ESM-1乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

顏蘊(yùn)文，徐曉軍，陳 櫻，張素梅，汪 淵，張敬杰

ESM-1乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

顏蘊(yùn)文1，徐曉軍1，陳 櫻1，張素梅2，汪 淵2，張敬杰1

目的 研究內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（ESM-1）作為敏感的分子標(biāo)志物對乳腺癌預(yù)后的預(yù)測及復(fù)發(fā)的判斷。方法

乳腺癌；分子標(biāo)志物；內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子；預(yù)后

近些年來隨著人們生活水平的提高，乳腺癌目前已經(jīng)成為了女性最為常見的惡性腫瘤，多年來醫(yī)學(xué)科研工作者一直致力于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者在長期隨訪過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，預(yù)測患者的長期預(yù)后的分子標(biāo)志物，其中包括內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1），1996年克隆于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫，由法國巴士德研究所Lassalle et al［1-2］發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白質(zhì)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，因此被稱為ESM-1。既往利用組織芯片的方法大規(guī)模地檢測ESM-1的表達(dá)，研究［3-5］顯示ESM-1在許多類型的惡性腫瘤中都呈過表達(dá)，例如乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、腎癌和惡性淋巴瘤等，并且表達(dá)水平和疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。該研究檢測133例乳腺癌患者癌組織和癌旁組織ESM-1的表達(dá)，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 該實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)回顧性分析，入組患者均來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科住院患者。共計(jì)133例。年齡29～68歲，中位年齡45歲。這些患者在2009年7月～2014年7月入住我科并接受乳腺癌根治性手術(shù)治療，包括改良根治、保乳或者再造手術(shù)。這些患者在術(shù)前均未接受過新輔助化療。所有的患者經(jīng)病理證實(shí)為浸潤性導(dǎo)管癌或?qū)Ч軆?nèi)癌。良性對照取自10例良性乳腺疾病患者正常腺體組織，且組織取材于良性腫瘤患者，取材和病灶之間間隔1 cm。

1.2 切片準(zhǔn)備 乳腺癌癌標(biāo)本來源于2009年7月～2014年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的乳腺癌患者，同時取手術(shù)切除的切緣正常乳腺組織作為對照。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定后石蠟包埋，Leica切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片于均勻涂布了多聚賴氨酸的載玻片上，切片厚度約4 μm，將切片放入45℃漂烘儀內(nèi)進(jìn)行展片，待蠟片展平后進(jìn)行裱片，然后將切片放置于60℃溫箱3～5 h，使切片牢固粘貼于載玻片上，室溫保存待檢。

1.3 試驗(yàn)方法及流程 免疫組織化學(xué)染色法檢測乳腺癌組織和正常乳腺組織中ESM-1蛋白的表達(dá)。石蠟切片放在80℃溫箱中烤片（過夜），趁熱入二甲苯Ⅰ浸泡10～15 min后置入二甲苯Ⅱ再次浸泡10～15 min，撈出切片置入無水乙醇（1～2 min）后再次浸入95%酒精（1～2 min）。將切片置于自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，小心置入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸10 min修復(fù)抗原。玻片冷卻后用PBS（pH 7.4）洗3遍，每次5 min，將玻片邊上小心擦干后置入3%H2O2室溫孵育10 min，取出再次PBS洗3遍，每次5 min，用于去多余的血清。在切片上加鼠抗人ESM-1單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。第2天取出玻片在37℃溫箱中復(fù)溫15～30 min，PBS洗3遍，每次5 min，加通用二抗，37℃孵育15 min，后再次PBS洗3遍，每次5 min，玻片上加HRP標(biāo)記的鏈親和素，37℃孵育15 min后PBS洗3遍，每次5 min，取適量DAB顯色液滴加到切片上，顯色10～15 min，顯微鏡下觀察著色情況，以控制顯色時間，后使用自來水沖洗，蘇木精復(fù)染20～60 s，迅速取出置于自來水沖洗并放于自來水中返藍(lán)5 min，用95%酒精10 min、100%酒精10 min脫水，二甲苯Ⅱ（透明），二甲苯Ⅰ（時間不定，鏡下觀察），最后看準(zhǔn)標(biāo)本位置在切片上滴加適量的中性樹脂，蓋上蓋玻片封片（不要有氣泡）。

1.4 結(jié)果判讀 免疫組化結(jié)果使用NikonE800顯微鏡拍照觀察。陰性對照組用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。結(jié)果判斷：由兩位高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲獨(dú)立讀片。陽性信號為棕褐色顆粒，用圖像分析系統(tǒng)采集顯微鏡下圖像。以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色～棕黃色染色顆粒為陽性。以半定量方法進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度分級：（-）～（+）分為無表達(dá)；（┼┼）～（┼┼┼）為弱表達(dá)～陽性表達(dá)。

1.5 隨訪 隨訪區(qū)間是從患者治療結(jié)束后開始直至患者死亡。因?yàn)榉羌膊∫蛩匾鸬乃劳?，不納入研究范圍。隨訪時間為20～84個月，中位隨訪時間為46個月。隨訪采用電話隨訪方式，隨訪率達(dá)91%（121/133）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)比較分類數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESM-1在不同乳腺病變的表達(dá)情況 ESM-1

