HIF-1α基因介導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞在體外的成血管作用

鄧立方，朱友明，王銀龍

HIF-1α基因介導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞在體外的成血管作用

鄧立方，朱友明，王銀龍

目的 探索低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）基因誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞（DPSCs）在體外的成血管作用。方法 對HIF-1α進行基因突變，構(gòu)建突變型、野生型以及對照組的慢病毒載體；體外培養(yǎng)DPSCs；分別用3種慢病毒轉(zhuǎn)染DPSCs后，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、目的基因HIF-1α在mRNA及蛋白水平的表達，MTT法檢測慢病毒載體對細(xì)胞增殖的影響；目的基因轉(zhuǎn)染成功后，qPCR、Western blot法檢測HIF-1α調(diào)控DPSCs成血管因子的表達。結(jié)果 MTT結(jié)果表明慢病毒載體對DPSCs的增殖幾乎無影響。qPCR和Western blot法檢測目的基因HIF-1α成功表達，HIF-1α能夠顯著上調(diào)DPSCs的成血管因子的表達（P＜0.05）。突變組和野生組的成血管作用明顯強于對照組（P＜0.05），而突變組又優(yōu)于野生組（P＜0.05）。結(jié)論 HIF-1α基因可以促進DPSCs血管向分化作用。

HIF-1α；DPSCs；慢病毒轉(zhuǎn)染；成血管

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）有很強的增殖能力和多向分化的潛能，隨著基因工程和組織工程技術(shù)的發(fā)展，DPSCs越來越多地被用作修復(fù)受損組織或器官的轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞［1］。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是HIF-1的活性單位，調(diào)控數(shù)百種基因的轉(zhuǎn)錄活性，涉及骨髓源性血管細(xì)胞生成、血管反應(yīng)、動脈血管形成等［2］。HIF-1α蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性均受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)［3］，為了使其在常氧狀態(tài)下實現(xiàn)穩(wěn)定表達并且能夠保持高度活性，對HIF-1α基因進行抗降解突變和保持活性突變［4］。研究［5］表明血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以顯著增強DPSCs成血管的活性，而HIF-1α作為VEGF的上游靶基因，其在誘導(dǎo)DPSCs成血管作用方面具有更大的優(yōu)勢。骨修復(fù)和再生

中，血管與骨形成是相輔相成不可分開的，HIF-1α是此生物學(xué)過程中必需的關(guān)鍵性因子［6］。該研究擬運用基因增強組織工程技術(shù)，將HIF-1α基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至DPSCs中，探索HIF-1α在體外的成血管作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）；HIF-1α、成血管抗體（英國Abcam公司）；qPCR試劑盒（日本TaKa-Ra公司）；PVDF膜（美國Invitrogen公司）；細(xì)胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ的構(gòu)建 首先將野生型的HIF-1α基因（wild type HIF-1α，WT）進行基因突變?yōu)橥蛔冃虷IF-1α（mutant type HIF-1α，MT）：402位脯氨酸（Pro 402）突變成丙氨酸（Ala 402），803位天冬酰胺（Asn 803）突變成丙氨酸（Ala 803），564位脯氨酸（Pro 564）突變成丙氨酸（Ala 564）。然后分別合成過表達載體pcDNA6.2-WT及pcDNA6.2-MT，通過BP/ LR重組后，構(gòu)建慢病毒載體Lenti-WT、Lenti-MT和Lenti-LacZ。最后病毒包裝后進行滴度測定。

1.2.2 DPSCs的培養(yǎng)和分離 臨床收集年輕因正畸需要拔除的健康前磨牙或阻生齒，無菌條件下劈開牙齒取出牙髓，剪碎。先在培養(yǎng)皿中滴入1滴培養(yǎng)液，用消毒過的鑷子將剪碎的組織放入培養(yǎng)液中，鋪平勿重疊。用無菌凡士林涂于蓋玻片四角，將蓋玻片輕輕蓋在組織上，使其貼壁生長，切勿產(chǎn)生氣泡。最后加入適量培養(yǎng)液于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周后有細(xì)胞爬出，待細(xì)胞長滿狀態(tài)良好進行傳代。

