普魯蘭酶突變體文庫高通量篩選方法的建立及應(yīng)用

聶簡琪，　陳阿娜，　劉秀霞，　楊艷坤，　白仲虎*

（1．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

普魯蘭酶突變體文庫高通量篩選方法的建立及應(yīng)用

聶簡琪1，2，3，陳阿娜1，2，3，劉秀霞1，2，3，楊艷坤1，2，3，白仲虎*1，2，3

（1．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

在搖瓶水平實現(xiàn)普魯蘭酶基因 （GenBank Accession No：AX203843）在大腸桿菌BL21（DE3）的異源表達，并成功按規(guī)格縮小實現(xiàn)了基于深孔板的高通量細胞培養(yǎng)，同時建立了基于深孔板的普魯蘭酶酶活快速高效的高通量檢測方法。利用易錯PCR技術(shù)對普魯蘭酶基因進行定向進化，突變基因產(chǎn)物重組于表達載體pET-28a（+）-pelB中，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）構(gòu)建突變體文庫，利用該高通量篩選方法實現(xiàn)了突變體文庫的快速高效篩選并獲得了一株突變菌株4A4，其表達量提高了46.5%。該方法不僅適用于淀粉酶、纖維素酶等酶類的高通量篩選，同時為菌株文庫的篩選以及蛋白質(zhì)的定向進化提供了一種新思路。

普魯蘭酶；深孔細胞培養(yǎng)板；高通量篩選；規(guī)?？s小；突變體文庫

普魯蘭酶 （pullulanase）是一類淀粉脫支酶，能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α-1，6糖苷鍵，切下整個分支結(jié)構(gòu)，形成直鏈淀粉，并且可以將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料，近年來在淀粉加工、紡織及飼料行業(yè)的需求漸增。至今已有多個普魯蘭酶基因得到了異源表達，構(gòu)建并篩選到優(yōu)良的普魯蘭酶突變體有望進一步促進普魯蘭酶的理論和應(yīng)用，但旨在提高普魯蘭酶表達量的研究報道極少［1］。

易錯PCR以其操作簡便、有效等優(yōu)點成為目前應(yīng)用最為廣泛的進化手段之一［2］。但該方法負突變頻率較高，因而必須采用高效快速的篩選方法才能對文庫進行快速精準(zhǔn)的篩選。對于龐大的突變文庫，如何快速高效的進行篩選，較少有相關(guān)研究見諸報道。

1951年培養(yǎng)板（Microtiter Plate，MTP）被設(shè)計出來并主要用于分析領(lǐng)域，由于MTP可進行高通量分析，后逐漸被用于細胞培養(yǎng)、高通量篩選、藥物和酶等次級代謝產(chǎn)物的篩選等研究［3-5］，是菌株高通量篩選中應(yīng)用較廣泛的一種方法。近年來也被逐漸應(yīng)用于菌株篩選與選育等方面。但目前較少研究高通量篩選技術(shù)在蛋白質(zhì)異源表達方面的應(yīng)用。只有實現(xiàn)高通量培養(yǎng)與高通量分析檢測的統(tǒng)一才能整體上實現(xiàn)高通量篩選，而目前如何實現(xiàn)高通量檢測是實現(xiàn)整體高通量的瓶頸。

作者在搖瓶水平實現(xiàn)普魯蘭酶基因（GenBank Accession No：AX203843）的異源分泌表達。實現(xiàn)了基于深孔板的高通量培養(yǎng)并建立了基于深孔板的普魯蘭酶酶活快速高效的高通量檢測方法。利用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建普魯蘭酶基因突變體文庫，并采用該普魯蘭酶高通量篩選方法進行快速高效的篩選，并獲得了一株突變菌株4A4，其表達量提高了46.5%。本研究結(jié)果為普魯蘭酶的異源表達提供了理論基礎(chǔ)，同時建立的普魯蘭酶高通量篩選方法為突變文庫的快速篩選提供了指導(dǎo)，也為普魯蘭酶結(jié)構(gòu)解析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）：作者所在實驗室保藏；質(zhì)粒pET-22b（+）、pET-28a（+）：Novagen公司。本研究所用的菌株和質(zhì)粒及其特性見表1。