蛋白在乳腺癌組織的癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，主要定位于癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，少量定位于細(xì)胞核。陽性顯影為棕黃色沉積。ESM-1強(qiáng)陽性表達(dá)可見于正常乳腺的上皮，在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的表達(dá)稍弱，在浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)最弱。見圖1。

圖1 ESM-1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況

2.2 入組患者隨訪結(jié)果 133例患者中，121例有效隨訪，這些患者1、3、5年的生存率分別為93%、87%、82%。這些患者也被分為ESM-1高表達(dá)組和不表達(dá)組。在高表達(dá)組中患者的1、3、5年生存率分別是100%、93%、88%。這組數(shù)據(jù)也說明了ESM-1的表達(dá)往往預(yù)示著患者有好的預(yù)后，可望成為一個新的分子標(biāo)志物用于預(yù)測乳腺癌患者的生存。ESM-1低表達(dá)則往往預(yù)示著患者腫瘤的生物學(xué)行為差，對生存有著潛在的不良影響。見圖2。

圖2 患者生存率變化曲線

2.3 ESM-1的表達(dá)與臨床常用腫瘤評價指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)果顯示ESM-1的表達(dá)和乳腺癌的一些臨床常用評價腫瘤的高危因素指標(biāo)有相關(guān)性，腫瘤?＜2 cm組、2～5 cm組及＞5 cm組間兩兩比較結(jié)果顯示，?＜2 cm者ESM-1高表達(dá)率高于腫瘤?2～5 cm者，且高于?＞5 cm組，僅有趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，人類表皮生長因子受體2（HER-2）高表達(dá)患者與低表達(dá)患者組間ESM-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有4例患者受體狀況不祥，癌組織雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）陰性者ESM-1蛋白高表達(dá)率較ER及PR陽性者有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其數(shù)目的增加，ESM-1蛋白高表達(dá)率呈下降趨勢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著組織學(xué)分級的增高，ESM-1蛋白高表達(dá)率有降低趨勢，但差異僅有趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。見表1。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年增高，目前已占女性惡性腫瘤第一位，早期診斷的乳腺癌患者大部分都接受手術(shù)治療，但是仍然有相當(dāng)一部分患者會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。怎樣在早期利用分子標(biāo)志物的檢測去篩出這一部分有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向的患者，從而早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行治療干預(yù)，是乳腺癌治療中一個重要課題。既往研究［3，5］已經(jīng)證實(shí)ESM-1在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性，本研究對133例乳腺癌患者的標(biāo)本進(jìn)行了ESM-1的檢測，顯示ESM-1的表達(dá)與多種乳腺癌相關(guān)臨床指標(biāo)有相關(guān)性，特別是反應(yīng)腫瘤負(fù)荷的指標(biāo)如腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目等，對于腫瘤侵襲性指標(biāo)如HER-2的表達(dá)亦有明顯相關(guān)。入組患者中位隨訪46個月，最短20個月，最長84個月。ESM-1高表達(dá)患者生存率較總?cè)巳好黠@提高，這就表明了ESM-1低表達(dá)患者或許在隨訪過程中可以制定更嚴(yán)密的隨訪方案，通過增加隨訪頻率或者檢查項(xiàng)目早期發(fā)現(xiàn)可疑轉(zhuǎn)移，從而提高患者總生存期及無病生存期。

表1 ESM-1在乳腺癌組織中的表達(dá)（n）

ESM-1表達(dá)調(diào)控受很多因素的影響，ESM-1合成和分泌受炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1）［2］和血管內(nèi)皮生成因子（如VEGF）［6-7］的調(diào)節(jié)，在腎癌中，ESM-1表達(dá)和VEGF表達(dá)水平相關(guān)［8］，VEGF誘導(dǎo)ESM-1分泌，并且VEGF抗體劑量依賴性地抑制VEGF誘導(dǎo)的ESM-1表達(dá)［3］。ESM-1表達(dá)可以作為腫瘤內(nèi)皮組織血管侵襲的標(biāo)志物，可能參與肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展［4，9］。以上結(jié)果均從不同角度說明ESM-1在許多腫瘤中高表達(dá)，并且其表達(dá)量和腫瘤惡性程度以及血管生成有關(guān)，ESM-1的高表達(dá)使腫瘤惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能增加。但是在對ESM-1與胃癌和結(jié)腸癌關(guān)系的研究中卻顯示與上述不一致的結(jié)果［10-11］。在結(jié)腸癌和胃癌組織中，ESM-1的表達(dá)量與正常結(jié)腸組織和胃組織比較呈明顯降低，在本研究中也是同樣的結(jié)論，乳腺組織中ESM-1的表達(dá)往往預(yù)示著良好的預(yù)后，而ESM-1在乳腺腫瘤中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究表明，ESM-1在乳腺癌組織表達(dá)水平與患者的生存相關(guān)。臨床常用于判斷乳腺癌預(yù)后的相關(guān)因素，例如腋窩的轉(zhuǎn)移、HER-2的擴(kuò)增狀況等，均代表著預(yù)后不佳，而這兩者又與ESM-1的低表達(dá)有相關(guān)性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反之ESM-1的高表達(dá)預(yù)示著患者的預(yù)后佳。因此，ESM-1可能代表乳腺癌隨訪的一個新的分子標(biāo)志物，或成為今后研發(fā)抗癌藥品的新靶點(diǎn)。但鑒于ESM-1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制尚不清楚。有必要對ESM-1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索，從而有更多的手段監(jiān)管好乳腺癌患者的隨訪，有效延長患者的生存。

