生防菌Hhs.015防止蘋(píng)果腐爛菌侵染寄主的組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)研究

范東穎，趙玲云，黃麗麗，顏　霞

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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生防菌Hhs.015防止蘋(píng)果腐爛菌侵染寄主的組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)研究

范東穎a,b，趙玲云a,b，黃麗麗b,c，顏霞a,b

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 對(duì)生防菌Hhs.015抑制蘋(píng)果腐爛菌(Valsamali)在寄主中侵入、定殖、擴(kuò)展的現(xiàn)象進(jìn)行組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)觀察，闡釋生防菌Hhs.015對(duì)蘋(píng)果腐爛病的防治機(jī)理?！痉椒ā?利用掃描電鏡技術(shù)觀察生防菌Hhs.015侵入寄主的方式，對(duì)Hhs.015作用下寄主體內(nèi)的蘋(píng)果腐爛菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行透射電鏡觀察，并用熒光顯微鏡觀察寄主胼胝質(zhì)的發(fā)生與積累情況。【結(jié)果】 Hhs.015通過(guò)樹(shù)皮皮孔、毛孔等自然孔口侵入樹(shù)皮，與蘋(píng)果腐爛菌的侵入方式一致，可能在空間位點(diǎn)上與病原菌存在競(jìng)爭(zhēng)作用； Hhs.015作用下寄主體內(nèi)的蘋(píng)果腐爛菌菌體細(xì)胞壁不均且加厚、質(zhì)壁分離、細(xì)胞質(zhì)凝縮固集并形成大液泡，還能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生胼胝質(zhì)積累等抗性反應(yīng)，對(duì)蘋(píng)果腐爛菌菌絲的生長(zhǎng)與侵染擴(kuò)展產(chǎn)生了明顯的抑制作用?！窘Y(jié)論】 生防菌Hhs.015可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、抗生溶菌、誘導(dǎo)抗性等綜合作用來(lái)防止蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌對(duì)寄主的侵染。

生防菌Hhs.015；蘋(píng)果腐爛菌；空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)；抗菌作用；胼胝質(zhì)積累

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病主要由蘋(píng)果腐爛菌(Valsamali)侵染果樹(shù)枝干引起[1]，輕者造成主枝、主干枯死, 重者全株枯死, 甚至毀園[2]。該病在我國(guó)各大蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，全國(guó)平均病株率高達(dá)70%，對(duì)我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)量和質(zhì)量均造成了嚴(yán)重影響[3-4]。目前主要使用化學(xué)藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病進(jìn)行防治[5]，但隨著人們對(duì)化學(xué)藥劑殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題的關(guān)注，生物防治因其無(wú)毒害、無(wú)污染、不易導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn),受到越來(lái)越多的重視與研究[6-7]。

生防機(jī)理主要有競(jìng)爭(zhēng)作用、抗生溶菌作用、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)抗性等方面[8-9]。競(jìng)爭(zhēng)作用，即生存空間和營(yíng)養(yǎng)資源競(jìng)爭(zhēng)，有些生防菌可以通過(guò)占領(lǐng)其合適的侵入定殖位點(diǎn)，吸收寄主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而排斥病原菌的侵染定殖[10]。如郭榮君等[11]研究表明，芽孢桿菌BH1可以在大豆根部短期定殖,營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)是其抑制大豆根腐病的一個(gè)重要方面。對(duì)抗生溶菌作用的研究主要集中在放線菌上，因?yàn)榉啪€菌能產(chǎn)生多種抗生素、胞外酶等天然產(chǎn)物來(lái)拮抗病原菌[12]，如Barger等[13]研究發(fā)現(xiàn)Streptomycesssp.Mg1能使共培養(yǎng)的芽孢桿菌發(fā)生溶菌作用。誘導(dǎo)抗性是指植物在面對(duì)生物脅迫時(shí)會(huì)被誘導(dǎo)發(fā)生一系列的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，其中胼胝質(zhì)積累是其防御病原菌入侵的初始反應(yīng)之一[14]。