表1　菌株與質(zhì)粒Table 1　Strains and plasm ids

1.1.2主要試劑和儀器胰蛋白胨和酵母粉：Oxoid公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶Bgl II、Bam H I、Xho I：NEB公司；T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTaq DNA聚合酶、DNA marker：TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、硫酸卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)及SDS-PAGE凝膠配置試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；其它試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.1.3培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基（LB）（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH調(diào)至7.0。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基（TB/SB）（g/L）：胰蛋白胨12，酵母粉 24，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 12.55，甘油10；pH調(diào)至7.0。

3）LB+：基礎(chǔ)成分與LB培養(yǎng)基一致，誘導(dǎo)時補加終濃度為0.16 mol/L甘氨酸和0.1mol/L NaCl。

4）TB/SB+：基礎(chǔ)成分與TB/SB培養(yǎng)基一致，誘導(dǎo)時補加終濃度為0.16 mol/L甘氨酸和0.1 mol/L NaCl。

1.2方法

1.2.1對照菌株的構(gòu)建采用來自pET-20b（+）-pul的普魯蘭酶基因序列設(shè)計引物：上游引物5’-CGCGGATCCGATTCTACTTCGACTAAAGTTATTGT TC-3’（加下劃線序列為BamH I酶切位點），下游引物 5’-CCGCTCGAGTTGTTTGAGAATAAGCGTAC TTATAGC-3’（加下劃線序列為Xho I酶切位點），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，擴增的片段大小2 784 bp。

以質(zhì)粒pET-20b（+）-pul為模板，反應(yīng)體系為：10μL 5×Q5 Reaction Buffer，4μL dNTPs（10 mmo/L），上下游引物各30 pmol，模板20 pmol，0.5μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，UP水至總體積為50μL。PCR程序為：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，61℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。純化后的產(chǎn)物和pET-28a（+）-pelB載體分別用Bam H I和Xho I雙酶切4 h，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的產(chǎn)物按比例混合后加入T4 DNA連接酶，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子并測序，測序正確的菌株即為對照菌株。

1.2.2發(fā)酵液上清及周質(zhì)空間組分的分離吸取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，8 000 g離心10 min，上清液即為胞外組分。菌體沉淀經(jīng)PBS洗滌2次，用500μL OSI溶液（0.1 mol/L Tris-HCl pH 8，1 mmol/L EDTA，20 g/dL蔗糖）重懸并于室溫振蕩10 min，于8 000 g離心10min，上清液即為OS I組分，用500μL OSII溶液（5 mmol/L MgSO4）重懸并于4℃振蕩10 min，于8 000 g離心10 min，上清液即為OS II組分，將OS I組分與OS II組分合起來即為周質(zhì)空間組分。

1.2.3普魯蘭酶搖瓶產(chǎn)酶條件的確定

1）培養(yǎng)基種類及添加劑對普魯蘭酶表達的影響：將菌株分別接種至裝填25 mL培養(yǎng)基（LB、LB+、TB/SB、TB/SB+）的250 mL的搖瓶中，接種終OD595為0.025，37℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)5.5 h后，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，20℃、200 r/min誘導(dǎo)20 h，收獲并測細胞干重 （dry cell weight，DCW）及上清液、周質(zhì)空間酶活。

2）誘導(dǎo)時間對普魯蘭酶表達的影響：將菌株接種至裝填25 mL TB/SB培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，接種終OD5950.025，37℃、230 r/min分別振蕩培養(yǎng)不同時間（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 h）后加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，20℃，200 r/min誘導(dǎo)20 h后收獲，測干重及上清液、周質(zhì)空間酶活。

3）誘導(dǎo)溫度對普魯蘭酶表達的影響：將菌株接種至裝填25 mL TB/SB培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，接種終OD5950.025，37℃，230 r/min分別振蕩培養(yǎng)5.5 h后，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，不同溫度（16、20、24、28、32℃），200 r/min誘導(dǎo)20 h后收獲并測干重及上清液、周質(zhì)空間酶活。

