韋英亮，潘楊桂，張思敏

（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西 南寧 530022）

HSQC-TOCSY技術(shù)對羅漢果甜苷類化合物結(jié)構(gòu)解析的應(yīng)用

韋英亮，潘楊桂，張思敏

（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西 南寧 530022）

探討了采用HSQC-TOCSY技術(shù)，并結(jié)合1H-1H COSY、HSQC、HMBC等二維譜技術(shù)對羅漢果甜苷V（Mogroside V）的13C、1H化學(xué)位移進行歸屬的方法。結(jié)合1H-1H COSY、HSQC、HMBC等二維譜技術(shù)，HSQC-TOCSY技術(shù)可以方便快捷地對羅漢果甜苷類化合物的13C、1H化學(xué)位移進行明確歸屬。

HSQC-TOCSY；羅漢果甜苷；結(jié)構(gòu)解析；2D NMR

二維HSQC-TOCSY（Heteronuclear Single Quantum Coherence-Total Correaltion Spectroscopy）實驗是一種混合反演實驗，由初始的HSQC（heteronuclear singular quantum correlation）脈 沖 和 隨 后 的TOCSY（total correlation spectroscopy）混合脈沖序列組成。同核TOCSY所用的脈沖序列為90°Φ-t1-tm檢測［1］。根據(jù)同核Hartmann Hahn機理，TOCOSY實驗中的混合脈沖序列也可用于異核接力相關(guān)試驗，混合時間的長短決定相關(guān)傳遞的鍵的數(shù)目?；旌掀诳梢允菃蝹€脈沖，也可以是組合脈沖。在采集之前插入一個各向同性的混合序列（MLEV、WALTZ或DIPSI）［2］。第一步，通過1J（CH）磁化首先從X核（13C或者15N）轉(zhuǎn)移至直接鍵合的質(zhì)子核。第二步，通過J（HH），該磁化逐步貫穿整個耦合的核自旋網(wǎng)絡(luò)。該實驗在任何配備反式探頭的光譜儀都容易實現(xiàn)。

應(yīng)用HSQC-TOCSY技術(shù)，只要自旋系統(tǒng)內(nèi)有一個氫和一個碳的NMR信號與其他系統(tǒng)不重疊，就有可能將各個不同的自旋系統(tǒng)區(qū)別開，并對譜線進行歸屬。當(dāng)復(fù)雜分子具有若干獨立的自旋系統(tǒng)而在某些區(qū)域里譜峰嚴重重疊時，該方法可較好地分辨各個不同自旋系統(tǒng)內(nèi)的氫核。羅漢果甜苷類化合物甙元部分多為四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)，而糖基部分往往具有多個糖單元，由于各個自旋系統(tǒng)間的化學(xué)位移接近，這類化合物的NMR圖譜、譜峰重疊，難以解析，給結(jié)構(gòu)鑒定帶來了很大的困難。之前羅漢果甜苷糖基部分結(jié)構(gòu)確定常用NOE差譜［3-5］，此類化合物的13C、1H化學(xué)位移尚未得到明確歸屬。

1 實驗部分

1.1 樣品

羅漢果甜苷V （Mogroside V type structure），是從葫蘆科植物羅漢果的新鮮果實（Siraitia grosvenorii）中分離得到的葫蘆烷型四環(huán)三萜皂甙，分子式為C60H102O29，結(jié)構(gòu)式為羅漢果醇-3-O-（β-D-葡萄吡喃糖基（1-6）-β-D-葡萄吡喃糖基）-24-O-（β-D-葡萄糖吡喃糖基（1-2）-β-D-葡萄糖吡喃糖基（1-6）-β-D-葡萄糖吡喃糖基，糖基部分由5個葡萄吡喃糖基組成。分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 羅漢果甜苷V結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of Mogroside V

1.2 核磁共振試驗

Bruker AV-600超導(dǎo)核磁共振儀，600.13MHz（1H）和150.95MHz（13C），將待測樣品溶解在氘代吡啶，以四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標(biāo)，于室溫下用Φ5mm反相探頭（TXI）進行測定。

HSQC-TOCSY實驗:采用的數(shù)據(jù)矩陣為512× 1024，F(xiàn)1和F2維均采用余弦窗函數(shù)，零填充至1024×1024進行FT變換，常規(guī)2D圖譜相敏方式相位校正。混合時間采用120ms，每個t1累加64次。