近些年來(lái)，利用植物內(nèi)生放線菌防治植物病害在生物防治領(lǐng)域越來(lái)越受到重視[15-17],楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis)Hhs.015是一株對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病有很好防治效果的植物內(nèi)生放線菌[18-19]，其生防機(jī)理有待深入研究。前期研究表明Hhs.015菌體可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和葡聚糖酶[20]，皿內(nèi)對(duì)峙條件下透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果腐爛菌(V.mali)菌絲細(xì)胞壁破裂、細(xì)胞內(nèi)線粒體膨大聚集并出現(xiàn)大液泡、細(xì)胞核降解等拮抗現(xiàn)象(未發(fā)表)，但還沒(méi)有對(duì)Hhs.015在寄主體內(nèi)的侵入定殖、抑菌作用及誘導(dǎo)抗性進(jìn)行系統(tǒng)研究。因此，本研究擬對(duì)Hhs.015在寄主體內(nèi)的侵入定殖、Hhs.015作用下寄主體內(nèi)的蘋(píng)果腐爛菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及其對(duì)寄主胼胝質(zhì)積累的影響進(jìn)行組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)觀察，從而進(jìn)一步闡釋楊凌糖絲菌Hhs.015對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的生防機(jī)理，為蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治奠定理論與實(shí)踐指導(dǎo)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株:蘋(píng)果腐爛菌(Valsamali)強(qiáng)致病力菌株03-8及楊凌糖絲菌Hhs.015的原始菌株，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試植物:2年生富士蘋(píng)果枝條取自陜西省楊凌區(qū)椒生村蘋(píng)果果園的健康樹(shù)體上。

1.2方法

1.2.1菌體活化與培養(yǎng)將保存在-80 ℃的03-8原始菌株接種在PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)進(jìn)行活化。在長(zhǎng)好的菌落邊緣打取直徑7 mm的菌餅置于新的PDA平板上，30 ℃暗培養(yǎng)3 d，備用。將Hhs.015在高氏一號(hào)平板上劃線，28 ℃暗培養(yǎng)5 d，在產(chǎn)孢充分處打取菌餅(直徑7 mm)，置于黃豆粉液體培養(yǎng)基中，6個(gè)菌餅/100 mL，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，備用。

1.2.2枝條處理將新采摘的粗細(xì)一致的2年生富士蘋(píng)果枝條剪成30 cm長(zhǎng)的小段，用自來(lái)水清洗干凈后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的次氯酸鈉溶液中消毒30 min，用無(wú)菌水沖洗，晾干后用石蠟封住其形態(tài)學(xué)上端。再用電烙鐵燙傷枝條樹(shù)皮后在燙傷處接種03-8菌餅，在接種點(diǎn)上方2 cm處纏裹濕的無(wú)菌脫脂棉，并用保鮮膜密封保濕。將接種好的枝條插在提前滅過(guò)菌的濕沙土中，48 h后去除菌餅、脫脂棉及保鮮膜，于室溫下培養(yǎng)使其充分發(fā)病。

