張玲玲, 許國超, 倪 曄*
(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫214122)
不對稱合成苯乳酸的酮酸還原酶基因克隆和表達
張玲玲1,2,許國超1,2,倪曄*1,2
(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫214122)
采用分子克隆手段從基因組數(shù)據(jù)庫中獲得5個可以不對稱還原苯丙酮酸合成手性苯乳酸的酮酸還原酶,并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。比較5個重組酮酸還原酶的酶活、轉(zhuǎn)化率、ee值等指標,來源于干酪乳桿菌的酮酸還原酶Lc KAR表現(xiàn)出最高的比活力和選擇性。純酶Lc KAR的比活力為0.32 U/mg,在不對稱還原反應(yīng)中遵循Prelog規(guī)則,產(chǎn)物為(R)-苯乳酸,且ee>99%。對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-LcKAR的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化,最適培養(yǎng)條件為種齡6 h,接種體積分數(shù)為3%,誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.6 mmol/L,誘導(dǎo)時間為5 h,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后Lc KAR的發(fā)酵酶活達到2.17×103U/L。
苯乳酸;酮酸還原酶;生物催化;不對稱還原;發(fā)酵優(yōu)化
苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA),又名2-羥基-3苯基丙酸,是一類非常重要的化合物,在醫(yī)藥及生物防腐劑等方面具有非常廣泛的應(yīng)用。苯乳酸具有與其衍生物丹參素(β-3,4一二羥基苯基乳酸鈉)相同的藥理功能,可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)的類固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成許多藥物的重要中間物,比如:降血糖藥恩格列酮(Englitazone)、非蛋白氨基酸施德?。⊿tatine)、抗艾滋病毒制劑、新型驅(qū)腸蟲藥PFl022A等[1]。此外,近年來發(fā)現(xiàn)苯乳酸可作為新型的生物防腐劑,且具有非常廣泛的抗菌譜,對革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌)、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。
利用生物法合成苯乳酸的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點,可分為發(fā)酵法和生物催化法。早在1986年,Kamata M等[2]人開始利用Brevibacterium lactofermentum發(fā)酵制備(R)-PLA,產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1.94 g/L;2004年,李德茂等[3]采用菌株Staphylococcus haemolyticus T0l發(fā)酵制備 (R)-PLA,產(chǎn)量為1.59 g/L。2013年,郁書懷等[4]通過菌株 Pediococcus pentosaceus發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸,產(chǎn)物質(zhì)量濃度僅為0.91 g/L(5.5 mmol/L);通過發(fā)酵法生產(chǎn)苯乳酸的產(chǎn)物水平低,不能達到工業(yè)應(yīng)用的要求。生物催化法主要是利用還原酶將前手性的苯丙酮酸(Phenylpyruvic acid,PPA)不對稱還原生成苯乳酸。2000年,Lavermicoccca P等[1]發(fā)現(xiàn) Lactobacillus plantarum菌株能用于不對稱合成(R)-PLA,產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.056 g/L;2011年,鄭兆娟等[5]人采用菌株Bacillus coagulans還原PPA制備苯乳酸,產(chǎn)物質(zhì)量濃度可達到37.3 g/L,2013年,通過定點突變的方法對來源于Lactobacillus bulgaricus的羰基還原酶進行改造,1.5 h內(nèi)可將50 mmol/L苯丙酮酸還原為苯乳酸,且立體選擇性ee>99%[6]。因此,開發(fā)高效不對稱合成苯乳酸的催化劑具有重要的應(yīng)用前景。
