傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中低營養(yǎng)菌株的篩選及產(chǎn)胞外酶特性分析

程雅韻，鄭 琳，李官浩，金 清*（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中低營養(yǎng)菌株的篩選及產(chǎn)胞外酶特性分析

程雅韻，鄭 琳，李官浩，金 清*
（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

為了更好地研究北方地區(qū)傳統(tǒng)黃豆醬中低營養(yǎng)菌株的分布及其功能特性，對采集于不同地區(qū)的黃豆醬樣品進行低營養(yǎng)菌株的篩選、分離及純化，并研究其產(chǎn)胞外酶特性。結果共分離出114 株低營養(yǎng)菌株，其中69 株產(chǎn)纖維素酶，81 株產(chǎn)淀粉酶，112 株產(chǎn)脂肪酶，72 株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，59 株產(chǎn)蛋白酶。通過16S rRNA基因序列分析對產(chǎn)酶活性高的代表菌株進行鑒定，鑒定出5 種類別菌株，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeu）、阿薩爾基亞芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis）。所篩選的產(chǎn)酶活性高的低營養(yǎng)菌株短小芽孢桿菌HS1-4和枯草芽孢桿菌HS5-13耐鹽性高，對環(huán)境的抗耐性強，具有廣闊的應用前景。

黃豆醬；低營養(yǎng)菌株；篩選；產(chǎn)酶特性

黃豆醬別名黃醬，是以黃豆、面粉為主要原料，經(jīng)蒸煮、制曲、發(fā)酵等工藝釀造而成的半流動狀發(fā)酵食品[1]。黃豆醬中含有蛋白質、蛋白黑素、肽類、異黃酮、維生素等大量有益于人體的生理活性物質[2]，具有很高的營養(yǎng)保健功能。長期以來，黃豆醬作為我國傳統(tǒng)調味品，以其適宜的口感、濃郁的香味和誘人的色澤，深受全國各地人民的喜愛[3]。

傳統(tǒng)黃豆醬是經(jīng)過3～4 個月自然發(fā)酵形成的?？諝庵械奈⑸镒匀唤臃N到醬醅中，接入到醬醅中的微生物為了滿足自身生長代謝需要而分泌出大量的酶（如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶）[4]，微生物酶系能夠分解蛋白質、淀粉和脂肪，形成小分子化合物，例如氨基酸、有機酸等，使原料中的成分發(fā)生一系列復雜的生物化學變化[5]。這些化合物賦予了黃豆醬特殊的風味以及豐富的營養(yǎng)，使得黃豆醬具有抗衰老、降低膽固醇、促進營養(yǎng)物質吸收等功能[6]。

低營養(yǎng)菌株是指在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中仍能利用環(huán)境中的有機物質獲得能量供其自身代謝生長的菌株。它具有獨特的生理適應機制，具有營養(yǎng)競爭優(yōu)勢，體內還儲有抗性因子能抵御不良環(huán)境，能長期存在于一種極低的代謝狀態(tài)下[7-9]。因此，應加大對此類菌株的研究，以便將其用應于各種環(huán)境條件下的食品生產(chǎn)中。

目前，關于傳統(tǒng)黃豆醬中低營養(yǎng)菌株的研究仍未見報道。本實驗以采集于北方不同地區(qū)的家庭自制傳統(tǒng)黃豆醬為原料，研究低營養(yǎng)菌株在黃豆醬中的分布及其酶學特性，及其在黃豆醬發(fā)酵與風味形成過程中發(fā)揮的作用，篩選并鑒定出產(chǎn)酶活性高的低營養(yǎng)菌株，為黃豆醬中微生物的深入研究提供理論依據(jù)，同時為更好地應用于食品發(fā)酵工業(yè)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌株與培養(yǎng)基

傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬分別采集于山東省3 種（HS1、HS2、HS5）、吉林省6 種（HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-5、HJ-7、HJ-8）、遼寧省1 種（HL3）、黑龍江省2 種（HH1、HH2）。