1.2.3試驗(yàn)處理在枝條上形成的明顯病斑處涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液(試驗(yàn)組)和空白黃豆粉液體培養(yǎng)基(對(duì)照組)。于涂抹生防菌發(fā)酵液后10 h及4，6，7和9 d，分別在病健交界處取樣用于掃描電鏡觀察，于涂抹生防菌發(fā)酵液后11，16，21 d分別在病健交界處取樣用于透射電鏡觀察;另外將健康枝條用電烙鐵燙傷后接種空白PDA培養(yǎng)基餅并涂抹空白黃豆粉液體培養(yǎng)基，在相同時(shí)間進(jìn)行取樣，設(shè)為陰性對(duì)照；將健康枝條用電烙鐵燙傷后接種空白PDA培養(yǎng)基餅并涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液，在相同時(shí)間進(jìn)行取樣，設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4寄主中Hhs.015菌體及其作用下的蘋(píng)果腐爛菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察將1.2.3中制備好的樣品用半薄切片機(jī)(RM2265)切成1 μm厚的半薄切片，將其置于載玻片上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%苯胺藍(lán)染色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察是否切到病健交界處樹(shù)皮樣品中的蘋(píng)果腐爛菌菌體。待切到菌體后用鉆石刀切取超薄切片，并將超薄切片用醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛進(jìn)行雙染色，在HT7700透射電鏡下對(duì)Hhs.015菌體及其作用下蘋(píng)果腐爛菌菌絲的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.2.5寄主胼胝質(zhì)積累的組織學(xué)觀察將1.2.3中制備好的樣品用半薄切片機(jī)(RM2265)切成700 nm厚的半薄切片，將其置于載玻片上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%苯胺藍(lán)染色后，用多功能顯微鏡(SZX-16型)在紫外光激發(fā)下觀察胼胝質(zhì)的積累情況。

1.2.6掃描電鏡樣品的制備將樹(shù)皮樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%戊二醛中，4 ℃過(guò)夜固定，用0.1 mol/L PBS漂洗5～6次后依次用乙醇、丙酮進(jìn)行梯度脫水，再用乙酸異戊酯置換2次，CO2干燥噴金后用掃描電子顯微鏡(JSM6360)觀察。

1.2.7透射電鏡樣品的制備參照康振生等[21]的方法制備透射電鏡樣品。

2　結(jié)果與分析

2.1生防菌Hhs.015在寄主體內(nèi)的侵入定殖

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病斑涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液10 h后，在樹(shù)皮自然孔口處可以看到Hhs.015菌絲堆積，但不能看出其生長(zhǎng)延伸(圖1-B)。涂抹生防發(fā)酵液4～9 d后，在樹(shù)皮自然孔口處有大量菌絲聚集，并有明顯的菌絲生長(zhǎng)及向樹(shù)皮內(nèi)部延伸的現(xiàn)象(圖1-C、E、F、G箭頭所示)。即Hhs.015能夠快速吸附在樹(shù)皮表面，并通過(guò)樹(shù)皮皮孔、毛孔等自然孔口侵入。

圖 1　生防菌Hhs.015菌絲侵入樹(shù)皮表面的方式 A.對(duì)照組皮孔；B-C，E-G為試驗(yàn)組，分別為涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液10 h及4，6，7，9 d后的樣品； D.對(duì)照組樹(shù)皮毛孔。白色箭頭所示為Hhs.015菌絲侵入樹(shù)皮位點(diǎn)Fig.1　Invasion through bark by hyphae of biocontrol strain Hhs.015 A.Normal lenticel;B-C and E-G.Treated for 10 h，4 d，6 d，7 d，9 d after fermentation broth of Hhs.015 smeared, respectively;D.Normal pores.The sites of bark were invaded by Hhs.015,as indicated by white arrows

2.2Hhs.015作用下的蘋(píng)果腐爛菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

由圖2可見(jiàn)，病健交界處樹(shù)皮樣品中的蘋(píng)果腐爛菌菌體細(xì)胞壁厚度均勻，細(xì)胞質(zhì)成分均一，線粒體與細(xì)胞核等細(xì)胞器形態(tài)正常，菌體多位于寄主細(xì)胞內(nèi)部或已將寄主細(xì)胞分解(圖2-B、C)。涂抹Hhs.015發(fā)酵液后，蘋(píng)果腐爛菌菌體細(xì)胞壁不均且出現(xiàn)加厚現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)凝縮固集，形成許多大的空液泡，未見(jiàn)線粒體與細(xì)胞核等細(xì)胞器(圖2-D、F)，菌體多出現(xiàn)在寄主細(xì)胞間隙，并且與菌體緊鄰的寄主細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象(圖2-E)。