1.2.3 HIF-1α基因轉(zhuǎn)染DPSCs最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值的測定 DPSCs培養(yǎng)至第3代，按2×105/孔將細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)定MOI值分別為2、4、6、8、10，將病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)病毒后每天觀察各孔中的熒光表達情況，選擇熒光細(xì)胞達到一定比例的最低MOI值作為最佳的MOI值。

1.2.4 MTT比色分析慢病毒對DPSCs細(xì)胞增殖水平的影響 將DPSCs鋪入96孔板中，第2天棄去培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞，每個基因分5組，每組設(shè)6孔，轉(zhuǎn)病毒Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT，常規(guī)培養(yǎng)。連續(xù)7 d每天先向各孔中加入5 mg/ml的MTT各20 L，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，再分別每孔加入150 μl的DMSO并置于搖床上緩慢震蕩30 min使結(jié)晶物充分溶解。最后用酶標(biāo)儀測定各孔490 nm處的吸光度值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 qPCR法測定目的基因HIF-1α以及成血管相關(guān)因子（VEGF、SDF-1、Ang-2）的mRNA的表達

選擇狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的DPSCs細(xì)胞進行鋪板。首先用0.25%胰酶消化后1 000 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸獲得單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，按照每孔2×105個細(xì)胞傳于6孔板中。待細(xì)胞生長至60%～70%融合度時，按照之前測定的最佳MOI值加入相應(yīng)體積的慢病毒轉(zhuǎn)染DPSCs細(xì)胞，實驗分組為Lenti-LacZ/DPSCs、Lenti-WT/DPSCs、Lenti-MT/DPSCs。分別于轉(zhuǎn)染后0、1、4、7、14及21 d收集細(xì)胞。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測定儀測定DNA濃度及純度，RNA純度為260/280 1.7～1.9，按照Invitrogen試劑說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈蟀磓PCR儀設(shè)定的PCR擴增體系進行PCR擴增，系統(tǒng)自帶軟件顯示各樣本Ct值，將標(biāo)本檢測所得的Ct值與相應(yīng)的β-actin基因Ct值相減，進行標(biāo)準(zhǔn)化，校正標(biāo)本RNA質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的差別，實驗重復(fù)進行3次。ΔCt=CtHIF-1α-Ctβ-actin。ΔΔCt定義為ΔCt不同處理組-ΔCt未轉(zhuǎn)染組，計算2-ΔΔCt進行相對定量。

1.2.6 Western blot法檢測HIF-1α蛋白以及成血管相關(guān)蛋白（VEGF、SDF-1、Ang-2）的表達 實驗分組同qPCR，分別于病毒轉(zhuǎn)染后0、1、4、7、14及21 d收集細(xì)胞。加入2 μl蛋白酶抑制劑及200 μl細(xì)胞裂解液，置于冰袋上，搖床緩慢震蕩15 min，吹打收集細(xì)胞中的蛋白。最后于4℃、12 000 r/min離心10 min。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，確定電泳每孔上樣量為30 μl。用10%的SDS-聚丙稀酰胺凝膠分離膠，濕式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBST沖洗3次，每次10 min，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液附一抗，4℃過夜。第2天在室溫下附二抗2 h后TBST洗滌3次。DAB顯色，暗室曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測 DPSCs轉(zhuǎn)染病毒7 d后，病毒轉(zhuǎn)染效果最好。倒置熒光顯微鏡觀察MOI=10 pfu/cell時，轉(zhuǎn)染效率最高，達90%以上，DPSCs保持增殖狀態(tài)。見圖1。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 ×500