完達山脫脂奶粉購于延吉百貨大樓超市。

三丁酸甘油酯、可溶性淀粉、羧甲基纖維素、檸檬酸鐵、七葉苷、NaCl、剛果紅、甘油均為分析純 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘酒 美國Spectrum公司；API 50CHB試劑盒 法國BioMereux公司。

標準菌株枯草芽孢桿菌KACC 10114由韓國農村振興廳提供。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）、R2A培養(yǎng)基（reasoner’s 2A，R2A） 青島高科園海博生物技術有限公司。

R2A培養(yǎng)基：3.2 g R2A液態(tài)培養(yǎng)基溶于1000 mL蒸餾水；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：33 g營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溶于1 000 mL蒸餾水；產(chǎn)纖維素酶鑒別培養(yǎng)基：R2A瓊脂培養(yǎng)基＋0.4 g/100 mL（培養(yǎng)基）羧甲基纖維素；產(chǎn)淀粉酶鑒別培養(yǎng)基：R2A瓊脂培養(yǎng)基＋0.5 g/100 mL（培養(yǎng)基）可溶性淀粉；產(chǎn)蛋白酶鑒別培養(yǎng)基：R2A瓊脂培養(yǎng)基＋1 g/100 mL（培養(yǎng)基）脫脂牛奶；產(chǎn)脂肪酶鑒別培養(yǎng)基：R2A瓊脂培養(yǎng)基＋1 g/100 mL（培養(yǎng)基）三丁酸甘油酯；產(chǎn)β-葡萄糖苷酶鑒別培養(yǎng)基：R2A瓊脂培養(yǎng)基＋0.3 g/100 mL（培養(yǎng)基）七葉苷＋0.02 g/100 mL（培養(yǎng)基）檸檬酸鐵。

1.2 儀器與設備

DNP-9082BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-IFD超凈工作臺 中國上海新苗醫(yī)療器械機械制造有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司。

1.3 方法

1.3.1 低營養(yǎng)菌株的總數(shù)測定、初步篩選和純化

取黃豆醬樣品10 g溶解于90 mL生理鹽水中，即為10－1稀釋度樣液，按10 倍梯度遞增稀釋后均勻涂布于R2A固態(tài)培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，直至長出明顯菌落[10-12]。選擇平均菌落數(shù)在30～300 CFU之間的平皿和稀釋度，低營養(yǎng)菌株總數(shù)按下式計算。

挑選出的單一菌落依次劃線在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并按照樣品來源及稀釋度進行編號，編號后置于培養(yǎng)箱中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.2 產(chǎn)胞外酶菌株的篩選

將篩選出的菌株分別接種到產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶鑒別培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)（48±2） h，觀察接種菌株周圍培養(yǎng)基是否出現(xiàn)相應現(xiàn)象：1）在產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶鑒別培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶菌株周圍出現(xiàn)透明圈；2）產(chǎn)纖維素酶鑒別培養(yǎng)基經(jīng)剛果紅染色30 min后，用1 mL、1 mol/L NaCl溶液清洗，產(chǎn)酶菌株周圍出現(xiàn)透明圈[13]；3）產(chǎn)淀粉酶鑒別培養(yǎng)基經(jīng)碘酒染色30 min后，產(chǎn)酶菌株周圍出現(xiàn)透明圈；4）產(chǎn)β-葡萄糖苷酶選擇培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶菌株周圍出現(xiàn)褐色水解斑。

1.3.3 菌種的鑒定

細菌總DNA的提?。簩a(chǎn)酶活性高的代表菌株接種到5 mL R2A液態(tài)培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，6 000 r/min離心10 min收獲菌體，采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取細菌總DNA，并進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。引物使用：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送于韓國SolGent公司進行序列測定，最后把所得菌株的DNA序列信息輸入美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進行局部序列比對，用基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行分析[13]。

1.3.4 發(fā)酵液粗酶活力的測定

將篩選菌株和標準菌株活化后接種于營養(yǎng)液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖床培養(yǎng)48 h后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液即為粗酶液，粗酶液適當稀釋后用于酶活力的測定。