2.3寄主胼胝質(zhì)積累發(fā)生現(xiàn)象的觀察

由圖3可以看出，樹(shù)皮樣品中的胼胝質(zhì)主要位于篩管部位。涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液11 d后，與對(duì)照組(圖3-A)相比，篩管部位的胼胝質(zhì)無(wú)增加與積累現(xiàn)象(圖3-B)；涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液16 d后，在水平方向上篩管細(xì)胞橫切面相鄰處出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，即胼胝質(zhì)積累增強(qiáng)(圖3-D)；涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液21 d后，只在篩管橫切面的個(gè)別細(xì)胞邊緣處出現(xiàn)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象(圖3-G),比16 d的胼胝質(zhì)積累現(xiàn)象明顯減弱。該胼胝質(zhì)的積累發(fā)生和消減現(xiàn)象與前期對(duì)胼胝質(zhì)合成酶相關(guān)基因的定量檢測(cè)結(jié)果(未發(fā)表)一致。因此選擇涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液16 d后的樹(shù)皮樣品進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

圖 2Hhs.015作用下的蘋(píng)果腐爛菌(Valsamali)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化

A-C是對(duì)照組，A是未被蘋(píng)果腐爛菌侵染的韌皮部正常細(xì)胞，B-C是定殖在寄主細(xì)胞內(nèi)的蘋(píng)果腐爛菌正常菌體；D-F是試驗(yàn)組位于韌皮部細(xì)胞間隙的蘋(píng)果腐爛菌菌體。A、C、E.Bar=2 μm；B、D、F.Bar=500 nm

Fig.2Change of subcellular structure ofValsamaliunder effect of Hhs.015 in host

A-C. Normal,A.The normal cell of phloem without infection ofValsamali,B-C.The colonization of normalValsamaliwithin the host cell;D-F.Treatment，the colonization of aberrantValsamaliin intercellular space of the host.A，C，E.Bar=2 μm;B，D，F(xiàn).Bar=500 nm

圖 3　寄主韌皮部胼胝質(zhì)的積累現(xiàn)象觀察(A-D，F(xiàn)-G.×200；E.×100) A-B,C-E,F-G.分別為處理11，16，21 d的樣品，A、C、F為對(duì)照，B、D、E、G為試驗(yàn)組；EP.表皮；CT.皮層；PH.韌皮部；SV.篩管；XY.木質(zhì)部Fig.3　Accumulation of callose in phloem of host(A-D,F-G.×200;E.×100) A-B，C-E，F(xiàn)-G.11，16，21 d after fermentation broth of Hhs.015 smeared resepectively.A,C,F.Normal; B,D,E，G.Treatment.EP.Epidermis;CT.Cortex;PH.Phloem;SV.Sieve tube;XY.Xylem

2.4生防菌及病原菌對(duì)寄主胼胝質(zhì)積累形成的影響

未接種蘋(píng)果腐爛菌也未涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液的健康樹(shù)皮，其篩管部位的胼胝質(zhì)只在管壁均勻分布(圖4-A和圖4-B)。只涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液的樹(shù)皮，16 d后篩管管壁及橫切面的熒光均增強(qiáng)(圖4-C)，其縱切面熒光強(qiáng)烈(圖4-D)，即胼胝質(zhì)在篩管壁及篩板上均出現(xiàn)積累增強(qiáng)現(xiàn)象。只接種蘋(píng)果腐爛菌的樹(shù)皮中，只在篩管壁有均勻熒光(圖4-E、F)，與健康樹(shù)皮相比，并未出現(xiàn)明顯的胼胝質(zhì)積累現(xiàn)象。對(duì)接種蘋(píng)果腐爛菌發(fā)病后的枝條涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液16 d后，在篩管管壁及其橫切面上的熒光增強(qiáng)，且在水平方向上相鄰篩管處形成強(qiáng)烈熒光，與只涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液的樣品(圖4-C)相比，其縱切面與橫切面的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(圖4-G、H)，即篩管部位出現(xiàn)強(qiáng)烈的胼胝質(zhì)積累現(xiàn)象。