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染對DPSCs增殖的影響 在目的基因轉(zhuǎn)染DPSCs后1～7 d進行MTT檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因組吸光度值高于LacZ組，MT組大于WT組（圖2）。這些結(jié)果也說明構(gòu)建的突變型HIF-1α基因在體外常氧條件下可以穩(wěn)定過表達并保持高度活性。另外，MTT結(jié)果表明慢病毒載體對DPSCs的增殖幾乎沒有什么影響，而且HIF-1α基因還有促進DPSCs增殖的作用。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染對DPSCs增殖的影響

2.3 目的基因檢測 實時定量PCR結(jié)果顯示，Lenti-MT組目的基因轉(zhuǎn)染DPSCs后，第1天HIF-1αmRNA的表達開始增高，7 d后達到高峰，14、21 d雖有降低但仍維持在很高水平。Lenti-MT組的HIF-1α表達與Lenti-WT組轉(zhuǎn)染1 d后就出現(xiàn)差異，7 d及21 d mRNA的表達量，Lenti-MT組幾乎比Lenti-WT組高出1倍（P＜0.05），Lenti-WT組HIF-1a mRNA的表達緩慢增長后逐漸降低。Lenti-LacZ組雖然也有少量HIF-1α的表達，但其與目的基因組相比，4、7、14、21 d差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.167，P＜0.05）。蛋白水平的表達趨勢與mRNA相符，LacZ組幾乎看不到HIF-1α蛋白的表達，而Lenti-MT組蛋白表達水平不斷升高，Lenti-WT組則相對穩(wěn)定。見圖3。

圖3 目的基因檢測

2.4 HIF-1α促進DPSCs成血管因子mRNA表達的檢測 檢測3個（VEGF、SDF-1、Ang-2）與成血管作用密切相關(guān)的基因。其中，VEGF基因在第4天Lenti-MT組的表達量為Lenti-LacZ組的2～3倍（F =3.329，P＜0.05）（圖4 A）。SDF-1基因第4天時Lenti-MT組為Lenti-LacZ組的4～5倍，第7天為10～15倍（F=6.231，P＜0.05）（圖4 B）。Ang-2基因第7天、第14天Lenti-MT組為Lenti-LacZ組的20～30倍（F=2.457，P＜0.05）（圖4 C）。此外，成血管基因在Lenti-MT組的表達水平與Lenti-WT組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 HIF-1α促進DPSCs成血管因子蛋白表達的檢測 基因轉(zhuǎn)染后0、1、4、7、14、21 d，收集細(xì)胞，Western blot法檢測成血管相關(guān)蛋白的表達。在目的基因轉(zhuǎn)染后第1天，VEGF和SDF-1蛋白表達增高，其過表達持續(xù)到第21天。Lenti-WT組和Lenti-MT組的VEGF蛋白表達水平與Lenti-LacZ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），VEGF蛋白Lenti-MT組高于Lenti-WT組（P＜0.05），SDF-1蛋白Lenti-MT組與Lenti-WT組之間無顯著差異。Ang-2蛋白在目的基因轉(zhuǎn)染后第4天出現(xiàn)過表達，第7～14天表達水平持續(xù)增高，與基因表達趨勢幾乎一致，Lenti-WT組和Lenti-MT組顯著高于Lenti-LacZ組（P＜0.05），同時，Lenti-MT組明顯高于Lenti-WT組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

近年來有關(guān)骨組織工程的研究越來越多，其與同種異體骨和自體骨相比有很多的優(yōu)點。當(dāng)人體硬組織由于外傷或腫瘤等原因缺損時，可選擇組織工程骨加以修復(fù)。但當(dāng)組織工程骨的厚度超過100～200 μm，必須在骨中形成血管才能為細(xì)胞提供氧及各種營養(yǎng)物質(zhì)并且運輸出代謝廢物［7］。因此，骨組織工程中種子細(xì)胞復(fù)合支架材料后，除了要有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，還需要成功建立血運循環(huán)。

