中國人群中Hsp90AB1基因多態(tài)性和SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)研究

谷園園，鄒延峰，徐建華，胡華青，孫秀秀，陶金輝，徐勝前，劉 爽，王德光，劉盛秀，蔡 靜，肖 會，陳佩玲，連 莉，宋亞平，梁春梅，王中新，黃海良，潘發(fā)明，蘇 虹，潘海峰，葉冬青

◇臨床醫(yī)學(xué)研究◇

中國人群中Hsp90AB1基因多態(tài)性和SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)研究

谷園園1，鄒延峰1，徐建華2，胡華青3，孫秀秀1，陶金輝4，徐勝前2，劉 爽2，王德光5，劉盛秀6，蔡 靜2，肖 會2，陳佩玲2，連 莉2，宋亞平1，梁春梅7，王中新8，黃海良9，潘發(fā)明1，蘇 虹1，潘海峰1，葉冬青1

目的 探討Hsp90AB1基因多態(tài)性與中國漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病之間的關(guān)系。方法 對278例SLE患者和278例正常對照者采用病例對照研究。HapMap數(shù)據(jù)庫和Haploview軟件篩選出中國人群Hsp90AB1基因標簽SNPs，采用Multiplex SNaPshot技術(shù)進行基因分型。運用SPSS 10.01軟件進行統(tǒng)計分析。應(yīng)用在線軟件進行單倍型統(tǒng)計分析。結(jié)果 rs9367190位點的基因型（CC、CA、AA）的頻率在SLE組與對照組分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5），而等位基因C、A的頻率在SLE組與對照組分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.012 5）；采用顯性模型（CC vs CA+AA：校正OR=0.649，95%CI：0.464～0.908，P=0.012）分析結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但隱性模型分析結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5）。而rs13296位點的基因型GG、GA、AA的頻率以及其等位基因G、A頻率在SLE組與對照組的分布均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.0125）；顯性模型和隱性模型分析結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5）。單倍型A/G與SLE發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)（OR=0.668，95%CI：0.512～0.871，P=0.003）。結(jié)論 在中國人群中Hsp90AB1基因多態(tài)性（rs9367190）可能和SLE發(fā)病關(guān)聯(lián)。

Hsp90AB1；基因多態(tài)性；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；易感性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，臨床特征表現(xiàn)為累及多器官臟器，病程遷延反復(fù)，且發(fā)病存在性別差異，男女比例約1∶＞8。家族聚集性與同卵雙生患病率高于異卵雙生，說明遺傳因素在SLE發(fā)病中起著重要作用。熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）廣泛存在于真核和原核細胞中，是細胞質(zhì)內(nèi)最活躍的分子伴侶。人類Hsp90以是否含有豐富的谷氨酰胺片段而分為Hsp90AA1和Hsp90AB1兩類［1］。Hsp90AB1基因在SLE的發(fā)病中的作用是通過翻譯調(diào)節(jié)Hsp90表達，Hsp90和白細胞介素6（interleukin-6，IL6）表達增加，能誘導(dǎo)B淋巴細胞分化為漿細胞，促進自身抗體產(chǎn)生；降低CD8+抑制性T細胞的活性；免疫球蛋白分泌增加［2］。此外，SLE的最常用藥物是糖皮質(zhì)激素類（glucocorticoids，GCs）藥物，GCs與其受體結(jié)合的穩(wěn)定性受Hsp90表達量的調(diào)控，Hsp90AB1基因也可能通過控制Hsp90的表達調(diào)節(jié)SLE療效。該研究采用病例對照的方法首次探究Hsp90AB1基因多態(tài)性與SLE之間關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批通過，每個研究對象在接受調(diào)查前由研究員告知其本次研究內(nèi)容，獲患者本人同意并簽字。SLE患者來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院以及安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，共278例SLE患者，其中女257例，男21例；年齡16～72（33.96±11.51）歲。所有確診患者符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）的SLE分類標準。同期隨機選擇年齡、性別、地區(qū)和民族與SLE患者相匹配的278例健康體檢者作為正常對照，正常對照符合下列要求：①本人及其直系親屬均無自身免疫性疾??；②不具有SLE分類標準中的任何一條；③入選前1周無明顯身體不適癥狀且無重大疾病史。正常對照中女257例，男21例；年齡15～71（34.31±9.54）歲。所有納入對象無血緣關(guān)系。