圖 4　涂抹Hhs.015發(fā)酵液16 d后生防菌及病原菌對(duì)寄主篩管中胼胝質(zhì)積累的影響(×200) A與B是既未接種蘋(píng)果腐爛菌也未涂抹Hhs.015發(fā)酵液的樣品；C與D是只涂抹Hhs.015發(fā)酵液的樣品； E與F是只接種蘋(píng)果腐爛菌的樣品；G與H是既接種蘋(píng)果腐爛菌也涂抹Hhs.015發(fā)酵液的樣品。 A、C、E、G是篩管的橫切面觀察結(jié)果，B、D、F、H是篩管的縱切面觀察結(jié)果。曝光時(shí)間均為863.5 msFig.4　Influence of biocontrol bacterium and pathogen on accumulation of callosein sieve tube at 16 d after fermentation broth of Hhs.015 smeared (×200) A-B.Sample without inoculation of Valsa mali or fermentation broth of Hhs.015 smeared;C-D.Sample with fermentation broth of Hhs.015 smeared only;E-F.Sample with inoculation of Valsa mali only;G-H.Sample with inoculation ofValsa mali and fermentation broth of Hhs.015 smeared.A，C，E，G.Transverse section of sieve tube; B，D，F(xiàn)，H.Longitudinal section of sieve tube.The exposure time was 863.5 ms

3　討　論

生防菌進(jìn)入寄主植物的途徑和方式與病原菌基本相似[10,22]。因此，當(dāng)生防菌進(jìn)入植物體時(shí)，可以?xún)?yōu)先占據(jù)病原菌的入侵位點(diǎn)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并可在入侵部位分泌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，阻止病原菌的侵入[23]。蘋(píng)果腐爛菌(V.mali)是寄生性很弱的兼性寄生菌，只能從蘋(píng)果樹(shù)的表皮傷口(如皮孔、葉痕等自然因素造成的傷口及修剪傷口、機(jī)械損傷等人為因素造成的傷口)入侵已經(jīng)死亡的皮層組織[24]。本研究中，生防菌Hhs.015通過(guò)樹(shù)皮皮孔、毛孔等自然孔口侵入樹(shù)皮，與蘋(píng)果腐爛菌的侵入方式一致，因此生防菌與病原菌可能在空間位點(diǎn)上存在競(jìng)爭(zhēng)作用，至于二者是否存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

生防菌能夠通過(guò)分泌多種抗菌物質(zhì)來(lái)降低病原菌的侵染和菌絲擴(kuò)展[25]。前期研究結(jié)果表明，生防菌Hhs.015可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和葡聚糖酶，但具體的抗菌物質(zhì)目前還不清楚[20]。本研究中，涂抹生防菌Hhs.015發(fā)酵液后，Hhs.015產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)會(huì)使寄主內(nèi)的蘋(píng)果腐爛菌菌體出現(xiàn)畸變，從而可能使病菌的各項(xiàng)生理生化過(guò)程受到抑制，影響病菌的侵染速度，這也可能是Hhs.015發(fā)酵液處理后病健交界處組織中蘋(píng)果腐爛菌菌體多位于寄主細(xì)胞間隙的原因。