2 結(jié)果與討論

利用1HNMR、13CNMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY初步確定了基本結(jié)構(gòu)，但是其糖部分無法正確歸屬CH信號，因而測試HSQC-TOCSY譜。

2.11HNMR

1HNMR譜圖顯示，低場區(qū)觀察到5個糖的端基質(zhì)子信號δ5.52（1H，d，J=7.74Hz）、δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）、δ4.92（1H，d，J=7.26Hz）、δ4.87（1H，d，J=7.68Hz）、δ4.82（1H，d，J=7.74Hz），耦合常數(shù)顯示5個糖基構(gòu)型均為β構(gòu)型；1個雙鍵質(zhì)子信號δ5.48（1H，d，J=5.58Hz）；δ4.57～δ3.91為環(huán)質(zhì)子信號，共顯示有30個質(zhì)子信號。但是δ4.57～δ3.91信號重疊比較嚴重，不易區(qū)分；δ3.76～δ2.20為甙元環(huán)上各質(zhì)子信號，信號分離效果好，沒有相互重疊，但是δ2.15～δ1.61信號又產(chǎn)生重疊。高場區(qū)觀察到6個甲基質(zhì)子信號δ1.52（3H，s）、δ1.47（3H，s）、δ1.34（6H，s）、δ1.10（3H，s）、δ1.09（3H，s）、δ0.92（6H，d，J=8.28 Hz）。

2.213CNMR和 DEPT （Distortionless ehancement by Polarization Transfer）

13CNMR譜圖顯示60個碳信號。雙鍵碳信號δ144.33（C）和δ118.39（CH）分別歸屬于甙元的C5和C6位碳信號；δ106.96（CH）、δ105.36（CH）、δ105.32（CH）、δ104.80（CH）、δ103.73（CH）為5個糖的端基信號；δ82.00～δ62.51之間有25個糖環(huán)連氧碳信號，其中δ70.23（CH2）和δ70.13（CH2）顯示糖基之間存在2個6-1連接信號，δ82.00（CH）顯示存在1個2-1連接信號；δ87.48（CH）和δ92.27（CH）是甙元苷化位置特征，分別歸屬于甙元的C3和C24位碳信號。

2.31H-1H COSY （1H-1H correlation spectroscopy）

從δ5.52（1H，d，J=7.74Hz）與δ4.11相 關(guān)，δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）與δ4.07相關(guān)，δ4.92（1H，d，J=7.26Hz）與δ4.21相關(guān)，δ4.87（1H，d，J=7.68Hz）與δ4.04相關(guān)，δ4.82（1H，d，J=7.74Hz）與δ3.93相關(guān)，初步確定5個糖環(huán)1，2位化學(xué)位移，由于各個糖環(huán)上質(zhì)子信號重疊較為嚴重，要進一步確定連接順序較為困難。

2.4 HSQC（Heteronuclear Single Quantum Coherence）

借助HSQC中 5個糖的端基質(zhì)子信號，δ5.52（1H，d，J=7.74Hz）與δ105.36（CH）相關(guān)，δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）與δ105.32（CH）相 關(guān)，δ4.92（1H，d，J=7.26Hz）與δ103.73（CH）相關(guān)，δ4.87（1H，d，J=7.68Hz）與δ104.80（CH）相 關(guān)，δ4.82（1H，d，J=7.74Hz）與δ106.96（CH）相關(guān)。烯氫δ5.48（1H，d，J=7.5.58Hz）與烯碳δ118.38（CH）相關(guān)，δ4.91（1H，d，J=8.85Hz）、δ4.78（1H，d，J=11.63Hz）、δ4.36（4H，m）以及δ3.98（3H，m）與δ70.23（CH2）和δ70.13（CH2）相 關(guān)；δ4.53（3H，m）、δ4.36（4H，m） 與 δ63.52CH2）、δ62.69CH2）、δ62.51CH2）相關(guān)；δ4.11與δ72.45相 關(guān)，δ4.07與δ71.42相關(guān)，δ4.21與δ82.00相關(guān)，δ4.04與δ75.21相關(guān)，δ3.93與δ78.00相關(guān)。