1.2 標本的收集 由專業(yè)醫(yī)護人員從SLE患者和正常對照者前臂采取靜脈血5 ml用于SNP（single nucleotide polymorphism）分型：EDTA抗凝，離血漿和血細胞。DNA的提?。簭耐庵馨准毎刑崛?，使用Qiagen提取試劑盒，-80℃分裝凍存。

1.3 SNP選擇和檢測方法 使用HapMap數(shù)據(jù)庫（Chinese Han in Beijing，release No.24/phaseII Nov08，on NCBI B36 assembly）查詢Hsp90AB1基因SNPs，共獲得rs9367190、rs9381303、rs13296、rs11538975和rs5046975共5個SNPs。采用Haploview（4.0版）軟件，通過Linkage Distance（LD）圖對候選基因SNPs的篩選，共篩選出2個標簽SNPs（tagger SNPs，與其余的3個SNPs有強的連鎖相關(guān)性）：rs9367190、rs13296。SNP分型采用Multiplex SNaPshot技術(shù)（美國應(yīng)用生物公司ABI開發(fā)），利用連接反應(yīng)的高特異性，獲取不同長度高度多重（48～192）連接產(chǎn)物，并通過雙連接反應(yīng)擴大連接產(chǎn)物的長度范圍，使用通用熒光引物擴增不同長度連接產(chǎn)物，對擴增后的產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳，采用GeneMapper軟件進行數(shù)據(jù)讀取。SNP分型人員不知道研究對象分組情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.01軟件進行分析，定量資料以±s進行描述，組間比較采用t檢驗；定性資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。用直接計數(shù)法計算基因型和等位基因頻率。顯性模型和隱性模型使用Logistic回歸分析（Y變量賦值：0=對照，1=病例；單因素分析）和多元Logistic回歸分析（多因素分析，校正因素為年齡和性別）。Hardy-Weinberg（HWE）平衡采用χ2檢驗檢測基因型頻率分布。在線（http：//analysis.bio-x. cn/）進行Haplotype分析，要求所有單倍型頻率都不小于0.03。采用Bonferroni法校正后的檢驗水平α為P＜0.012 5。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本特征和HWE平衡結(jié)果 SLE組和對照組年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。SLE組和對照組的rs9367190和rs13296的基因型及等位基因的頻率分布均滿足HWE平衡。見表2。研究對象有群體代表性。

2.2 SLE組和對照組Hsp90AB1基因rs9367190位點基因型和等位基因的頻率分布比較Hsp90AB1基因rs9367190位點CC、CA、AA基因型頻率在SLE組和對照組分別為56.47%、38.13%、5.40%和45.68%、44.24%、10.08%，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5）；等位基因C、A頻率在SLE組和對照組分別為75.54%、24.46%和67.81%、32.19%，分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.012 5）。見表3。

表1 SLE組和對照組的基本特征比較

表2 HSP90AB1的多態(tài)性HWE平衡結(jié)果

2.3 SLE組和對照組Hsp90AB1基因rs13296位點基因型和等位基因的頻率分布比較 Hsp90AB1基因rs13296位點GG、GA、AA基因型頻率在SLE組和對照組分別為37.05%、48.20%、14.75%和39.21%、46.40%、14.39%，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5）；等位基因G、A頻率在SLE組和對照組分別為61.15%、38.85%和62.41%、37.59%，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.012 5）。見表3。