采用羧甲基纖維素酶活力測定法測定纖維素酶活力，以單位酶量每分鐘水解底物羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為一個酶活力單位[14]。采用3,5-二硝基水楊酸顯色法測定淀粉酶活力，可溶性淀粉為底物，單位酶量30 min 水解釋放1 mg麥芽糖為1 個酶活單位[15]。福林-酚法測定蛋白酶活力，以單位酶量每分鐘水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸為一個酶活力單位[16-17]。脂肪酶活力以橄欖油為底物，以每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為一個酶活力單位[18]。β-葡萄糖苷酶活力以對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，pNPG）為底物，單位酶量每分鐘產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚為一個酶活力單位[19]。

1.3.5 菌株特性的測定

篩選胞外酶活性高的菌株進行菌落、菌體、芽孢特征及細胞色素氧化酶特性分析，并利用API 50CHB試劑盒進行生化鑒定。

1.3.6 菌株耐鹽性的測定

將篩選菌株分別接種在100 mL加0、5、10、20 g氯化鈉的營養(yǎng)液態(tài)培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)64 h，每4 h取樣，在650 nm波長處測定吸光度并繪制生長曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復3 次，并用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬樣品中低營養(yǎng)菌株的總數(shù)

通過對12 個黃豆醬樣品進行低營養(yǎng)菌株總數(shù)測定，其計數(shù)結果如表1所示。采集的12種傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中均有低營養(yǎng)菌株的分布，且數(shù)量均在105以上，可知黃豆醬樣品中的大量微生物能夠在低營養(yǎng)條件下廣泛分布和生長。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬樣品中低營養(yǎng)菌株總數(shù)Table 1 Microbial counts of oligotrophic strains in traditional fermented soybean paste

2.2 產(chǎn)胞外酶菌株的篩選

從12 個傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中利用R2A培養(yǎng)基根據(jù)菌落和形態(tài)特征分離了114 株低營養(yǎng)菌株，利用鑒別培養(yǎng)基進一步分析了產(chǎn)胞外酶的特性，具有產(chǎn)胞外酶廣譜性且活性較高菌株的產(chǎn)酶特性結果如表2所示。

表2 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離低營養(yǎng)菌株的產(chǎn)胞外酶特性Table 2 Extracellular enzymatic activities of oligotrophic strains isolated from traditional fermented soybean paste

從黃豆醬樣本中篩選出的114 株低營養(yǎng)菌株中共有69 株菌株產(chǎn)纖維素酶，其中HH2、HS2、HJ1、HH1、HS5、HJ7、HS1樣品中菌株產(chǎn)生的纖維素酶含量較高；81 株產(chǎn)淀粉酶，59 株產(chǎn)蛋白酶，112 株菌株產(chǎn)脂肪酶，72 株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，且產(chǎn)酶狀況良好。

傳統(tǒng)醬類發(fā)酵過程中微生物分泌多種胞外酶如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶等。纖維素酶可以水解纖維素，使細胞壁破裂[20]，利于其他酶類能進一步水解底物，提高細胞內含物（如蛋白質、淀粉、油脂及糖等）的提取率，加快發(fā)酵速度，改善食品質量，簡化生產(chǎn)工藝[21]。富含此類菌株的豆醬具有消除抗營養(yǎng)因子，促進生物健康生長的作用。淀粉酶在豆醬發(fā)酵成熟的過程中可以降解原料中的淀粉，提高淀粉的利用率，改變總糖和還原糖含量，改善黃豆醬的色澤，提高醬的風味[22]；蛋白酶可以催化蛋白質水解產(chǎn)生主要呈味物質——游離氨基酸，更利于人體吸收，減少大豆蛋白水解過程中苦味肽、苦味氨基酸的生成，改善豆醬的風味[23]；脂肪酶在發(fā)酵過程中作用于脂肪中的酯鍵，將脂肪分解成脂肪酸和甘油以及幫助形成醬色的多酚氧化酶，改善了黃豆醬的風味又提高了營養(yǎng)價值[24]。黃豆醬的主要成分大豆中脂肪含量約占25%，脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生對人體有益的亞油酸等必需脂肪酸，既降低膽固醇又具有保健功能；β-葡萄糖苷酶將黃豆醬中異黃酮轉化為更容易消化吸收的苷元，提高吸收率，改善風味和保健功能[25]。