不對稱合成苯乳酸的還原酶廣泛地存在于大自然界中,我們可以從環(huán)境中篩選出高活力、高轉(zhuǎn)化率的還原酶產(chǎn)生菌株。然而,目標酶在野生菌中的表達量較低,進而導(dǎo)致底物的上載量無法達到工業(yè)應(yīng)用的要求。伴隨著基因數(shù)據(jù)庫資源的不斷增加和蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)的發(fā)展,獲得高效生物催化劑的時間逐漸縮短[7]。
作者通過對基因數(shù)據(jù)庫篩選,獲得5個酮酸還原酶基因 ,分別 來源于Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Lactobacillusplantarum、Kluyveromyces sp.、Lactobacillus casei,將它們在E.coli BL21(DE3)中重組表達,篩選得到能高效不對稱合成光學(xué)純苯乳酸的酮酸還原酶,并對其培養(yǎng)基組成及發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行了優(yōu)化。
1.1菌株、質(zhì)粒與試劑
所用的菌株和質(zhì)粒詳見表1。Ezup柱式細菌/酵母基因組提取試劑盒:上海生工生物有限公司;苯乳酸(PLA):Sigma公司;苯丙酮酸(PPA):上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司;氧化型 (NAD+)和還原型(NADH)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸:上海玉博生物有限公司;其余試劑和藥品均為國產(chǎn)或進口分析純。
表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and p lasm ids used in this study
1.2酮酸還原酶的克隆與表達
使用Ezup柱式細菌/酵母基因組提取試劑盒分別提取 E.coli、L.casei、L.plantarum、S.cerevisiae,Kluveromyces sp.的基因組。以表2所列的引物進行PCR擴增目的基因,經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切后連接至載體pET24a或pET28a,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。將重組子接種于含50μg/mL卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。次日以2%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)入新鮮的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD660約為0.6時,加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG,30℃誘導(dǎo)5 h。然后,4℃、8 000 r/min離心收集菌體,生理鹽水洗滌兩次后加入10mL磷酸鉀緩沖液(100mmol/L,pH 7.0),超聲破碎,離心取上清液即為粗酶液。根據(jù)方法1.3測定酶活力,并進行SDS-PAGE分析。
表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used in this study
1.3酮酸還原酶活力的測定
酮酸還原酶的活性測定方法:總反應(yīng)體系為250μL,包括磷酸鉀緩沖液 (KPB,100mmol/L,pH 7.0),0.5 mmol/L NADH,5 mmol/L PPA,混勻后于30℃保溫2 min,加入適量的酶液,檢測NADH在340 nm處吸收值的變化。酶活力單位(U)定義為:在上述條件下,每分鐘催化氧化1μmol NADH所需要的酶量。酶活力計算公式:
其中,EW為1 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化;V為反應(yīng)液的總體積 (mL);6 220為摩爾消光系數(shù)(L/(mol·cm));l為光程距離(cm)。
蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法,以小牛血清白蛋白BSA為標準品[8]。
1.4水相中不對稱合成2-羥基-3-苯基丙酸
于10 mL KPB(100 mmol/L,pH 6.0)中加入適量的菌體,0.05 mmol/L NADH和10 g/L PPA,在30℃、200 r/min反應(yīng)12 h。取一部分混合液8 000 r/min離心5 min,除去菌體等不溶物質(zhì),按照方法1.5進行HPLC分析;將另一部分混合液于8 000 r/min離心10 min,充分去除雜質(zhì),上清液用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次,加入過量的無水硫酸鎂過夜干燥,將處理后的樣品高速離心后按照方法1.6進行對映選擇性分析。
1.5HPLC分析苯丙酮酸和苯乳酸
