RNA干擾沉默基質(zhì)交感分子1減輕H9C2細(xì)胞低氧/復(fù)氧損傷

郟紅靜，吳繼雄，王曉晨，許邦龍

RNA干擾沉默基質(zhì)交感分子1減輕H9C2細(xì)胞低氧/復(fù)氧損傷

郟紅靜，吳繼雄，王曉晨，許邦龍

目的 探討沉默基質(zhì)交感分子1（STIM1）對(duì)H9C2心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧損傷的影響。方法 培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧（H/R）模型，STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞以下調(diào)STIM1表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)各組STIM1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，H/R組的STIM1表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2蛋白比率增高，Caspase-3上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染能顯著下調(diào)STIM1基因的表達(dá)（P＜0.05），減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并且Bax/Bcl-2比率降低，Caspase-3表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)STIM1表達(dá)量明顯增加，STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)STIM1基因的表達(dá)可以減輕低氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡。

H9C2心肌細(xì)胞；低氧/復(fù)氧；凋亡；基質(zhì)交感分子1

急性心肌梗死是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。再灌注治療通過(guò)恢復(fù)缺血組織的供血有效地挽救缺血組織，是治療心肌梗死的最主要措施。但心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）的存在，一定程度上限制了再灌注治療的療效［1-2］。鈣超載在MIRI引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［3］?；|(zhì)交感分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）是鈣庫(kù)操作性鈣離子通道（store-operated calcium entry，SOCE）的主要組成部分，通過(guò)調(diào)控SOCE從而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為［4］。該研究利用H9C2心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型，從而模擬心肌細(xì)胞的缺血再灌注，觀察在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)STIM1表達(dá)量的變化，同時(shí)利用siRNA技術(shù)沉默STIM1的表達(dá)以探討其對(duì)低氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9C2心肌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胰蛋白酶（中國(guó)Biosharp公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物技術(shù)有限公司）；STIM1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technologies公司）；β-actin、過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天公司）；PVDF膜（美國(guó)密理博公司）；STIM1-siRNA和scramble siRNA（即陰性對(duì)照組）（上海吉?jiǎng)P公司）；RT-PCR試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2 siRNA構(gòu)建及驗(yàn)證 采用Block-iT RNAi Designer系統(tǒng)設(shè)計(jì)針對(duì)STIM1的stealth-siRNA，由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)并合成3條siRNA，見(jiàn)表1。該3條siRNA的干涉效率采用Western blot及RT-PCR檢測(cè)，將細(xì)胞隨機(jī)分成5組（n=8），即空白對(duì)照組、scramble siRNA組（陰性對(duì)照組）、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。

表1 各基因引物序列和基因片段長(zhǎng)度

1.3 H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及低氧/復(fù)氧模型的建立 細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃、5%CO2和95%的空氣培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h換液，以后隔天換液1次，待細(xì)胞覆蓋率至少達(dá)到80%后用于建立低氧/復(fù)氧模型。

H9C2細(xì)胞更換含0.5%FBS、低糖DMEM培養(yǎng)基后在37℃、含95%N2/5%CO2的低氧培養(yǎng)箱中處理12 h后，更換0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)氧處理6 h以建立低氧/復(fù)氧模型［5］。對(duì)照組細(xì)胞在含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育18 h。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染前1 d細(xì)胞被接種于6孔板中，用無(wú)雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，用LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染STIM1-siRNA及scramble siRNA，按說(shuō)明書(shū)操作，后將細(xì)胞置于常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分組：將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分成4組（n=8）：對(duì)照組、低氧/復(fù)氧組（H/R組）、低氧/復(fù)氧+STIM1-siRNA組（STIM1-siRNA組）、低氧/復(fù)氧+scramble siRNA組（scramble siRNA組）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒提供的方法，收集經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染48 h處理后的上清懸浮的細(xì)胞，同時(shí)用不含EDTA的胰酶消化貼壁的細(xì)胞后，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌2次。使用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度約為1 ×106個(gè)/ml。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin VFITC，輕輕混勻后于室溫避光反應(yīng)5～15 min。再加入10 μl PI混勻后于室溫避光反應(yīng)5～15 min。在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 Fluo3-AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

將H9C2心肌細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R組、STIM1-siRNA組及scramble siRNA組。處理結(jié)束后各組加入10 μmol/L的Fluo3-AM，37℃孵育60 min后激光共聚焦顯微鏡掃描熒光強(qiáng)度（德國(guó)Carl-Zeiss公司）。Image-Pro Plus 6.0軟件（美國(guó)Silver-Spring公司）獲取圖像并分析熒光強(qiáng)度。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)STIM1 mRNA的水平 TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，驗(yàn)證其純度和完整性符合要求后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為30℃、10 min，42℃、60 min以及85℃、10 min。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。STIM1上游引物：5′-ACTCTCCGGAAGCAGCTAGA-3′，下游引物：5′-CCTTCGACAACCGAAGGTCA-3′。β-actin上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物：5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。逆轉(zhuǎn)錄條件為95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、32 s讀板，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系20 μl，PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量比較，β-actin為內(nèi)參。

