miR-126在ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)

王　婷，潘旭東，馬愛(ài)軍，吳　梅，肖　星，孫清琳 ，王　蘭

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miR-126在ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)

王婷1，潘旭東1，馬愛(ài)軍1，吳梅2，肖星1，孫清琳3，王蘭2

目的觀察微小RNA(miR)-126及靶基因血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)在載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)，探討miR-126與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)系。方法取8周齡ApoE-/-小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)+普通飲食)、模型組(頸動(dòng)脈套管術(shù)+高脂飲食)各12只。術(shù)后第8周末檢測(cè)血漿中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平，HE染色觀察頸總動(dòng)脈斑塊面積/血管面積，熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)斑塊內(nèi)miR-126、VCAM-1 mRNA水平的表達(dá)，Western blot檢測(cè)VCAM-1蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組血脂水平明顯升高(P<0.05)；模型組的頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積/血管面積明顯大于對(duì)照組(P<0.01)；miR-126表達(dá)水平在模型組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；VCAM-1的mRNA及蛋白的表達(dá)在模型組明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論miR-126在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)下調(diào)可能在斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

動(dòng)脈粥樣硬化；ApoE-/-小鼠；miR-126；VCAM-1

miRNA是一類序列高度保守的非編碼RNAs，可以通過(guò)與mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)特異性結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯或直接導(dǎo)致其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)[1]。近年來(lái)研究表明miRNAs在膽固醇代謝[2]，平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移[3～5]；血管新生[6]及內(nèi)皮細(xì)胞衰老[7]；炎性反應(yīng)[8]、泡沫細(xì)胞的形成[9]等多個(gè)過(guò)程中調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。miR-126是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA[10]，可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化[11]，維持血管的完整性[12]，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。已有研究顯示miR-126可能通過(guò)調(diào)控其靶基因VCAM-1[13]、抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，但miRNA-126在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的變化尚不明確。頸動(dòng)脈粥樣硬化是腦血管病重要的危險(xiǎn)因素，因此本研究旨在觀察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步探討miR-126在頸動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制提供新的線索。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑ApoE-/-小鼠，雄性，8周齡，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[scxk(京)2009-0015]。高脂飼料(0.25%膽固醇+15%脂肪)，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。Trizol mRNA提取液、PCR上下游引物(生工生物工程股份有限公司，上海)。Prime ScriptTM miRNA qPCR Starter Kit Ver.2.0試劑盒(大連TaKaRa公司)。組織裂解液、0.45 μm PVDF膜(Solarbio公司，北京)。VCAM-1單抗(ab174279)(abcam公司，美國(guó))。β-actin、ECL化學(xué)發(fā)光液(博士德公司，武漢)。

1.2研究方法

1.2.1動(dòng)物模型與分組8周齡apoE-/-小鼠24只，飼養(yǎng)于青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、模型組。第1周所有小鼠均給予普通飲食。第2周模型組予以高脂飼料，對(duì)照組繼續(xù)飼以普通飲食。第3周模型組行右頸總動(dòng)脈套管術(shù)，對(duì)照組行右頸總動(dòng)脈假手術(shù)[14]。所有小鼠于術(shù)后8 w處死取材。

1.2.2血脂水平測(cè)定股動(dòng)脈穿刺取血，常規(guī)生化法測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3病理分析右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端、近端及套管處連續(xù)石蠟切片，片厚5 μm，隨機(jī)選取10張做HE染色，使用IPP6.0測(cè)定小鼠頸總動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積(即斑塊處外彈力膜面積)和管腔面積，計(jì)算出斑塊面積，斑塊面積=血管面積-管腔面積，并計(jì)算出斑塊面積與血管面積的比值(PA/LA)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)miR-126、VCAM-1的mRNA表達(dá)取小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，加入TRzol mRNA提取液研磨，提取總RNA，總RNA以分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度,并反轉(zhuǎn)錄。引物序列如下：miR-126(71 bp)：5’CCGGCATTATTACTTTTGGTACG3’；VCAM-1(118 bp)：上游引物5’CCCAAACAGAGGCAGAGTGT3’，下游引物5’AGCAGGTCAGGTTCACAGGA3’；miR-126內(nèi)參U6(TaKaLa試劑盒自帶)；VCAM-1內(nèi)參GAPDH：上游引物5’AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA3’，下游引物5’GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA3’。反應(yīng)條件：miR-126：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 10 s)，退火延伸(60 ℃ 30 s)，共45個(gè)循環(huán)，相同的實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次；VCAM-1：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 10 s)，退火(55 ℃ 20 s)，延伸(72 ℃ 30 s)，共55個(gè)循環(huán)，相同的實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次。反應(yīng)完成后計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析Ct值，采用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)比值。

1.2.5Western blot檢測(cè)VCAM-1的蛋白表達(dá)取小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑研磨，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每組取20 μg樣品，蛋白樣品先80 V電泳30 min，進(jìn)入分離膠，然后120 V電泳1 h至膠下端1 cm左右，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(15 V，45 min)，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2.5 h，加一抗(VCAM-1，1∶2500；β-action，1∶200)室溫下?lián)u晃2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜；用TBST液洗膜10 min×3次；加二抗(VCAM-1,1∶1500；β-action，1∶3500)室溫下?lián)u晃2 h；用TBST液洗膜10 min×3次；在膜上涂0.2 ml ECL發(fā)光液1 min，利用化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行圖像掃描，保存圖像。使用Image J計(jì)算灰度值。

2　結(jié)　果

2.1動(dòng)物體質(zhì)量及血脂水平檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)過(guò)程中兩組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照組血脂水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