采用反相HPLC分析底物及產(chǎn)物,色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm,5μm),流動相成分:0.5 g/L三氟乙酸/水(A)和0.5 g/L三氟乙酸/甲醇(B)混合液。梯度洗脫程序為:0~20 min 10%~100%B;20~25 min保持100%B;柱溫:30℃;流速1 mL/min。苯丙酮酸的檢測波長為290 nm,保留時間17.5min,苯乳酸的檢測波長為210 nm,保留時間9.5min。
1.6HPLC分析苯乳酸的手性
通過正相HPLC分析苯乳酸的手性,采用配有Chiralcel OJ-H(0.46 mm×250 mm×5μm)色譜柱的Agilent 1100 HPLC,流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸(95/5/0.05),1.0mL/min流速,檢測器波長為210 nm,30℃柱溫,(R)-PLA保留時間32.8 min,(S)-PLA保留時間35.5min。
2.1不同來源的酮酸還原酶的克隆表達
以Bacillus coagulans(GenBankNO:ZP-04430752)[9]、Bacillus coagulans(GenBank NO:ZP-04430367.1)[9]、Saccharomyces cerevisiae(GenBank NO:NM-001183405)[10]的3個乳酸脫氫酶為探針,在基因數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,克隆表達與探針同源性在(60%~80%)的基因序列,它們分別來自于E.coli、Saccharomycescerevisiae、Lactobacillus plantarum、Kluyveromyces sp.、Lactobacillus casei的還原酶基因。測序結(jié)果與 GenBank中登記的Lp KAR(NC_004567.2,951 bp)、Ec KAR(EU895958,1233 bp)、Sc KAR(DAA07141,1031 bp)、Kl KAR(CBL74568.1,1475 bp)、Lc KAR(AEA57175,936 bp)的大小一致。將構(gòu)建好的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后,通過SDS-PAGE分析各蛋白質(zhì)的表達效果,結(jié)果見圖1。酮酸還原酶Lc KAR和Sc KAR表達量明顯較其它還原酶多,但大部分Sc KAR為不可溶蛋白質(zhì),這可能是因為Sc KAR來源于真核微生物,而絕大部分Lc KAR以可溶蛋白質(zhì)的形式表達。其余3種酮酸還原酶Lp KAR、Ec KAR、Kl KAR的蛋白質(zhì)表達量較少(低于Sc KAR表達量的50%)。
圖1 重組酮酸還原酶Lp KAR、Ec KAR、Sc KAR、Kl KAR、Lc KAR的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant expression of Lp KAR,Lc KAR,Sc KAR,Kl KAR and Ec KAR
2.2水相中不對稱合成2-羥基-3-苯基丙酸
按照實驗1.4的方法不對稱還原PPA,反應(yīng)12 h后分析轉(zhuǎn)化率及對映選擇性。來源于L.casei的重組酮酸還原酶Lc KAR表現(xiàn)出對PPA較高的比活力,純酶活力為0.32 U/mg,且對映選擇性大于99%,是理想的后續(xù)研究對象。來源于酵母菌的兩個酮酸還原酶Sc KAR和Kl KAR傾向于不對稱合成(S)-PLA,而其余的菌株傾向于不對稱合成 (R)-PLA,在不對稱還原過程中遵循Prelog規(guī)則。雖然Kl KAR活性不高(約0.11 U/mg),但對映選擇性較高(>99%ee)。與此相反,來源于L.plantarum的酮酸還原酶Lp KAR雖然具有較高的活性(0.31 U/mg),但對映選擇性較低(10.7%ee)。
2.3酮酸還原酶序列分析
對分別來源于Lactobacillus plantarum(Lp KAR,PDBID:3EVT_A),Lactobacilluscasei(Lc KAR,AEA57175),Pediococcuspentosaceus(Pp LDH,ABJ67935)[11],Pediococcusacidilactici(Pa LDH,ABJ67935)[12],Lactobaciiius bulgaricus(Lb LDH,PDB ID:1J4A)[13]的酮酸還原酶的序列進行一致性分析。結(jié)果顯示,Lc KAR與Lp CR,Pp LDH,Pa LDH,Lb LDH的氨基酸序列同源性分別為 43.37%、19.77%、21.93%、19.13%。然后使用ESPript工具對上述5個酮酸還原酶的氨基酸序列進行比對,見圖2。發(fā)現(xiàn)Lc KAR,Lp CR,Pp LDH,Pa LDH,Lb LDH屬于酮酸還原酶家族,NADH依賴型。且保守序列Arg234是羧基或羰基底物的結(jié)合位點,可促進NADH與其相鄰的輔酶結(jié)合位點結(jié)合,保守序列Val77和Gly78是底物結(jié)合位點[14]。有研究表明,第52位和第299位氨基酸通常位于底物結(jié)合位點,這兩個位點的長鏈氨基酸突變?yōu)槎替湴被峥梢源蟠笤黾拥孜锏霓D(zhuǎn)化效率[6]。