［1］ Lassalle P，Molet S，Janin A，et al.ESM-1 is a novel human endothelial cell-specific molecule expressed in lung and regulated by cytokines［J］.J Biol Chem，1996，271（34）：20458-64.

［2］ Bechard D，Gentina T，Delehedde M，et al.Endocan is a novel chondroitin sulfate/dermatan sulfate proteoglycan that promotes hepatocyte growth factor/scatter factor mitogenic activity［J］.J Biol Chem，2001，276（51）：48341-9.

［3］ Grigoriu B D，Depontieu F，Scherpereel A，et al.Endocan expression and relationship with survival in human non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12（15）：4575-82.

［4］ Kang Y H，Ji N Y，Lee C I，et al.ESM-1 silencing decreased cell survival，migration，and invasion and modulated cell cycle progression in hepatocellular carcinoma［J］.Amino Acids，2011，40（3）：1003-13.

［5］ Maurage C A，Adam E，Minéo J F，et al.Endocan expression and localization in human glioblastomas［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2009，68（6）：633-41.

［6］ Scherpereel A，Gentina T，Grigoriu B，et al.Overexpression of endocan induces tumor formation［J］.Cancer Res，2003，63（18）：6084-9.

［7］ Abid M R，Yi X，Yano K，et al.Vascular endocan is preferentially expressed in tumor endothelium［J］.Microvasc Res，2006，72（3）：136-45.

［8］ Aitkenhead M，Wang S J，Nakatsu M N，et al.Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis：induction of ESM-1，（beta）ig-h3，and NrCAM［J］.Microvasc Res，2002，63（2）：159-71.

［9］ Chen L Y，Liu X，Wang S L，et al.Over-expression of the Endocan gene in endothelial cells from hepatocellular carcinoma is associated with angiogenesis and tumour invasion［J］.J Int Med Res，2010，38（2）：498-510.

［10］Kang Y H，Ji N Y，Han S R，et al.ESM-1 regulates cell growth and metastatic process through activation of NF-κB in colorectal cancer［J］.Cell Signal，2012，24（10）：1940-9.

［11］Lv Z，F(xiàn)an Y，Chen H，et al.Endothelial cellspecific molecule-1：a potential serum marker for gastric cancer［J］.Tumour Biol，2014，35（10）：10497-502.

The expression and significance of ESM-1 in breast cancer tissues

Yan Yunwen，Xu Xiaojun，Chen Ying，et al
（Dept of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the endothelial cells specificity molecular-1（ESM-1）as a sensitive molecular markers to predict the prognosis and recurrence of breast cancer.Methods 133 cases of patients with breast cancer was selected.The expression of ESM-1 in breast cancer tissues and normal breast tissue were detected to analyze the correlation between endocan and the biological behaviors and prognosis of breast cancer.Results The results demonstrated that ESM-1 level was down-regulated in breast cancer tissue compared to normal breast tissue.Correlation analysis demonstrated that there were significant positive correlations between ESM-1 expression and survival rate，and HER-2 expression level and lymph node metastasis，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion ESM-1 could act as a bio-marker in the diagnosis and prognosis judgment in breast cancer patients.ESM-1 high expression might be a predictor for prognosis.

breast cancer；bio-marker；ESM-1；prognosis

R 737.9

A

1000-1492（2016）08-1167-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.042.html

2016-05-17 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81201907）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

顏蘊(yùn)文，女，博士研究生；

張敬杰，男，主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：13956948654@ yeah.net

選取133例乳腺癌患者石蠟標(biāo)本，進(jìn)行癌組織和癌旁組織切片，采用免疫組化法研究ESM-1蛋白的表達(dá)，分析ESM-1與腫瘤生物學(xué)行為及患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果 ESM-1的表達(dá)在乳腺癌組織中弱，而在癌旁組織中強(qiáng)；在分期早的腫瘤中表達(dá)高于分期晚的腫瘤。ESM-1和乳腺癌的預(yù)后有著密切的關(guān)系，在腋窩轉(zhuǎn)移陽性患者中ESM-1表達(dá)低于腋窩陰性患者且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），人類表皮生長因子受體2（HER-2）過表達(dá)患者中ESM-1的表達(dá)低于HER-2無擴(kuò)增患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他相關(guān)因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 ESM-1可以成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的一個分子標(biāo)志物，ESM-1在組織中的高表達(dá)往往預(yù)示著該患者有較好的預(yù)后和長期的生存。