2.4 Hsp90AB1基因rs9367190位點基因多態(tài)性與SLE發(fā)病關(guān)系 顯性模型（CC vs CA+AA：粗OR= 0.648，95%CI：0.464～0.906，P=0.011）單因素Logistic回歸分析統(tǒng)計分析顯示rs9367190基因多態(tài)性與SLE發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，隱性模型（CC+CA vs AA：粗OR=0.509，95%CI：0.266～0.976，P=0.042）分析顯示rs9367190基因多態(tài)性與SLE發(fā)病不存在關(guān)聯(lián)?？紤]到混雜因素年齡、性別可能對結(jié)果的影響，以年齡、性別為校正因素進行校正，校正后的顯性模型分析結(jié)果仍存在關(guān)聯(lián)（校正OR=0.649，95% CI：0.464～0.908，P=0.012），而隱性模型分析結(jié)果仍不存在關(guān)聯(lián)（校正OR=0.509，95%CI：0.265～0.977，P=0.042）。見表4。結(jié)果表明rs9367190位點基因多態(tài)性與SLE發(fā)病存在一定的關(guān)聯(lián)性，且rs9367190位點突變?yōu)镾LE發(fā)病保護因素。

2.5 Hsp90AB1基因rs13296基因多態(tài)性與SLE發(fā)病之間的關(guān)系 顯性模型（GG vs GA+AA：粗OR =1.096，95%CI：0.778～1.543，P=0.600）；隱性模型（GG+GA vs AA：粗OR=1.029，95%CI：0.643～1.649，P=0.904）分析，rs13296基因多態(tài)性與SLE發(fā)病之間均無關(guān)聯(lián)。以年齡、性別為校正因素進行校正，校正后的結(jié)果仍無關(guān)聯(lián)（顯性模型：校正OR =1.090，95%CI：0.773～1.538，P=0.623；隱性模型：校正OR=1.023，95%CI：0.638～1.640，P= 0.926）。見表4。結(jié)果表明rs13296位點基因多態(tài)性與SLE發(fā)病無關(guān)。

表3 SLE組和對照組Hsp90AB1基因rs9367190與rs13296基因型和等位基因的頻率分布［n（%）］

2.6 Hsp90AB1基因2個SNP位點Haplotype分析 單倍型A/G與SLE發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)（OR= 0.668，95%CI：0.512～0.871，P=0.003）。單倍型C/A（OR=1.045，95%CI：0.819～1.333，P= 0.723）和C/G（OR=1.367，95%CI：1.065～1.753，P=0.014）與SLE發(fā)病之間不存在關(guān)聯(lián)。單倍型A/A在SLE組與對照組的頻率分別為0.009和0.005，均小于0.03，未納入Haplotype分析。見表5。

3 討論

SLE是一種典型的自身免疫性病，主要的臨床特征是血清中出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體和多器官多系統(tǒng)累及，SLE患者發(fā)生感染最常受累的部位是呼吸道（肺部最常見），其次是皮膚及尿道、口腔黏膜等部位［3-4］。遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的免疫紊亂是SLE可能的發(fā)病原因。SLE發(fā)病的個體差異性和家族聚集性說明遺傳因素是其發(fā)病的主要影響因素之一。近年來，利用全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）技術(shù)，SLE的遺傳學(xué)研究有了很大的進展，相繼發(fā)現(xiàn)很多基因與SLE遺傳易感性有關(guān)［5］。但由于GWAS本身亦存在一定局限性，導(dǎo)致其結(jié)果不能被很好重復(fù)，產(chǎn)生了很多假陽性和假陰性結(jié)果［6］。其局限性如研究之前不基于現(xiàn)有證據(jù)構(gòu)建任何假設(shè)，不能嚴格按照環(huán)境因素（如年齡和性別）進行匹配，檢驗水平采用保守的Bonferroni法校正等。因此，可能還有很多SLE的易感基因并沒有被發(fā)現(xiàn)。在我國，SLE的患病率較高且生存率不斷增加，疾病痛苦和長期的診療費用對患者而言是一個相當大的疾病負擔。因此，探討SLE的可能致病機制是必要的，為SLE的早期診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測提供依據(jù)。