2.4E.coli BL21(DE3)/pET28a-Lc KAR發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化
2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基的成分大致可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因子等,對微生物生長的不同階段的新陳代謝及異源蛋白質(zhì)的表達提供原料。碳源是為微生物提供能源,組成細胞成分的碳架。氮源是構(gòu)成菌體細胞物質(zhì),并為微生物提供能源及合成含氮代謝產(chǎn)物。無機鹽為微生物生長提供必需的礦質(zhì)元素,這些元素可以參與酶的合成,構(gòu)成酶活性基團,激活酶活性,維持細胞滲透壓等。因此培養(yǎng)基的組成和配比合適與否,對微生物的生長發(fā)育、異源蛋白的表達都會產(chǎn)生很大的影響。考慮到生產(chǎn)發(fā)酵成本,作者在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,根據(jù)大腸桿菌生長發(fā)酵特性,選擇了常用的、廉價的有機和無機碳氮源,通過搖瓶水平對培養(yǎng)基的組成進行了優(yōu)化,實驗設(shè)計見表3。
圖2 α-酮酸脫氫酶的氨基酸序列對比Fig.2 Am ino acid sequence alignments of various 2-hydroxyacid dehydrogenases
表3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化Table 3 Optim ization of fermentation media
培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果見圖3。對比1號、2號培養(yǎng)基可以看出,1號進口培養(yǎng)基的LcKAR的酶活力較高,細胞量低于國產(chǎn)培養(yǎng)基,進口培養(yǎng)基的豐富營養(yǎng)有利于外源蛋白質(zhì)的表達,但是其成本較高。對比3、4號培養(yǎng)基,加入甘油比加入葡萄糖的培養(yǎng)中Lc KAR的活力更高,細胞量更多,這可能是因為與甘油相比,葡萄糖更易利用,導(dǎo)致細胞快速生長,但外源蛋白質(zhì)的表達受到延滯,而甘油不僅可為微生物的生長提供碳源,還可以為外源蛋白質(zhì)的合成提供重要的碳原料等。對比2號、6號發(fā)現(xiàn),加入蛋白胨的培養(yǎng)基比加入比玉米漿的培養(yǎng)基的Lc KAR的活力較高,但細胞量較少,這可能是因為動物來源的氮源比植物來源的氮源營養(yǎng)更豐富,有利于外源蛋白質(zhì)的分泌和表達,玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物,滅菌后有大量不溶物雜質(zhì),導(dǎo)致離心后測定濕菌重增加。相比3號,5號檸檬酸的加入不利于菌體的生長和Lc KAR的表達。從生產(chǎn)成本和效益上考慮最終選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:國產(chǎn)蛋白胨10 g/L,國產(chǎn)酵母粉8 g/L,氯化鈉10 g/L,甘油3 g/L,K2HPO44 g/L,(NH4)2SO43 g/L。
圖3 不同培養(yǎng)基中E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR的生長和產(chǎn)酶對比Fig.3 Comparison of the grow th and enzyme production in differentmedium
2.4.2誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間的優(yōu)化發(fā)酵條件會影響菌體的生長和產(chǎn)酶,研究了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑的濃度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,結(jié)果見圖4。當誘導(dǎo)溫度從16℃上升至30℃時,酶活力逐漸增大,30℃時達到最大,當誘導(dǎo)溫度繼續(xù)上升時活性反而下降;0.5~1.5 h時開始誘導(dǎo),酶活力不斷增加,在1.5 h(OD660約為0.6)時開始誘導(dǎo)的酶活力最高,此后隨著誘導(dǎo)開始時間延長,酶活力逐漸下降。Lc KAR的酶活力隨誘導(dǎo)時間也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,當誘導(dǎo)時間為5 h時酶活力達到最高。當IPTG濃度從0.2 mmol/L上升至0.6 mmol/L時,Lc KAR的酶活力逐漸增加,在IPTG為0.6mmol/L時達到最高,然后隨著IPTG的濃度的增加而降低。因此,最佳誘導(dǎo)溫度為30℃,誘導(dǎo)開始時間為1.5 h,IPTG濃度為0.6 mmol/L,誘導(dǎo)時間為5 h,在上述條件下Lc KAR酶活力為1.42×103U/L。