2.5 HMBC（Heteronuclear Multiple Bond Correlation）

δ5.51（1H，d，J=7.74Hz）與δ82.00（CH）遠程相關(guān)，與碳譜存在1個2-1連接信號［δ82.00（CH）］相印證。δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）與δ70.13（CH2）遠程相關(guān)，與碳譜存在2個6-1連接信號其中1個為δ70.13（CH2）相印證，同時端基質(zhì)子δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）還與環(huán)上3位碳δ78.68遠程相關(guān)。端基質(zhì)子δ4.92（1H，d，J=7.74Hz）與24位碳原子δ92.27遠程相關(guān)。δ4.87（1H，d，J=7.68Hz）與δ70.23（CH2）遠程相關(guān)，印證了碳譜另外的1個6-1連接信號δ4.82（1H，d，J=7.74Hz）與3位碳δ87.48（CH）遠程相關(guān)。

利 用1HNMR、13CNMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等技術(shù)初步確定了基本結(jié)構(gòu)，但是其5個葡萄糖分子如何連接與分配，以及其環(huán)上的CH信號無法正確歸屬，因而測試HSQC-TOCSY譜。

2.6 HSQC-TOCSY（Heteronuclear Single Quantum Coherence-Total Correaltion Spectroscopy）

2.6.1 3-位取代糖環(huán)結(jié)構(gòu)分析

HSQC-TOCSY譜中，以甙元C-3為起點，內(nèi)側(cè)糖端基δ106.96與端基氫δ4.82（1H，d，J=7.74Hz）的相關(guān)峰出發(fā)，沿碳譜和氫譜方向做直線從低場往高場。碳譜方向有δ 106.96、δ78.42、δ77.21、δ75.20、δ70.23；由此得出3位兩個葡萄糖以6-1方式進行連接。氫譜方向有δ4.82、δ4.19、δ4.08、δ3.93。末端糖端基δ105.32與端基氫δ5.17（1H，d，J=7.74Hz）的相關(guān)峰出發(fā)，沿碳譜和氫譜方向做直線從低場往高場，碳譜方向有δ 105.32、δ78.50、δ78.21、δ75.92、δ71.64；氫譜方向有δ5.17、δ4.26、δ4.18、δ3.96。

2.6.2 24-位取代糖環(huán)結(jié)構(gòu)分析

HSQC-TOCSY譜中，以甙元C-24為起點，內(nèi)側(cè)糖端基δ103.7（Glc`-C-1）與端基氫δ4.92（1H，d，J=7.62Hz，Glc`-H-1）的相關(guān)峰出發(fā)，沿碳譜和氫譜方向做直線從低場往高場，碳譜方向有δ103.73、δ82.00、δ78.68、δ77.94、δ70.13，由此可以確定24位末端兩個葡萄糖的連接順序分別為2-1和6-1方式；氫譜方向有δ4.26、δ2、δ3.98。末端（6-1）糖端基δ105.36與端基氫δ5.52（1H，d，J=7.74Hz）的相關(guān)峰出發(fā)沿碳譜和氫譜方向做直線從低場往高場，碳譜方向有δ105.36、δ78.46、δ78.32、δ76.39、δ72.45，氫譜方向有δ4.27、δ4.08。末端糖端基（2-1）δ104.80與端基氫δ4.86（1H，d，J=7.62Hz，Glc`-H-1）的相關(guān)峰出發(fā)，沿碳譜和氫譜方向做直線從低場往高場，碳譜方向有δ104.80、δ78.32、δ78.00、δ75.32、δ71.42，氫譜方向有δ4.27、δ4.08。羅漢果甜苷V 糖環(huán)部分HSQC-TOCSY譜見圖2，糖環(huán)HSQC-TOCSY耦合關(guān)系見表1，13C、1H化學(xué)位移歸屬見表2。

圖2 羅漢果甜苷V 糖環(huán)部分HSQC-TOCSY譜Fig.2 The HSQC-TOCSY spectrum of Mogroside V glycosyl

表1 羅漢果甜苷V糖基HSQC-TOCSY耦合關(guān)系Table1 HSQC-TOCSY coupling relationship spetrum of Mogroside V glycosyl