胼胝質(zhì)，即β-1,3-葡聚糖，在抵抗不利環(huán)境因素及個(gè)體發(fā)育不同階段均起重要作用[26]。胼胝質(zhì)與篩板篩孔的形成和關(guān)閉有關(guān)，而篩板位于篩管分子的端壁上，篩管分子通過(guò)篩板的篩孔上下相連，構(gòu)成有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ繹27]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種蘋(píng)果腐爛菌發(fā)病后的枝條經(jīng)Hhs.015發(fā)酵液涂抹處理后，寄主胼胝質(zhì)積累有明顯的時(shí)空特異性。在空間上，只在篩管部位出現(xiàn)胼胝質(zhì)積累，可能導(dǎo)致篩孔變小或關(guān)閉，可以在一定程度上阻止寄主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及病菌毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，從而使寄主對(duì)病菌侵染定殖的抵抗能力增強(qiáng)。在時(shí)間上，涂抹Hhs.015發(fā)酵液16 d后寄主胼胝質(zhì)積累最強(qiáng)，11與21 d時(shí)均較弱；這是因?yàn)椋阂环矫?，寄主產(chǎn)生抗性反應(yīng)需要時(shí)間，所以涂抹Hhs.015發(fā)酵液11 d寄主胼胝質(zhì)還未增強(qiáng)；另一方面，寄主抗性增強(qiáng)后可能會(huì)產(chǎn)生一些β-1,3-葡聚糖酶，并且Hhs.015本身也可以產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶，因此涂抹Hhs.015發(fā)酵液21 d時(shí)，寄主胼胝質(zhì)積累又減弱。在胼胝質(zhì)合成酶與β-1,3-葡聚糖酶共同作用下，胼胝質(zhì)積累程度在涂抹Hhs.015發(fā)酵液16 d后達(dá)到最大。

植物內(nèi)生菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來(lái)抑制病原菌的侵染與生長(zhǎng)，其機(jī)制包括誘導(dǎo)寄主細(xì)胞物理結(jié)構(gòu)變化和生理生化反應(yīng)變化兩方面。其中物理結(jié)構(gòu)變化主要包括誘導(dǎo)寄主植物在病原菌入侵的細(xì)胞前沿形成結(jié)構(gòu)致密的保護(hù)層，或誘導(dǎo)寄主細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而阻止病菌入侵[23,28]。本研究中，對(duì)接種蘋(píng)果腐爛菌發(fā)病后的枝條涂抹Hhs.015黃豆粉發(fā)酵液，在水平方向上相鄰篩管處胼胝質(zhì)顯著積累，可以在一定程度上抵御病原菌向寄主韌皮部以?xún)?nèi)的組織擴(kuò)展；另外，涂抹Hhs.015發(fā)酵液的病健交界處樹(shù)皮中蘋(píng)果腐爛菌菌體多出現(xiàn)在寄主細(xì)胞間隙，而未涂抹發(fā)酵液的病健交界處樹(shù)皮樣品中的蘋(píng)果腐爛菌菌體多位于寄主細(xì)胞內(nèi)部，可見(jiàn)Hhs.015可以通過(guò)誘導(dǎo)寄主抗性來(lái)阻礙病原菌的侵染與定殖。生理生化反應(yīng)變化則主要包括提高寄主植物內(nèi)植保素和一些次生代謝物質(zhì)的合成，產(chǎn)生降解病原菌的水解酶和氧化酶等，Hhs.015的相關(guān)表現(xiàn)有待進(jìn)一步研究。

[1]Wang X L,Zang R,Yin Z Y,et al.Delimiting cryptic pathogen species causing appleValsacanker with multilocus data [J].Ecology and Evolution,2014,4(8):1369-1380.

[2]臧睿,黃麗麗.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)及其影響條件研究 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(1):64-67.

Zang R,Huang L L.Study on the pycindiospore germination of apple treeValsacanker pathogen [J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica,2007,16(1):64-67.

[3]曹克強(qiáng),國(guó)立耘,李保華,等.中國(guó)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病發(fā)生和防治情況調(diào)查 [J].植物保護(hù),2009,35(2):114-116.

Cao K Q,Guo L Y,Li B H,et al.Investigation on the occurrence and control of apple canker in China [J].Plant Protection,2009,35(2):114-116.

[4]桂騰茸,姬盼,楊毅娟,等.云南蘋(píng)果腐爛病調(diào)查及發(fā)生規(guī)律初步研究 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,29(3):458-462.

Gui T R,Ji P,Yang Y J,et al.Investigation and epidemic study on appleValsacanker in Yunnan [J].Journal of Yunnan Agricultural University,2014,29(3):458-462.