1.8 Western blot法檢測(cè)STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染效率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 總蛋白樣本的提取：向每瓶培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)加入400 μl含PMSF的裂解液，在冰上裂解30 min后于4℃、13 000 r/min離心5 min。將離心后含有蛋白的上清液分裝收集放置-20℃冰箱中保存，利用BCA法測(cè)定蛋白含量并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，之后孵一抗4℃過(guò)夜。用TBST漂洗后于37℃孵育二抗2 h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。若方差不齊則進(jìn)行非參數(shù)分析（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)），組間多重比較采用Tamhane法。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對(duì)H9C2心肌細(xì)胞STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Wetsern blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組對(duì)H9C2心肌細(xì)胞STIM1表達(dá)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3條siRNA中，以siRNA3對(duì)STIM1表達(dá)的抑制效率最高，與空白對(duì)照組比較，siRNA3使得心肌細(xì)胞STIM1 mRNA表達(dá)量下降了71%，蛋白表達(dá)量減少了69%。見(jiàn)圖1。

2.2 各組H9C2心肌細(xì)胞STIM1的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，各組STIM1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.214，P＜0.001）。其中，與對(duì)照組比較，H/R組STIM1表達(dá)量增加了3.75倍（P＜0.05），STIM1-siRNA組的STIM1蛋白表達(dá)水平較H/R組和scramble siRNA組明顯降低，分別為0.2倍和0.21倍（P＜0.001），而scramble siRNA組的STIM1蛋白表達(dá)水平與H/R組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.948）。見(jiàn)圖2。

圖1 siRNA對(duì)H9C2心肌細(xì)胞STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（n=10）

圖2 STIM1在各組H9C2心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況（n=8）

2.3 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染后H9C2心肌細(xì)胞凋亡的變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化提示各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.591，P＜0.001）。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率只有（0.1±0.01）%；與對(duì)照組比較，H/R組凋亡的細(xì)胞增多，細(xì)胞凋亡率達(dá)（33.5±5.80）%（P＜0.001）；STIM1-siRNA組細(xì)胞凋亡率為（6.9±0.94）%，較H/R組降低（P＜0.001）；scramble siRNA組細(xì)胞凋亡率為（35.3± 4.10）%，與H/R組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.897）。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡變化

2.4 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H9C2心肌細(xì)胞Ca2+濃度的影響 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=278.808，P＜0.001），Ca2+濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加（P＜0.001），熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的2.93倍；而通過(guò)STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)STIM1表達(dá)后，能抑制低氧/復(fù)氧導(dǎo)致的這一作用，熒光強(qiáng)度為H/ R組的0.35倍（P＜0.001）。H/R組與scramble siRNA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.948）。見(jiàn)圖4。

圖4 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H9C2心肌細(xì)胞Ca2+濃度的影響

2.5 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H9C2心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，各組間Bcl-2（χ2=27.606，P＜0.001）、Bax（χ2=26.647，P＜0.001）和cleaved-Caspase-3（χ2= 24.589，P＜0.001）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Bax/Bcl-2（χ2=26.241，P＜0.001）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，與對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)Bax（P＜0.001）和Caspase-3（P＜0.001）的表達(dá)明顯增加，Caspase-3是對(duì)照組的3.75倍。Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.001），Bax/Bcl-2是對(duì)照組的5.24倍；而通過(guò)STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)STIM1表達(dá)后，能抑制低氧/復(fù)氧導(dǎo)致的這一作用，Caspase-3為H/R組的0.22倍（P＜0.001），Bax/Bcl-2為H/R組的0.35倍（P＜0.001）。H/R組與scramble siRNA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.887）。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)各組中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)情況（n=8）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用H9C2心肌細(xì)胞株建立心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型，從而模擬心肌細(xì)胞的缺血再灌注，觀察到心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)STIM1表達(dá)量明顯增加，隨后用siRNA-STIM1轉(zhuǎn)染沉默STIM1基因的表達(dá)后，可見(jiàn)STIM1-siRNA組較H/R組和scramble siRNA組的STIM1表達(dá)量明顯減少，凋亡率明顯減低，凋亡相關(guān)蛋白含量明顯下降，這與Zhang et al［6］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血模型中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，提示STIM1參與了MIRI，而抑制STIM1的表達(dá)可以減輕再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡。