本實驗中，從傳統(tǒng)黃豆醬中篩選出的低營養(yǎng)菌株具有良好的產(chǎn)胞外酶特性，這些菌株及所分泌的胞外酶復合作用使黃豆醬在發(fā)酵過程中分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂肪和異黃酮，提高糖、游離氨基酸、必需氨基酸和功能性苷元的含量，改善豆醬的色澤、風味和質量，同時提高營養(yǎng)價值和功能性。對篩選的產(chǎn)酶活性較高的代表性菌株在發(fā)酵條件、酶學特性等方面進行深入研究，可充分開發(fā)其利用價值，以應用到黃豆醬發(fā)酵及其他食品工業(yè)中。

2.3 菌種的鑒定

綜合代表菌株的產(chǎn)酶特性，對產(chǎn)酶活性高的代表菌株進行了16S rRNA序列鑒定。表3結果顯示，代表菌株被鑒定為5 種，大部分為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其余為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、阿薩爾基亞芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis），其中絕大部分為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），且同源性較高。

表3 16S rRNA序列同源性分析結果Table 3 Results of 16S rRNA sequence homology analysis

續(xù)表3

2.4 產(chǎn)胞外酶優(yōu)良菌株酶學特性分析

產(chǎn)胞外酶菌株中短小芽孢桿菌HS1-4和枯草芽孢桿菌HS5-13菌株產(chǎn)酶特性比其他菌株優(yōu)良，將HS1-4和HS5-13菌株和標準菌株枯草芽孢桿菌KACC 10114分別接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h后離心、收集上清液分別測定了胞外酶的活性，結果如表4所示。菌株HS1-4和HS5-13的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和β-葡萄糖苷酶活性均高于標準菌株枯草芽孢桿菌KACC 10114，進一步驗證了篩選菌株優(yōu)良的產(chǎn)胞外酶特性。

表4 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離出的菌株HS1-4 和 HS5-13的產(chǎn)胞外酶活力Table 4 Extracellular enzyme activity of HS1-4 and HS5-13 isolated from traditional fermented soybean paste U/mL

2.5 產(chǎn)胞外酶優(yōu)良菌株生化特性分析

將產(chǎn)胞外酶菌株中短小芽孢桿菌HS1-4和枯草芽孢桿菌HS5-13分別接種在NA平板上觀察了菌落形狀，用顯微鏡觀察了細胞形狀及芽孢特征，分析了氧化酶特性。菌株HS1-4和HS5-13在NA平板上長出的菌落均為白色、平坦、邊緣不整齊、表面有褶皺和無光澤，革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，芽孢中生，細胞色素氧化酶陽性。利用API 50CHB試劑盒進行生化特性分析，結果如表5所示。API 50 CH鑒定結果表明，在供試的49 種碳源中，短小芽孢桿菌HS1-4能夠利用甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡糖胺、熊果苷、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、七葉靈、海藻糖、蔗糖、棉子糖、龍膽二糖、肝糖、D-來蘇糖、D-塔格糖、葡萄糖酸鹽，枯草芽孢桿菌HS5-13能夠利用甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、七葉靈、海藻糖、蔗糖、肝糖、淀粉、D-棉子糖、木糖醇、β-龍膽二糖。

表5 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離出的菌株HS1-4和HS5-13的生化特性Table 5 Biochemical characteristics of HS1-4 and HS5-13 isolated from traditional fermented soybean paste

2.6 產(chǎn)胞外酶優(yōu)良菌株耐鹽性分析

為了更好地應用于傳統(tǒng)黃豆醬發(fā)酵劑，對HS1-4和HS5-13菌株的耐鹽性進行了分析，結果如圖1所示。低濃度的Na＋和Cl－可以促進微生物生長，2 株菌株在培養(yǎng)12 h后進入對數(shù)期，48 h后生長穩(wěn)定，在鹽含量為5%時生長良好，2 株菌株均可以利用于醬類發(fā)酵劑。

圖1 鹽含量對傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離菌株HS1-4和HS5-13生長的影響Fig. 1 Effect of salt concentration on the growth of HS1-4 and HS5-13 isolated from traditional fermented soybean paste