圖4 qPCR分析目的基因轉(zhuǎn)染DPSCs后在成血管相關(guān)基因的表達

圖5 Western blot法檢測成血管相關(guān)蛋白的表達

VEGF是重要的促進血管生成因子，其被低氧激活后，對誘導(dǎo)血管的發(fā)生起關(guān)鍵作用。但是僅憑VEGF調(diào)控不能獲得穩(wěn)定且成熟的血管網(wǎng)［8］。HIF-1α是VEGF、SDF-1和Ang-2等成血管因子的上游調(diào)控基因，其具有更好的促血管生成作用［9］。低氧狀態(tài)下HIF-1α是血管發(fā)生的中心調(diào)控因子，調(diào)控其他生長因子的表達，直接參與血管發(fā)生的整個生物學(xué)過程［10］。

DPSCs作為種子細(xì)胞有4個優(yōu)點：①獲取方便：可從脫落的乳牙或者拔除的正畸牙、智齒的牙髓中分離得到；②細(xì)胞擴增后可再植于自體需要修復(fù)的組織中，從而避免了免疫抑制劑的使用［11］；③多向分化：DPSCs來源于間葉組織能夠分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元等［12］；④高度增殖：DPSCs的體外培養(yǎng)增殖速度是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的30～50倍，比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的克隆形成能力［13］；目前DPSCs的研究是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個熱點。

綜上所述，本實驗采用基因突變技術(shù)對HIF-1α基因進行區(qū)域突變，實現(xiàn)體外常氧條件下HIF-1α的穩(wěn)定表達并保持其高度活性。然后構(gòu)建Lenti-WT、Lenti-MT及Lenti-LacZ慢病毒載體，將上述載體成功轉(zhuǎn)染DPSCs后，體外檢測HIF-1α誘導(dǎo)DPSCs成血管因子（VEGF、SDF-1及Ang-2）的表達情況。初步證實了體外HIF-1α基因促進DPSCs成血管的作用，體外實驗結(jié)果為體內(nèi)動物實驗研究奠定了基礎(chǔ)。但是HIF-1α體外誘導(dǎo)DPSCs成血管分化的作用機制以及如何在體內(nèi)促進血管重建，還需要進一步的探索。

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On HIF-1α gene in promoting the formation of blood vessel by DPSCs in vitro

Deng Lifang，Zhu Youming，Wang Yinlong
（Stomatologic Hospital&College，Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the function of HIF-1α gene in promoting the differentiation of dental pulp stemcells（DPSCs）into blood vessels in vitro.Methods HIF-1α gene was mutated.The lentiviral vectors of Lenti-WT，Lenti-MT and Lenti-LacZ were constructed.The DPSCs were cultured and treated with three lentiviral vectors.Then the cells transduction efficiency and the expression of target gene at the level of mRNA and protein were detected.The influence on cell proliferation from lentiviral vectors was detected by MTT.After transduction，RNA and protein were extracted，the expression of angiogenic factor was detected by qPCR and Western blot.Results

HIF-1α；DPSCs；lentivirus transfection；angiogenesis

R 782

A

1000-1492（2016）08-1120-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.020.html

2016-05-04 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：31501103）

安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，

安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

鄧立方，女，碩士研究生；

王銀龍，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangylah@sina.com

MTT showed that there was no effect on DPSCs proliferation from lentiviral vectors.The results of qPCR and Western blot showed that HIF-1α gene was located in cell nucleus，expression of target gene was detected at both mRNA and protein level.After gene transduction，expression of angiogenic factor at the mRNA and protein levels was significantly increased（P＜0.05）.The formation of blood vessel in Lenti-MT and Lenti-WT groups was better than that in Lenti-LacZ group（P＜0.05），and the best result was found in Lenti-MT group（P＜0.05）.Conclusion

HIF-1α could promote DPSCs to form blood vessels.