自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用研究

汪應(yīng)紅，王 歡，左龍泉，王亞飛，黃 濤，范宇哲，李凡杰，王旭東，黃 艷

自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用研究

汪應(yīng)紅1，王 歡1，左龍泉1，王亞飛2，黃 濤2，范宇哲2，李凡杰2，王旭東2，黃 艷1

目的 研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)HSC凋亡的過程中自噬的發(fā)生與否及其作用，為肝纖維化的逆轉(zhuǎn)提供新的思路。方法 采用血小板衍生生長因子（PDGF-BB）誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6活化模型，在此基礎(chǔ)上，給予ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（TG）刺激24 h，Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)，MDC染色法觀察自噬小體的生成，觀察TG對HSC自噬的影響，進(jìn)一步采用3-MA阻斷自噬，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，觀察自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果 TG可以誘導(dǎo)HSC凋亡，伴隨著自噬的發(fā)生，用3-MA阻斷自噬可以增強(qiáng)TG誘導(dǎo)的HSC凋亡。結(jié)論 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)HSC凋亡的過程伴發(fā)自噬，阻斷自噬可以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；自噬；肝星狀細(xì)胞；肝纖維化；凋亡

肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是受到各種致病因子的侵襲所致的慢性炎癥性疾病，本質(zhì)是Collagen I等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相關(guān)主要成分的大量累積［1］。研究［2］表明靜止的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化增殖、大量過度分泌ECM是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要原因。因此，促進(jìn)活化的HSC發(fā)生凋亡是一種有效的肝纖維化防治方法。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊和錯誤折疊蛋白的累積、細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡失調(diào)［3-4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是最近幾年才被了解的一種新的凋亡途徑，與經(jīng)典的線粒體和死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯不同。目前已知由ERS激活凋亡的路徑有三條：①通過PERK/eIF2α路徑激活CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；②通過IRE1激活JNK信號通路下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，激活線粒體凋亡級聯(lián)反應(yīng)、上調(diào)促凋亡基因Bim；③ERS特有的Caspase-12的激活，進(jìn)一步激活凋亡啟動因子Caspase-9及凋亡執(zhí)行因子Caspase-3［5］。ERS通過減少未折疊或錯誤折疊蛋白沉積，激活促凋亡信號通路，被證實與許多疾病密切關(guān)聯(lián)［6］，前期研究［7］顯示ERS能夠抑制活化的HSC分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型膠原（CollagenⅠ，Col-Ⅰ），促進(jìn)活化的HSC凋亡。自噬是一個細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，使其進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合后形成自噬溶酶體的過程，通過自噬溶酶體降解其所包裹的內(nèi)容物，從而實現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝需求和某些細(xì)胞器的更新［8］。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制，在調(diào)節(jié)細(xì)胞幸存、死亡的過程中扮演著重要的角色。然而自噬相關(guān)基因如ATG5、Beclin1等過度上調(diào)亦能引起細(xì)胞死亡［9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)自噬［10-11］，該研究旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)HSC凋亡的過程中自噬的發(fā)生與否及其作用，為肝纖維化的恢復(fù)、逆轉(zhuǎn)提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株HSC-T6 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，為永生化大鼠HSC。

1.2 主要材料與試劑 DMEM培養(yǎng)液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；重組小鼠血小板衍生生長因子（PDGF-BB）（英國PEPROTECH公司）；毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、3-methyl adenine（3-MA）、MDC染料、DMSO（美國Sigma公司）；細(xì)胞組織裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF（上海碧云天公司）；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、α-SMA、Col-I、GRP78、CHOP、β-actin一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；LC3B一抗（武漢伊萊特公司）；Caspase-12一抗（美國CST公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（中國BestBio公司）。

1.3 主要儀器 NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Western blot設(shè)備（美國Biorad公司）；Sigma3-16K高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；FA2004型電子天平（上海精天天平廠）；4℃、-20℃低溫冰箱（日本三洋公司）；GSG2000Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)（珠海黑馬公司）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）。

1.4 方法

1.4.1 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 HSC-T6細(xì)胞使用含有10%四季青胎牛血清及100 IU/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的低糖培養(yǎng)基（1 000 mg/L），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，或接種于培養(yǎng)瓶、6孔板。