3 結 論

本實驗主要運用平板稀釋法，通過初步篩選純化，從東北三省和山東地區(qū)共12 種傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離出114 株低營養(yǎng)菌株。通過對產(chǎn)酶特性分析發(fā)現(xiàn)，69 株產(chǎn)纖維素酶、81 株產(chǎn)淀粉酶、112 株產(chǎn)脂肪酶、72 株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、59 株產(chǎn)蛋白酶。通過16S rRNA基因序列分析對產(chǎn)胞外酶菌株進行鑒定，鑒定出5 種類別低營養(yǎng)菌株，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、高低芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、阿薩爾基亞芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis），菌株表現(xiàn)出較高的同源性。對產(chǎn)酶特性良好的HS1-4和HS5-13菌株進行了形態(tài)學和生化特性鑒定，結果表明2 種菌株均表現(xiàn)出芽孢桿菌典型特征，且在5 g/100 mL鹽含量下生長良好。因此，菌株HS1-4和HS5-13可以應用于傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬發(fā)酵劑，提高產(chǎn)品的風味和質量。

[1] 陳方博. 傳統(tǒng)豆醬中蛋白酶和淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育[D]. 哈爾濱:黑龍江大學, 2010: 1-2. DOI:10.7666/d.y1695925.

[2] 范俊峰, 李里特, 張艷艷, 等. 傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品的生理功能[J]. 食品科學, 2005, 26(1): 250-254. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2005.01.059.

[3] 孫常雁. 自然發(fā)酵黃豆醬中主要微生物酶系的形成及作用[D]. 哈爾濱: 東北農業(yè)大學, 2007: 3-13. DOI:10.7666/d.y1165406.

[4] 武俊瑞. 東北傳統(tǒng)發(fā)酵特色食品中主要微生物多樣性研究[D]. 沈陽: 沈陽農業(yè)大學, 2013: 8-9.

[5] 索化夷, 趙欣, 騫宇, 等. 永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中微生物總量與區(qū)系變化規(guī)律[J]. 食品科學, 2015, 36(19): 124-131. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201519022.

[6] 馬艷莉, 李里特. 發(fā)酵豆制品釀造過程中組分和營養(yǎng)功能因子的變化及調控[J]. 食品科學, 2012, 33(3): 292-299. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7848.2011.09.009.

[7] 楊菌, 楊淑霞, 鄒強, 等. 1株具有低營養(yǎng)抗逆特性的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離和鑒定[J]. 成都醫(yī)學院學報, 2012, 7(2): 181-183. DOI:10.3969/j.issn.1674-2257.2012.02.008.

[8] 夏輝. 凈水貧營養(yǎng)細菌的篩選及其低營養(yǎng)特性的研究[D]. 武漢: 華中農業(yè)大學, 2006: 3-9. DOI:10.7666/d.y1004492.

[9] 夏輝, 梁運祥. 1株凈水貧營養(yǎng)細菌的篩選及其低營養(yǎng)特性的初步研究[J]. 華中農業(yè)大學學報, 2006, 25(5): 530-534. DOI:10.3321/ j.issn:1000-2421.2006.05.017.

[10] 柴洋洋, 葛箐萍, 宋剛, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中酵母菌的分離、篩選及功能酵母的鑒定[J]. 中國食品學報, 2013, 13(3): 183-188.

[11] KATAOKA S. Functional effects of Japanese style fermented soy sauce and its components[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100(3): 227-234. DOI:10.1263/jbb.100.227.

[12] LEE S, KIM J, BAEK S, et al. Isolation and characterization of oligotrophic strains with high enzyme activity from buckwheat sokseongjang[J]. Korean Journal of Food Science and Technology, 2011, 43(6): 735-741.

[13] CHEN Y S, YANAG IDA F, SHNOHARA T. Isolation and identification of lactic acid bacteria from soil using an enrichment procedure[J]. Letters in Applied Microbiology, 2005, 40(2): 195-200. DOI:10.1111/j.1472-765X.2005.01653.x.

[14] 劉湧濤. 枯草芽孢桿菌對中草藥有效成分提取的研究[D]. 長春: 吉林大學, 2015: 17-21.