[5]王磊,郜佐鵬,黃麗麗,等.防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病殺菌劑的室內(nèi)篩選 [J].植物病理學(xué)報(bào),2009,39(5):549-554.

Wang L,Gao Z P,Huang L L,et al.Screening fungicide for pathogen inhibition and disease control of apple treeValsacanker [J].Acta Phytopathologica Sinica,2009,39(5):549-554.

[6]Compant S,Duffy B,Nowak J,et al.Use of plant growth-promotingbacteria for biocontrol of plant diseases:principles,mechanisms of action,and future prospects [J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(9):4951-4959.

[7]Miles L,Lopera C,González S,et al.Exploring the biocontrol potential of fungal endophytes from an Andean Colombian Paramo ecosystem [J].Bio Control,2012,57(5):697-710.

[8]Gajera H,Domadiya R,Patel S,et al.Molecular mechanism ofTrichodermaas bio-control agents against phytopathogen system:a review [J].Current Research in Microbiology and Biotechnology,2013,1(4):133-142.

[9]陳捷,朱潔偉,張婷,等.木霉菌生物防治作用機(jī)理與應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2011,27(2):145-151.

Chen J,Zhu J W,Zhang T,et al.Progress on mechanism and applications ofTrichodermaas a biocontrol microbe [J].Chinese Journal of Biological Control,2011,27(2):145-151.

[10]何迎春,高必達(dá).立枯絲核菌的生物防治 [J].中國(guó)生物防治,2000,16(1):31-34.

He Y C,Gao B D.Biological control ofRhizoctoniasolani[J].Chinese Journal of Biological Control,2000,16(1):31-34.

[11]郭榮君,劉杏忠,楊懷文,等.芽孢桿菌BH1防治大豆根腐病的效果及機(jī)制 [J].中國(guó)生物防治,2003,19(4):180-184.

Guo R J,Liu X Z,Yang H W,et al.Mechanism ofRhizobacteriaBH1(Bacillussp.) to suppress soybean root rot disease caused byFusariumspp. [J].Chinese Journal of Biological Control,2003,19(4):180-184.

[12]Xiong Z Q,Tu X R,Wei S J,et al.The mechanism of antifungal action of a new polyene macrolide antibiotic antifungalmycin 702 fromStreptomycespadanusJAU4234 on the rice sheath blight pathogenRhizoctoniasolani[J].PLoS One,2013,8(8):e73884.

[13]Barger S R,Hoefler B C,Cubillos-Ruiz A,et al.Imaging secondary metabolism ofStreptomycessp.Mg1 during cellular lysis and colony degradation of competingBacillussubtilis[J].Antonie van Leeuwenhoek,2012,102(3):435-445.

[14]Nishimura M T,Stein M,Hou B H,et al.Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance [J].Science,2003,301(5635):969-972.

[15]Schulz B,Boyle C,Draeger S,et al.Endophytic fungi:a source of novel biologically active secondary metabolites [J].Mycological Research,2002,106(9):996-1004.

[16]Mano H I,Morisaki H.Endophytic bacteria in the rice plant [J].Microbes and Environments,2008,23(2):109-117.

[17]Arora S,Patel P N,Vanza M J,et al.Isolation and characterization of endophytic bacteria colonizing halophyte and other salt tolerant plant species from coastal Gujarat [J].African Journal of Microbiology Research,2014,8(17):1779-1788.

[18]郜佐鵬,柯希望,韋潔玲,等.七株植物內(nèi)生放線菌對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治作用 [J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2009,36(5):410-416.

Gao Z P,Ke X W,Wei J L,et al.Biocontrol efficacy of apple tree canker by endophytic actinomycetes [J].Acta Phytophylacica Sinica,2009,36(5):410-416.

[19]李正鵬.楊凌糖絲菌 Hhs.015 對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的生物防治研究 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

Li Z P.Study on the biological control ofSaccharothrixyanglingensisHhs.015 [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2012.