1.4.2 Western blot法檢測HSC中GRP78、CHOP、Caspase-12、LC3B、α-SMA和Col-I蛋白表達(dá) 課題組前期研究［6］選出最適PDGF濃度（20 ng/ml）和TG濃度（1 μmol/L）、3-MA濃度（5 mmol/L）和作用時間（24 h），分為對照組、PDGF組、PDGF+TG組、PDGF+TG+3-MA組，同時給藥刺激24 h后，收集細(xì)胞蛋白檢測GRP78、CHOP、Caspase-12、LC3B、α-SMA和Col-I的表達(dá)；具體步驟如下：收集各組細(xì)胞，加蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1配成），冰上搖晃裂解，每隔10 min晃動下培養(yǎng)瓶或6孔板，使裂解液充分鋪滿，裂解30 min。吸取裂解液于1.5 ml EP管中，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液。用定量儀對蛋白樣品定量，調(diào)整各組蛋白濃度一致，后加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。膠配好后，每孔上樣20 μl總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜置于室溫下用5%脫脂奶粉（TBST新鮮配制）封閉3 h，后用TBST清洗3遍，每遍15 min，用待檢測蛋白的一抗孵育，放于4℃冰箱過夜。次日，膜用TBST清洗后，用與一抗種屬相匹配的的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3遍，每遍15 min，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.4.3 MDC染色法檢測HSC-T6細(xì)胞自噬水平

細(xì)胞分組及處理同1.4.2，染色前接種于含蓋玻片的6孔板內(nèi)。處理時間完成后，棄培養(yǎng)基，用1× PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3遍，每遍5 min，再往每孔分別加入1 ml 1×PBS緩沖液及1 μl配置好的100 mmol/L MDC儲存液，形成100 μmol/L的MDC工作液，錫箔紙包裹6孔板，置于培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。最后吸干含MDC的PBS溶液，用干凈的1 ×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2遍，每遍5 mim，然后將蓋玻片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行自噬小體的觀察。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分組及處理同1.4.2，消化收集各組細(xì)胞，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，用400 μl 1×Binding Buffer懸浮HSC-T6細(xì)胞，濃度大致為1×106個/ml，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕柔混勻后于2～8℃條件下避光孵育15 min，后加入10 μl PI后輕輕混勻于2～8℃條件下避光孵育5 min，處理完成后在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。所有檢驗為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TG對PDGF活化的HSC內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果見圖1，GRP78、CHOP、c-Caspase-12蛋白的表達(dá)4組總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=129.483，P＜0.001；F= 95.739，P＜0.001；F=120.624，P＜0.001）。TG能增加PDGF活化的HSC內(nèi)GRP78、CHOP、c-Caspase-12的表達(dá)，促進(jìn)HSC凋亡，與PDGF組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與PDGF+TG組比較，3-MA能減少GRP78的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白CHOP、c-Caspase-12的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 Western blot法檢測ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2 HSC自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果見圖2，LC3B的表達(dá)4組總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.148，P=0.004）。TG能顯著增強(qiáng)HSC自噬的強(qiáng)度，與PDGF組比較，LC3BⅡ的表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而3-MA能阻斷自噬，與PDGF+TG組比較，相應(yīng)的蛋白LC3BⅡ表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果見圖3，α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達(dá)4組總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=44.889，P＜0.001；F=30.223，P＜0.001）。PDGF能明顯活化HSC，PDGF組α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達(dá)較對照組增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TG能顯著降低HSC內(nèi)α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達(dá)，與PDGF組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而3-MA能進(jìn)一步抑制α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達(dá)，與PDG+TGF組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot法檢測α-SMA和Col-Ⅰ的表達(dá)

2.4 MDC染色觀察HSC自噬小體的生成 MDC染色結(jié)果見圖4，對照組和PDGF組熒光強(qiáng)度較弱，表明自噬程度較低，而PDGF+TG組較PDGF組熒光強(qiáng)度較高且在細(xì)胞質(zhì)可見明顯聚集的熒光顆粒，在加3-MA阻斷自噬后，PDGF+TG+3-MA組熒光強(qiáng)度減弱。以上結(jié)果提示：TG可誘發(fā)HSC自噬，而3-MA能阻斷TG誘發(fā)的HSC自噬。