表2 羅漢果甜苷V1H、13C化學(xué)位移歸屬Table 11H，13C chemical shift assignment to Mogroside V

甙元部分13CNMR1HNMR化學(xué)位移δC/×10-6化學(xué)位移δH/×10-613CNMR1HNMR 糖體部分 化學(xué)位移δC/×10-6化學(xué)位移δH/×10-613 47.42 /1 103.73 4.92，1H，d，7.26 14 49.66 / 2 82.00 4.23，1H，m 15 34.51 1.13，1H，m；1.06，1H，m 3 78.68 4.27，1H，m 16 28.53 2.14，1H，m；1.52，1H，m 4 72.80 4.13，1H，m 17 50.96 1.80，1H，m 5 77.94 4.12，1H，m 18 17.10 0.91，3H，s 6 70.13 4.91，1H，d，8.64；4.35，1H，m 19 27.02 1.34，3H，s C24-O-Glc（內(nèi)側(cè)）1 105.36 5.52，1H，d，7.74 20 36.36 1.52，1H，m 2 76.39 4.12，1H，m 21 19.08 1.10，3H 3 78.46 4.27，1H，m 22 33.23 1.92，1H，m；1.80，1H，m 4 72.45 4.15，1H，m 23 29.43 2.14，2H，m 5 78.32 3.98，1H，m 24 92.27 3.77，1H，d，9.18 6 63.52 4.57，1H，m；4.34，1H，m 25 72.80 / C24-O-Glc（末端6-1）1 104.80 4.86，1H，d，7.62 26 24.56 1.47，3H 2 75.32 4.07，1H，m 27 26.28 1.35，3H 3 78.32 3.95，1H，m 28 19.40 1.10，3H 4 71.42 4.26，1H，m 29 27.59 1.10，3H 5 78.00 4.07，1H，m 30 26.28 1.52，3H 6 62.51 4.53，1H，m；4.36，1H，m C24-O-Glc（末端2-1）

3 結(jié)論

羅漢果甜苷類化合物多為含多個糖的化合物，且糖的種類多為單一的葡萄糖，因此糖質(zhì)子化學(xué)位移重疊特別嚴重，但是每個糖單元的端基氫和端基碳的NMR信號與其他系統(tǒng)不重疊，應(yīng)用HSQCTOCSY技術(shù)，就能相對簡單地將各個不同的自旋系統(tǒng)區(qū)別開，并對譜線進行歸屬。但由于TOCSY實驗不能揭示標(biāo)量偶合核之間磁矢量的傳遞過程，得到的譜圖不能區(qū)分直接或接力兩種相關(guān)峰［6］，因此，有必要測定13C-1H相關(guān)譜（HSQC或HMBC），對比兩譜可以區(qū)分直接或接力兩種相關(guān)峰。應(yīng)用HSQCTOCSY，再結(jié)合1H-1HCOSY、HSQC和HMBC實驗，就可以對每個自旋系統(tǒng)內(nèi)的氫核和碳核進行全歸屬［7］。HSQC-TOCSY技術(shù)為確定單個糖環(huán)內(nèi)質(zhì)子的化學(xué)位移提供了更多信息，能有效解決一維譜圖中碳氫峰交叉重疊的問題，運用HSQC-TOCSY技術(shù)結(jié)合其他2D NMR技術(shù)，能夠較好地對羅漢果甜苷類化合物進行1H、13C化學(xué)位移明確歸屬。由于實驗HSQC-TOCSY在任何配備反式探頭的光譜儀就能實現(xiàn)，因此HSQC-TOCSY技術(shù)作為解決獨立直旋系統(tǒng)中復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的有力手段，將會被廣泛使用。

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Application of HSQC-TOCSY Technology to Structure Analysis of Mogrosides

WEI Ying-liang， PAN Yang-gui， ZHANG Si-min
（Guangxi Zhuang Autonomous Region Analysis and Tes ting Research Center， Nanning 530022， China）

Combined with H-H cosy， HSQC， HMBC two-dimensional spectrum technology， HSQC-TOCSY technology were used to explore the13C and1H chemical shifts of the mogroside V. The13C，1H chemical shifts of mogrosides had clear attribution by HSQCTOCSY technology， two-dimensional H-H COSY， HSQC and HMBC spectrum technology.

HSQC-TOCSY； mogroside V； structure analysis； 2D NMR

環(huán)保與三廢利用

O 652

A

1671-9905（2016）10-0049-04

廣西壯族自治區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資助（2013ACZ07）

韋英亮（1982-），女，工程師，主要研究方向:有機分析。E-mail:wyl3903895@163.com.

2016-08-01