2.2頸總動(dòng)脈內(nèi)膜病理學(xué)改變兩組頸總動(dòng)脈內(nèi)膜病理學(xué)改變，對(duì)照組無(wú)明顯斑塊，內(nèi)膜光滑、完整，僅見(jiàn)極少量的泡沫細(xì)胞。模型組小鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)有明顯粥樣斑塊形成，管腔狹窄，內(nèi)膜不規(guī)則增厚，完整性破壞，脂質(zhì)浸潤(rùn)，大量泡沫細(xì)胞形成，平滑肌細(xì)胞增生并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，可見(jiàn)一些壞死物質(zhì)及脂質(zhì)沉積。模型組斑塊面積/血管面積明顯大于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明模型制造成功，有明顯的斑塊形成。

2.3miRNA-126和VCAM-1 mRNA水平的表達(dá)與對(duì)照組相比，模型組miR-126表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，VCAM-1表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中VCAM-1表達(dá)增多可能與miR-126低表達(dá)有關(guān)。

2.4VCAM-1蛋白水平的表達(dá)模型組VCAM-1表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，表明VCAM-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中蛋白水平表達(dá)同樣升高。

表1　各組小鼠體質(zhì)量及血脂變化

與對(duì)照組比*P<0.05

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)選用頸總動(dòng)脈套管及高脂飲食的ApoE/-小鼠，模型組血脂水平明顯增高，小鼠頸總動(dòng)脈套管處形成明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，該模型依賴低剪切力及高脂血癥誘導(dǎo)頸動(dòng)脈套管處近心端快速形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[15]，維持血管壁完整性，不造成中膜硬性損傷及血流中斷，相對(duì)于血管拉傷或結(jié)扎后形成的動(dòng)脈粥樣硬化病變更接近人類病變的推進(jìn)過(guò)程[16]，較廣泛應(yīng)用于研究頸動(dòng)脈粥樣硬化疾病。頸動(dòng)脈粥樣硬化是血管壁的一種慢性炎性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞活化后釋放多種細(xì)胞因子并表達(dá)大量黏附分子，促使單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞并趨化遷移至內(nèi)膜下，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，吞噬低密度脂蛋白膽固醇形成泡沫細(xì)胞，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[17]。目前研究認(rèn)為，黏附分子在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，而VCAM-1是重要的黏附分子之一，其過(guò)表達(dá)是形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟[18]。miR-126是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的內(nèi)源性小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)，近來(lái)，Zernecke等[19]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射miR-126，可以抑制小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變，使主動(dòng)脈粥狀硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的面積減小，表明miR-126與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成有密切關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中miR-126表達(dá)明顯降低，VCAM-1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯增高,表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成可能與miR-126低表達(dá)有關(guān)。已有研究顯示[20]，在大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者的血漿中miR-126的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組。另外，Tian等研究發(fā)現(xiàn)[21],高脂肪喂養(yǎng)所致的動(dòng)脈粥樣硬化兔模型中，miR-126水平明顯降低，而VCAM-1表達(dá)水平明顯升高，這與我們的研究結(jié)果相符合。而且，Harris等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126表達(dá)水平降低時(shí)VCAM-1表達(dá)水平明顯升高，相反，miR-126過(guò)表達(dá)時(shí)，VCAM-1表達(dá)水平明顯降低，表明miR-126能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)VCAM-1表達(dá)，控制血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。因此，我們認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中，miR-126的低表達(dá)可能失去了對(duì)VCAM-1表達(dá)的抑制作用，從而不能抑制炎癥細(xì)胞聚集，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

本研究通過(guò)觀察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)變化，表明miR- 126可能通過(guò)表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致VCAM-1表達(dá)升高，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)了miR-126在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，為臨床中動(dòng)脈粥樣硬化疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。然而miR-126在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制尚未十分明確，需要進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)研究。

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The expression of miRNA-126 in carotid atherosclerotic plaques of ApoE-/-mice

WANGTing,PANXudong,MAAijun,etal.

(DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-126 (miR-126) and the vascular cell-adhesion molecule-1 (VCAM-1) in carotid plaque,and the relationship between miR-126 and atherosclerotic lesion formations in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.MethodTwenty-four male ApoE-/-mice were randomized into two groups:control group (sham-operate+normal diet) and model group (perivascular collar placement+high-cholesterol diet).After eight weeks of operate,all mice were sacrificed.The serum levels of totals of total cholesterol (TC),triglyceride (TG),high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) and low-density lipopoprotein (LDL-C) were measured by enzyme method.Pathological picture analysis was performed to calculate the ratio of area of carotid atherosclerotic plaque to area of vessel lumen.The expression of VCAM-1and miR-126 were measured by RT-PCR,and the expression of VCAM-1 also measured by Western blot.ResultAs compared with control group,the model group associated with a marked increase in TC,TG,LDL-C (P<0.05),and area of carotid atherosclerotic plaque (P<0.01),the expression of miR-126 was significantly decreased in mRNA levels (P<0.01),and the expression of VCAM-1 was significantly increased in mRNA and protein levels (P<0.01).ConclusionThe down-regulation of miR-126 in carotid atherosclerotic plaque may play an important role in the development of atherosclerosis.

Atherosclerosis;ApoE-/-mice;miR-126;VCAM-1

1003-2754(2016)04-0296-03

2016-02-19；

2016-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81571112)

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266100；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心人體顯微結(jié)構(gòu)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266071)

潘旭東，E-mail：drpan022@163.com

R743.1

A