圖4 誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度對大腸桿菌重組表達Lc KAR酶活的影響Fig.4 Effect of inducing tem perature,inducing occasion,inducing time and IPTG concentration on the activity of recombinant Lc KAR
2.4.3種齡的優(yōu)化為確定最佳種齡,研究了E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR的生長曲線,見圖5(a)。培養(yǎng)時間5~8 h,即為對數(shù)生長中后期。為了進一步確定最佳種齡,分別于種齡為2、3、4、5、6、7、8、9 h時轉(zhuǎn)接,1.5 h后加入終濃度為0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h。由圖5(b)可知,隨著種齡的增加,Lc KAR的酶活力逐漸增大,當種齡為6 h時酶活力最大,為1.92×103U/L。當種齡繼續(xù)增加時,酶活力逐漸下降。這可能是因為種齡過小,菌種還處在延緩期,轉(zhuǎn)接之后菌體早期生長緩慢。而當種齡過大,有些菌體可能已經(jīng)開始衰亡,因此選擇最佳種齡為6 h,此時期的菌體生長活力強,移種到發(fā)酵罐后能迅速生長以縮短延滯期,且具有穩(wěn)定的生產(chǎn)能力,外源蛋白質(zhì)的合成持續(xù)穩(wěn)定高產(chǎn)。
2.4.4接種體積分數(shù)的優(yōu)化接種體積分數(shù)的大小決定了生產(chǎn)菌株在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。采用較大的接種體積分數(shù)可以縮短發(fā)酵罐中菌體適應(yīng)培養(yǎng)基的時間,迅速生長到對數(shù)生長期。而接種體積分數(shù)過小,除了延長發(fā)酵周期外,往往還會引起其它不正常情況。因此接種體積分數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)酶影響很大。采用種齡6 h和0.6 mmol/L IPTG,誘導(dǎo)時機1.5 h,誘導(dǎo)時間5 h,考察不同的接種體積分數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,見圖6。當接種體積分數(shù)為3%時,酶活力最高為1.96×103U/L,當接種體積分數(shù)低于或高于3%時,酮酸還原酶Lc KAR的活力都有所下降。因此確定最佳接種體積分數(shù)為3%。
圖5 E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR生長曲線及不同種齡對Lc KAR的產(chǎn)酶的影響Fig.5 Grow th curve of E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR and Effect of seed ages on Lc KAR production
圖6 不同接種體積分數(shù)對Lc KAR的產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculation ratio on Lc KAR production
2.4.5E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR于3 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)將種齡為6 h的E.coli BL21(DE3)/pET28a-LcKAR,以3%的接種體積分數(shù)接種于3 L發(fā)酵罐 (含1 L上述優(yōu)化的培養(yǎng)基),在上述優(yōu)化的條件下進行培養(yǎng),每小時取樣檢測其活力與OD660的變化情況,結(jié)果見圖7。產(chǎn)酶與細胞生長是偶聯(lián)型的關(guān)系,Lc KAR的表達量隨著發(fā)酵時間的延長不斷升高,在發(fā)酵時間為8 h時酶活力達到最大,發(fā)酵酶活為 2.17×103U/L,約是Staphylococcus haemolyticus T0l[3]的58.5倍,是來源于Bacillus coagulans[4]還原酶的2.5倍。但隨時間的延長,Lc KAR的酶活力逐漸下降,這可能是因為在對數(shù)后期和平穩(wěn)期時細胞內(nèi)蛋白酶的積累,導(dǎo)致異源表達的Lc KAR的產(chǎn)量下降。