Hsp90是熱休克蛋白家族中重要一員，是具有高度保守性的廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)，應(yīng)激時高表達，在機體的腫瘤免疫、自身免疫和抗感染免疫反應(yīng)中起著重要作用［7］。Hsp90的客戶蛋白多達100多種，廣泛存在組織細胞中，活化態(tài)的Hsp90作為分子伴侶與客戶蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，保護對應(yīng)客戶蛋白不被蛋白酶降解［8］。Hsp90AB1是Hsp90的一個亞型，作為分子伴侶參與細胞對多種刺激的保護作用，容易受有絲分裂的誘導(dǎo)，與結(jié)構(gòu)構(gòu)建和細胞分化有關(guān)［9］。Hsp90AB1基因轉(zhuǎn)錄增加與Hsp90的表達增加有關(guān)，并且在SLE患者外周血單個核細胞中發(fā)現(xiàn)Hsp90表達增加。Hsp90作為分子伴侶蛋白與IL-6表達的增加有關(guān)，可能在SLE調(diào)節(jié)自身免疫的發(fā)病機制發(fā)揮重要作用。Hsp90與自身免疫性疾?。ò⊿LE）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。近幾年關(guān)于Hsp90與SLE的發(fā)病研究不斷證實Hsp90在SLE中的表達高于正常人群。但目前國內(nèi)外尚無Hsp90AB1基因多態(tài)性與SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)性研究。因此，本文從遺傳因素的層面來探討Hsp90AB1基因突變和SLE發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)。

本研究表明Hsp90AB1基因rs9367190位點SLE組和對照組等位基因的頻率分布之間存在明顯差異。對照組突變基因的頻率多高于SLE組，這表明rs9367190位點突變可能是SLE發(fā)病的保護因素。進一步分析Hsp90AB1基因rs9367190位點多態(tài)性與SLE發(fā)病關(guān)系，顯性模型分析結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，rs9367190位點多態(tài)性與SLE發(fā)病存在關(guān)聯(lián)且rs9367190位點突變可能是SLE發(fā)病的保護因素。因此，可能機制是Hsp90AB1基因突變導(dǎo)致Hsp90AB1的表達改變，而Hsp90AB1作為分子伴侶與IL-6或其它因子共同作用，從而導(dǎo)致個體患SLE風(fēng)險不同。同時，單倍型分析結(jié)果也顯示2個SNP所構(gòu)成單倍型A/G與SLE發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)，可能與SLE易感基因相連鎖。rs9367190位點及與其連鎖不平衡位點的功能研究有助于揭示其具體機制。本研究在調(diào)整年齡、性別混雜因素干擾后，這種相關(guān)性仍然存在，年齡、性別在此位點上對相關(guān)性影響不大。

表4 Hsp90AB1基因rs9367190與rs13296基因多態(tài)性與SLE發(fā)病之間的關(guān)系［n（%）］

表5 Hsp90AB1基因2個SNP位點Haplotype分析

本研究顯示Hsp90AB1基因rs13296位點SLE組和對照組基因型及等位基因的頻率分布之間不存在明顯差異，顯性模型和隱性模型分析結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Hsp90AB1基因rs13296位點多態(tài)性的研究分析顯示rs13296位點多態(tài)性可能與SLE發(fā)病無關(guān)。但是，考慮到本研究的局限性，rs13296位點多態(tài)性與SLE發(fā)病是否有關(guān)聯(lián)需要進一步的研究證實。本研究局限性包括：①此次研究收集的樣本量有限，使可能存在的差異沒有體現(xiàn)出來，rs13296位點對照組和SLE組的頻率相差很小，檢驗效能不高，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；②所搜集的研究對象來自安徽省，地域的局限性可能對結(jié)果產(chǎn)生干擾；③目前國內(nèi)外尚無Hsp90AB1多態(tài)性（rs13296）與SLE發(fā)病的研究，不能進行比較。