圖4 熒光顯微鏡觀察MDC染色后HSC中自噬泡分布情況×400

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率見圖5，4組凋亡率總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=234.251，P＜0.001）。對照組和PDGF組凋亡率較低，PDGF+TG組凋亡率較PDGF組明顯升高，與PDGF組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而PDGF+TG+3-MA組凋亡率較PDGF+TG組進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明TG可以促進(jìn)HSC凋亡，而3-MA可增強(qiáng)TG誘導(dǎo)的HSC凋亡。

3 討論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

TG是Ca2+-ATP酶選擇性抑制劑，通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道促進(jìn)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高而誘導(dǎo)ERS，TG是一種誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性經(jīng)典工具藥［12］。課題組前期研究［7］表明TG可以促進(jìn)HSC凋亡，有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。本研究顯示在TG誘導(dǎo)HSC凋亡的過程中伴隨著自噬的發(fā)生，可能通過Ca2+激活鈣調(diào)蛋白依賴激酶-β，進(jìn)而使5′-磷酸腺苷激活蛋白激酶磷酸化增多，從而抑制雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致自噬上調(diào)［13］。具體機(jī)制有待于下一步實驗證實。自噬參與體內(nèi)各種病理生理過程，對機(jī)體反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用［14］，就肝纖維化而言，自噬可以通過激活肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化，通過保護(hù)肝細(xì)胞減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生減輕肝纖維化，自噬可降解受損的蛋白以及減少DNA的損傷等途徑來保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡［15］，本研究結(jié)果顯示：自噬對于在ERS誘導(dǎo)的HSC凋亡過程中起著保護(hù)作用，自噬可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC凋亡，ERS誘導(dǎo)的自噬可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，清除聚集過多的蛋白質(zhì)，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遭受的強(qiáng)烈而持久的刺激，保護(hù)細(xì)胞，可以抑制毒胡蘿卜素或衣霉素引起的細(xì)胞死亡。3-MA是自噬的抑制劑，通過抑制Ⅲ型PI3K，干擾自噬隔離膜的形成，本研究結(jié)果表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型基礎(chǔ)上用3-MA阻斷自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白CHOP和Caspase-12表達(dá)增多，HSC活化增殖相關(guān)蛋白α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)減少，HSC凋亡明顯增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實了3-MA增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC凋亡。綜上所述，本研究表明，自噬可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC凋亡，在肝纖維化恢復(fù)期，如果能通過阻斷自噬而靶向誘導(dǎo)HSC凋亡，將能為抗肝纖維化提供新的靶點，為新藥研發(fā)提供新的思路。

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Role of autophagy in hepatic stellate cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress

Wang Yinghong，Wang Huan，Zuo Longquan，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To explore whether autophagy occurs or not and its effect during endoplasmic rediculum stress induced by TG，provides new train of thought for reversal of hepatic fibrosis.Methods Platelet-derived growth factor（PDGF-BB）was used to induce rat hepatic stellate cell（HSC-T6）activation model，on this basis，ERS inducer poison carotene（TG）was given to stimulate cells for 24 h.The autophagy related LC3B protein expression was detected by Western blot and the formation of autophagosome was detected by the MDC staining so as to observe the effect of TG on HSC autophagy.The 3-MA was used to block autophagy，each cell apoptosis rate was detected by flow cytometry，the role of autophagy in hepatic stellate cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress was observed.Results HSC apoptosis was induced by TG，accompanied by the occurrence of autophagy，while 3-MA blocked autophagy and enhanced the HSC apoptosis induced by TG.Conclusion HSC apoptosis can be induced by TG with the occurrence of autophagy.3-MA can enhance the HSC apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress.

ERS；autophagy；hepatic stellate cells；liver fibrosis；apoptosis

R 966

A

1000-1492（2016）08-1115-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.018.html

2016-04-19 接收

安徽省學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人選課題（編號：2015H040）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目（編號：gxyqZD2016049）；安徽醫(yī)科大學(xué)“青年拔尖人才支持計劃”；安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)（“5+3”一體化）專業(yè)學(xué)生“早期接觸科研”訓(xùn)練計劃項目（編號：2015-ZQKY-46）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理教研室、2第二臨

床醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

汪應(yīng)紅，男，碩士研究生；黃 艷，女，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydhy@126. com