圖7 3 L發(fā)酵罐中菌體濃度和Lc KAR酶活的時間進程曲線Fig.7 Time course of cell density and Lc KAR activity in a 3 L bioreactor
從基因數(shù)據(jù)庫中成功克隆表達了5個能不對稱還原苯丙酮酸合成苯乳酸的酮酸還原酶,并篩選得到來源于Lactobacillus casei的還原酶Lc KAR,其具有較高催化活性和對映選擇性(ee>99%)。對重組表達LcKAR發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,誘導(dǎo)溫度30℃,IPTG濃度0.6mmol/L,誘導(dǎo)時間5 h。采用上述條件在3 L罐中發(fā)酵,發(fā)酵酶活達到2.17×103U/L。本研究為生物催化法制備光學(xué)純苯乳酸提供了新的工具酶,為進一步利用該酶生產(chǎn)苯乳酸提供了理論支持。
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澳新擬允許植物甾醇添加于部分早餐中
2016年7月28日,據(jù)澳新食品標準局(FSANZ)消息,澳新食品標準局發(fā)布通知公告20-16,擬批準A1134號申請,修訂澳新食品標準法典部分要求,允許新資源食品植物甾醇添加于部分控制的谷物早餐中,其中“部分控制”是指單獨包裝的部分,或容易分割的部分。具體使用條件如下:谷物早餐的總纖維含量不低于3 g/50 g;早餐麥片中含有的總糖不超過30 g/100 g;總植物甾醇含量不低于0.8 g,不超過2 g。
[信息來源]廈門WTO工作站.澳新擬允許植物甾醇添加于部分早餐中 [EB/OL].(2016-8-1).http://www.xmtbt-sps. gov.cn/detail.asp?id=52182
Cloning and Expression of Ketoacid Reductase for Asymmetric Synthesis of Phenyllactic Acid
ZHANG Lingling1,2, XU Guochao1,2, NIYe*1,2
(1.School of Biotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China)
Phenyllactic acid was one of themost important compounds w ith w ide application in pharmaceuticals and biological preservatives.Five ketoacid reductases capable of asymmetric reduction of phenylpyruvic acid(PPA)into phenyllactic acid(PLA)were obtained from genome databases,and were heterogeneously over-expressed in E.coli BL21(DE3).Among 5 enzymes,the recombinant ketoacid reductase from Lactobacillus casei(Lc KAR)displayed the best biocatalytic performance,w iththehighest specificactivityof 0.32U/mgof purifiedenzymeand enantioselectivity of>99%.This Lc KAR obeys Prelog rule in the asymmetric reduction of PPA into(R)-PLA.The fermentationmedium composition and culture conditionsof recombinant E.coli BL21(DE3)/pET28a-Lc KAR were optim ized to be seed age of 6 h,3%inoculation,induced w ith 0.6 mmol/L IPTG at30℃for 5 h.Under above optimal conditions,the Lc KAR production could reach2.17 kU/L in a 3 L bioreactor.
phenyllactic acid,ketoacid reductase,biocatalysis,asymmetric reduction,fermentation optimization
Q 93
A
1673—1689(2016)09—0950—08
2014-11-12
國家自然科學(xué)基金項目(21276112);國家973計劃項目(2011CB710800);教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃項目(NCET-11-0658)。
倪曄(1975—),女,江蘇無錫人,理學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事生物催化和酶工程方面研究。E-mail:yni@jiangnan.edu.cn