H, et al.: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol, 2013, 8(2): 191–208.

[6] Lin-Cereghino GP, Stark CM, Kim D, et al. The effect of α-mating factor secretion signal mutations on recombinant protein expression in. Gene, 2013, 519(2): 311–317.

[7] Mori A, Hara S, Sugahara T, et al. Signal peptide optimization tool for the secretion of recombinant protein from. J Biosci Bio, 2015, 120(5): 518–525.

[8] Puxbaum V, Mattanovich D, Gasser B. Quo vadis? The challenges of recombinant protein folding and secretion in. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(7): 2925–2938.

[9] Zhu T, Guo M, Tang Z, et al. Efficient generation of multi-copy strains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeast. J Appl Microbiol, 2009, 107(3): 954–963.

[10] Zhu TC, Guo MJ, Zhuang YP, et al. Understanding the effect of foreign gene dosage on the physiology ofby transcriptional analysis of key genes. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89(4): 1127–1135.

[11] Nickel W, Rabouille C. Mechanisms of regulated unconventional protein secretion. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(2): 148–155.

[12] Ding Y, Wang J, Wang JQ, et al. Unconventional protein secretion. Trends Plant Sci, 17(10): 606–615.

[13] Prochiantz A, Joliot A. Can transcription factors function as cell-cell signalling molecules? Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(10): 814–819.

[14] Maizel A, Bensaude O, Prochiantz A, et al. A short region of its homeodomain is necessary for engrailed nuclear export and secretion. Development, 1999, 126(14): 3183–3190.

[15] Joliot A, Trembleau A, Raposo G, et al. Association of Engrailed homeoproteins with vesicles presenting caveolae-like properties. Development, 1997, 124(10): 1865–1875.

[16] He ZY, Sun XZ, Mei G, et al. Nonclassical secretion of human catalase on the surface of CHO cells is more efficient than classical secretion. Cell Biol Int, 2008, 32(4): 367–373.

[17] Kj?rulff S, Jensen MR. Comparison of different signal peptides for secretion of heterologous proteins in fission yeast. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 336(3): 974–982.

[18] Liu HL, Qin YF, Huang YK, et al. Direct evaluation of the effect of gene dosage on secretion of protein from yeast pichia pastoris by expressing EGFP. J Microbiol Biotechnol, 2014, 24(2): 144–151.

[19] Duran JM, Anjard C, Stefan C, et al. Unconventional secretion of Acb1 is mediated by autophagosomes. J Cell Biol, 2010, 188(4): 527–536.

[20] Ahmad M, Hirz M, Pichler H, et al. Protein expression in: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(12): 5301–5317.

[21] Landes N, Maccani A, Leitner C, et al. Cross-species comparison of recombinant protein secretion in CHO cells and. New Biotechnol, 2014, 31(S): S4.

[22] Oliveira DL, Nakayasu ES, Joffe LS, et al. Biogenesis of extracellular vesicles in yeast: many questions with few answers. Commun Integr Biol, 2010, 3(6): 533–535.

[23] Roongsawang N, Puseenam A, Kitikhun S, et al. A novel potential signal peptide sequence and overexpression of ER-resident chaperones enhance heterologous protein secretion in thermotolerant methylotrophic yeast. Appl Biochem Biotechnol, 2015: 1–15.

[24] Hapala I, Gria? P, Nosek J, et al. Yeast membranes and cell wall: from basics to applications. Curr Genet, 2013, 59(4): 167–169.

[25] Nombela C, Gil C, Chaffin WL. Non-conventional protein secretionin yeast. Trends Microbiol, 2006, 14(1): 15–21.

(本文責編 陳宏宇)

Delivery of recombinant enhanced green fluorescent protein tocell wall directed by a mammalian nonclassical secretion signal peptide

Yufeng Qin, Yaosheng Chen, Zhiguo Liu, Ying Zhang, Hailong Liu, and Zuyong He

State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

A mammalian nonclassical secretion sequence derived from mouse Engrailed2 homeoprotein (En2) was used to direct the secretion of the enhanced green fluorescent protein from. This signal peptide conferred the transport of enhanced green fluorescent protein into periplasm through an endoplasmic reticulum-golgi independent pathway, without inducing severe unfolded protein response as compared withα-factor preprosequence. This study implies that this mammalian nonclassical signal peptide could be developed as a useful tool for delivering cargoes to the cell surface of yeast.

ER stress, nonclassical secretion,, qPCR

January 6, 2016; Accepted: March 9, 2016

Zuyong He. Tel/Fax: +86-20-39332940; E-mail: zuyonghe@foxmail.com

Supported by:National Transgenic Major Program (No. 2016ZX08006003-006), Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2016A030313310).

國家轉基因生物新品種培育重大專項 (No. 2016ZX08006003-006)，廣東省自然科學基金 (No. 2016A030313310) 資助。