[15] 楊慧, 王振華, 潘康成. 芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2007(2): 90-93. DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2007.02.066.

[16] GB/T 23527—2009 蛋白酶制劑[S].

[17] 楊旭, 屈小玄, 郭慶賀, 等. 牛奶中蛋白酶活力測定的方法比較[J]. 中國乳品工業(yè), 2014, 42(6): 48-51. DOI:10.3969/ j.issn.1001-2230.2014.06.013.

[18] 夏宇, 周文化, 鄧學良, 等. 脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學學報, 2013, 33(9): 116-120. DOI:10.14067/ j.cnki.1673-923x.2013.09.003.

[19] 陳梅. 斜臥青霉β-葡萄糖苷酶的性質和功能研究及基因表達譜分析[D].濟南: 山東大學, 2013: 29-30.

[20] 石偉. 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其在青貯飼料中的應用研究[D].西安: 西北大學, 2008: 25-26. DOI:10.7666/d.y1252815.

[21] LYND L R, WEIMER P J, van ZYL W H, et al. Microbial celluloseutilization: fundamentals and biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Review, 2002, 66(3): 506-577. DOI:10.1128/ MMBR.66.3.506-577.2002.

[22] 楊海泉, 劉龍, 李江華, 等. 堿性淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其應用研究進展[J]. 生物工程學報, 2012, 28(4): 432-439. DOI:10.13345/ j.cjb.2012.04.001.

[23] 江信紅. 黃鱔蛋白酶分離純化、性質與應用研究[D]. 重慶: 西南師范大學, 2005: 773-776.

[24] 黃璜, 李宗軍, 王遠亮, 等. 各類微生物脂肪酶酶學性質及應用的研究進展[J]. 糧油食品科技, 2014, 22(1): 109-118. DOI:10.3969/ j.issn.1007-7561.2014.01.026.

[25] KUDANGA T, MWENJIE E. Extracellular cellulase production by tropical isolates of Aureobasidium pullulans[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2005, 51(9): 773-776. DOI:10.1007/s10517-008-0273-5.

Isolation of Oligotrophic Strains in Traditional Fermented Soybean Paste and Analysis of Their Extracellular Enzyme-Producing Characteristics

CHENG Yayun, ZHENG Lin, LI Guanhao, JIN Qing*
(College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

Soybean paste is a Chinese traditional fermented food. Naturally fermented soybean paste contains rich microbial communities. In the present study, we isolated and purified bacterial strains from soybean paste samples collected from various regions to investigate the distribution and functional properties of oligotrophic strains in the traditional fermented soybean paste, and studied their extracellular enzyme-producing characteristics. Totally 114 oligAotrophic strains were obtained. Among them, 69 strains produced cellulase, 81 strains produced amylase, 112 strains produced lipase, 72 strains produced β-glucosidase, and 59 strains produced protease. We further identifi ed the representative strains highly active in producing enzymes through 16s ribosomal RNA gene sequencing. The identified five strains were Bacillus atrophaeus, Bacillus altitudinis, Bacillus axarquiensis, Bacillus pumilus and Bacillus subtilis, respectively. Among these, Bacillus pumilus HS1-4 and Bacillus subtilis HS5-13 had high salt tolerance and environment resistance, thereby having potential wide applications in the future.

soybean paste; oligotrophic strains; isolation; enzyme-producing characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201611017

TS 201.3

A

1002-6630（2016）11-0097-06

程雅韻, 鄭琳, 李官浩, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中低營養(yǎng)菌株的篩選及產(chǎn)胞外酶特性分析[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 97-102. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611017. http://www.spkx.net.cn

CHENG Yayun, ZHENG Lin, LI Guanhao, et al. Isolation of oligotrophic strains in traditional fermented soybean paste and analysis of their extracellular enzyme-producing characteristics[J]. Food Science, 2016, 37(11): 97-102. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611017. http://www.spkx.net.cn

2015-12-19

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目 （31260362）；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字[2015第40號]）

程雅韻（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：1748731183@qq.com

*通信作者：金清（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：jinqing@ybu.edu.cn