凋亡是生理性或某些因素誘發(fā)的有程序的細(xì)胞自主生化過(guò)程，在MIRI過(guò)程中扮演著重要角色［7］。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些蛋白質(zhì)包括促細(xì)胞凋亡的Bax和抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2等，這些誘導(dǎo)或抑制凋亡的蛋白相互作用，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中促凋亡和抗凋亡蛋白的比率決定細(xì)胞的存活或者死亡［8］，Bax/Bcl-2比例增高，細(xì)胞凋亡明顯增加［9］。Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要執(zhí)行者［10］。故Bcl-2、Bax/Bcl-2、Caspase-3是反映凋亡的經(jīng)典指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，H9C2細(xì)胞經(jīng)歷12 h低氧和6 h復(fù)氧后凋亡率顯著增加，說(shuō)明體外細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型的建立是成功的。Western blot結(jié)果顯示Bax/Bcl-2比例增高，cleaved-Caspase-3顯著上調(diào)。siRNA抑制STIM1基因的表達(dá)可以顯著降低細(xì)胞凋亡率及Bax/Bcl-2的比例，并使Caspase-3表達(dá)下調(diào)，從而說(shuō)明了STIM1基因沉默可以抑制低氧/復(fù)氧損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡。

STIM1是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的I型跨膜蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度的感受器和SOCE的核心蛋白之一，其結(jié)構(gòu)中包含一段長(zhǎng)約100個(gè)氨基酸序列的具有活化功能的結(jié)構(gòu)域即SOAR。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+消耗之后，該結(jié)構(gòu)域能夠激活Orai通道，引起SOCE通路的開(kāi)放及Ca2+內(nèi)流［4，11-12］。當(dāng)鈣庫(kù)內(nèi)的Ca2+得到補(bǔ)充后，STIM1蛋白迅速地從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細(xì)胞膜偶聯(lián)中解離出來(lái)，Orai蛋白也隨之失活，最終SOCE通路關(guān)閉［13］。Zhang et al［6］發(fā)現(xiàn)，SOCE參與了腦缺血損傷，在此過(guò)程中STIM1和Orai表達(dá)均增加，而用siRNA抑制STIM1表達(dá)可以下調(diào)Orai的含量，減少神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，改善腦功能。本研究顯示低氧/復(fù)氧損傷可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增加，用siRNA抑制STIM1表達(dá)可以減少H9C2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，與上述研究結(jié)果一致。因此，推測(cè)抑制STIM1的表達(dá)，可能是通過(guò)減少Ca2+內(nèi)流而減輕低氧/復(fù)氧損傷中細(xì)胞的凋亡的。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究顯示心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)STIM1表達(dá)明顯增加，siRNA沉默STIM1基因的表達(dá)可以減少低氧/復(fù)氧損傷所致的心肌細(xì)胞Ca2+濃度的增加和細(xì)胞的凋亡，并下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。未來(lái)將在動(dòng)物模型中進(jìn)一步探討STIM1影響MIRI的機(jī)制，希望為臨床減少缺血再灌注損傷提供新的思路。

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Inhibition of stromal interaction molecule 1 attenuates hypoxia/reoxygenation induced apoptosis in H9C2 cells

Jia Hongjing，Wu Jixiong，Wang Xiaochen，et al
（Dept of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the role of stromal interaction molecule 1（STIM1）in apoptosis of H9C2 cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenation（H/R）injury.Methods H9C2 cardiomyocytes were cultured，the model of H/R injury was established.STIM1-siRNA was transfected into H9C2 cardiomyocytes to implement RNA interference.The apoptotic rate was detected by flow cytometry.Western blot analysis was used to detect the expressions of STIM1 and the apoptosis related proteins in each group.Results Compared with the control group，the expression of STIM1 was markedly increased in H/R group（P＜0.05），Bax/Bcl-2 was increased and the expression of Caspase-3 was up-regulated.Meanwhile，the apoptotic rate was increased（P＜0.05）.However，inhibition of STIM1 through transfection of STIM1-siRNA resulted in significantly decreased expression of STIM1（P＜0.05）and reduced influx of calcium，the ration of Bax/Bcl-2 was decreased and the expression of Caspase-3 was down-regulated，the apoptotic rate was also reduced（P＜0.05）.Conclusion The expression of STIM1 is significantly increased when cardiomyocytes suffered from the H/R injury.Inhibition of STIM1 through transfection of STIM1-siRNA can decrease the myocardial apoptosis after H/R injury.

H9C2 cells；hypoxia/reoxygenation injury；apoptosis；stromal interaction molecule 1

A

1000-1492（2016）08-1136-06

時(shí)間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.028.html

2016-04-19 接收

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2015xkj112）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230601

郟紅靜，女，碩士研究生；

吳繼雄，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wjx8261@163.com

R 322.11；R 845.22