[20]Yan X,Huang L L,Tu X,et al.Saccharothrixyanglingensissp.nov.,an antagonistic endophytic actinomycete isolated from cucumber plant [J].Antonie van Leeuwenhoek,2012,101(1):141-146.

[21]康振生,李振岐.小麥條銹菌吸器超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞化學(xué)的研究 [J].真菌學(xué)報(bào),1994,13(1):52-57.

Kang Z S,Li Z Q.Ultrastructure and cytochemistry of haustorium of wheat stripe rust [J].Acta Mycologica Sinica,1994,13(1):52-57.

[22]黎起秦, 葉云峰,王濤,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株入侵番茄的途徑及其定殖部位 [J].中國(guó)生物防治,2008,24(2):133-137.

Li Q Q,Ye Y F,Wang T,et al.Entrance of endophyticBacillussubtilisstrain B47 into tomato plant and its colonization inside the plant [J].Chinese Journal of Biological Control,2008,24(2):133-137.

[23]郝曉娟.植物內(nèi)生菌 [M].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2010.

Hao X J.Endophyte [M].Beijing:Chinese Agriculture Science and Technology Press,2010.

[24]許志剛.普通植物病理學(xué) [M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1997.

Xu Z G.General phytopathology [M].Beijing:Chinese Agriculture Press,1997.

[25]Castillo U F,Strobel G A,Ford E J,et al.Munumbicins,wide-spectrum antibiotics produced byStreptomycesNRRL 30562, endophytic onKennedianigriscans[J].Microbiology,2002,148(9):2675-2685.

[26]Pir?elová B,Matu?íková I.Callose:the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions [J].Acta Physiology Plant,2013,35(3):635-644.

[27]Musetti R,Paolacci A,Ciaffi M,et al.Phloem cytochemical modification and gene expression followingthe recovery of apple plants from apple proliferation disease [J].Phytopathology,2010,100(4):390-399.

[28]陳捷.現(xiàn)代植物病理學(xué)研究方法 [M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007.

Chen J.Modern research methods on phytopathology [M].Beijing:Chinese Agriculture Press,2007.

Histological and cytological study on biocontrol stain Hhs.015 in preventingValsamalifrom infecting host

FAN Dongyinga,b,ZHAO Lingyuna,b,HUANG Lilib,c,YAN Xiaa,b

(aCollegeofLifeScience,bStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,cCollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study conducted histological and cytological observation on the invasion,colonization,and expansion ofSaccharothrixyanglingensisHhs.015 in host appleValsacanker to explore the control mechanism of Hhs.015 in preventingValsamalifrom infecting host.【Method】 The invasion and colonization of Hhs.015,the change of subcellular structure ofV.maliaffected by Hhs.015,and occurrence and accumulation of callose in host were observed by scan electron microscope,transmission electron microscope and fluorescence microscope.【Result】 Hhs.015 probably competed withV.malifor special sites to intrude host through lenticels and pores of bark,which was consistent withV.mali.V.malishowed unevenness and intensification in cell wall,plasmolysis,condensation of cytoplasm and formation of large vacuoles when treated with Hhs.015 in host.Hhs.015 also induced host to generate resistance response such as accumulation of callose.Therefore,growth and infection ofV.maliwas significantly controlled by Hhs.015.【Conclusion】 Hhs.015 could preventV.malifrom infecting host by the comprehensive effects of competition,antifungal activity and induced resistance.

SaccharothrixyanglingensisHhs.015;Valsamali;special competition;antifungal activity;callose accumulation

時(shí)間:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.018

2015-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101476，31171796)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013K01-45)；楊凌示范區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NY-41)

范東穎(1990―)，女，河南虞城人，在讀碩士，主要從事微生物遺傳學(xué)研究。E-mail：dyfanfan@163.com

顏霞(1974―)，女，山東泰安人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源開(kāi)發(fā)利用研究。

E-mail：yanxia@nwsuaf.edu.cn

S436.611.1+1；S476.8

A

1671-9387(2016)10-0126-07

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