近年來，隨著熱休克蛋白作為腫瘤細胞的重要靶點被證實，Hsp90AB1基因多態(tài)性也逐漸受到關(guān)注。如Hsp90AB1基因多態(tài)性與印度奶牛的耐熱性和產(chǎn)奶量性狀關(guān)聯(lián)的動物實驗研究［11］，證實印度奶牛的耐熱性和產(chǎn)奶量性狀與Hsp90AB1基因多態(tài)性有關(guān)；Hsp90AB1基因多態(tài)性與土耳其人非小細胞肺癌關(guān)聯(lián)的人群研究［12］中，證實土耳其人Hsp90AB1基因多態(tài)性與非小細胞肺癌發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，本研究首次在中國漢族人群中初步探究Hsp90AB1基因多態(tài)與SLE易感性的關(guān)系。結(jié)果提示rs9367190位點多態(tài)性可能與SLE存在關(guān)聯(lián)，且rs9367190突變可能是SLE發(fā)病的保護因素，但是rs13296位點多態(tài)性可能與SLE的易感性無關(guān)。這為以后SLE發(fā)病機制的研究提供了新的依據(jù)，但是需要更大樣本量的研究及后續(xù)的基因功能研究來證實。

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Association between polymorphism of Hsp90AB1 gene and
susceptibility of systemic lupus erythematosus in Chinese population

Gu Yuanyuan1，Zou Yanfeng1，Xu Jianhua2，et al
（1Dept of Epidemiology and Biostatistics，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032；

2Dept of Rheumatology and Immunology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore the association between Hsp90AB1 gene polymorphism and systemic lupus erythematosus（SLE）susceptibility in Chinese han population.Methods A case-control study was conducted by 278 SLE patients and 278 normal controls.Hsp90AB1 genetic tag SNPs（single nucleotide polymorphisms）in Chinese population were selected by the HapMap database and Haploview software，and the Tag SNPs were genotyped by Multiplex SNaPshot technology.Statistical analysis was performed with SPSS 10.01 software.An online software was used in haplotypes analysis.Results The rs9367190 genotypes（CC，CA，AA）had significant difference between SLE group and the control group（P＞0.012 5），but the allele（C，A）frequency distribution had significant difference between SLE group and the control group（P＜0.012 5）；there was significant association between Hsp90AB1 gene rs9367190 polymorphism and SLE under the dominant model analysis（CC vs CA+AA：adjust OR =0.648，95%CI：0.464～0.906，P=0.011），but there was no statistically significant difference of the result in the recessive model analysis（P＞0.012 5）.However，the genotypes（GG，GA，AA）and the allele（G，A）frequency distributions of the rs13296 polymorphism all had no statistically significant difference between SLE group and the control group（P＞0.012 5）.The results of the dominant model analysis and the recessive model analysis had no significant difference（P＞0.012 5）.There was an association between SLE and haplotype A/G（OR=0.668，95%CI：0.512～0.871，P=0.003）.Conclusion Hsp90AB1 gene polymorphism（rs9367190）may be associated with SLE in Chinese population.

Hsp90AB1；genetic polymorphism；systemic lupus erythematosus；susceptibility

R 593.241；R 181.26；R 394.112

A

1000-1492（2016）08-1151-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.034.html

2016-04-14 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81373073）

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系、7檢驗系，合肥 230032

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2風(fēng)濕免疫科、3健康體檢中心、6皮膚性病科、8檢驗科，合肥 230022

4安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥 230001

5安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，合肥 230601

9安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，合肥 230032

谷園園，女，碩士研究生；

鄒延峰，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zouyanfeng2015@163.com