4）誘導(dǎo)劑濃度對普魯蘭酶表達的影響：將菌株接種至裝填25 mL TB/SB培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，接種終OD5950.025，37℃、230 r/min分別振蕩培養(yǎng)5.5 h后加入不同終濃度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）的IPTG進行誘導(dǎo)，20℃、200 r/min誘導(dǎo)20 h后收獲，測干重及上清液、周質(zhì)空間酶活。1.2.4規(guī)?？s小至MTP將菌株分別接種至裝填2 mL TB/SB培養(yǎng)基的24孔MTP與裝填1 mL TB/SB培養(yǎng)基的48孔MTP中，接種量、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度等參數(shù)均采用搖瓶單因素優(yōu)化后的參數(shù)。不同轉(zhuǎn)速（200、230 r/min）誘導(dǎo)20 h后收獲，測干重及上清液、周質(zhì)空間酶活。

1.2.5易錯PCR擴增及突變體庫的構(gòu)建以質(zhì)粒pET-20b（+）-pul為模板，反應(yīng)體系為：5μL 10× Taq PCR buffer，5μL 10×dNTP混合物 （2 mmo/L dGTP、2mmol/L dATP、10mmol/L dCTP和10mmol/L dTTP），11μL的25mmol/LMgCl2，5μL的5mmol/L MnCl2；上下游引物各30 pmol，模板20 pmol，rTaq DNA聚合酶1μL，加水至總體積為50μL。PCR程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，61℃退火1min，72℃延伸3min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。純化后的產(chǎn)物和pET-28a（+）-pelB載體分別經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切4 h，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的產(chǎn)物按比例混合后加入T4 DNA連接酶，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布固體LB（含50μg/mL的Kan）平板，抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，此即構(gòu)建好的普魯蘭酶基因突變體庫。

1.2.6突變文庫的高通量篩選將結(jié)束發(fā)酵的MTP配平后于4 000 r/min離心10 min，另取96孔MTP，用8通道移液器依次向每孔加入200μL普魯蘭底物 （1%的普魯蘭多糖，0.1 mol/L、pH 5.2的乙酸-乙酸鈉緩沖液），100μL發(fā)酵上清液，用硅膠墊密封后混勻，60℃水浴反應(yīng)10 min，加入450μL DNS試劑終止反應(yīng)后立即沸水浴10min。取96孔酶標(biāo)板，用8通道移液器依次向每孔加入190μL RO水，10μL冷卻后的反應(yīng)液，540 nm下測定吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1重組大腸桿菌的構(gòu)建

圖1為重組表達載體pET-28a（+）-pelB-pul的構(gòu)建過程，經(jīng)雙酶切鑒定見圖2所示。目的基因全長2 770 bp，pET-28a（+）-pelB線性質(zhì)粒大小約5 360 bp，電泳結(jié)果與預(yù)期符合，表明重組表達載體pET-28a（+）-pelB-pul構(gòu)建成功。

圖1　重組質(zhì)粒pET-28a（+）-pelB-pul的構(gòu)建過程Fig.1　Construction of expression pET-28a（+）-pelB-pul vector

圖2　重組質(zhì)粒pET-28a（+）-pelB-pul雙酶（Bam H I/Xho I）切驗證Fig.2　Electrophoresis of digested expression plasm id pET-28a（+）-pelB-pul by Bam H I/Xho I

2.2培養(yǎng)基種類及添加劑對普魯蘭酶表達的影響

為了實現(xiàn)普魯蘭酶的分泌表達，選擇實驗室常用的LB、TB/SB培養(yǎng)基進行了研究。該重組菌在LB培養(yǎng)基中生長狀態(tài)較差，表達的普魯蘭酶量很少，在培養(yǎng)基上清液中幾乎檢測不到酶活，而在TB/SB培養(yǎng)基中，重組菌生產(chǎn)良好，且在上清液和周質(zhì)空間均可檢測到普魯蘭酶酶活，見圖3-4。普魯蘭酶相對分子質(zhì)量為105 400。這主要是由于TB/SB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，可為宿主菌提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，此外提供普魯蘭酶合成的碳骨架。嚴(yán)偉［2］等人通過在誘導(dǎo)時添加甘氨酸和Na+均能有效促進普魯蘭酶的分泌。作者誘導(dǎo)時在培養(yǎng)基中添加了甘氨酸和氯化鈉，顯著地促進了普魯蘭酶的分泌表達。因此選用TB/SB為發(fā)酵培養(yǎng)基并在誘導(dǎo)時添加終濃度為0.16 mol/L甘氨酸和0.1mol/L氯化鈉。

2.3誘導(dǎo)時間對普魯蘭酶表達的影響

由圖5可以看出，誘導(dǎo)時間對普魯蘭酶的分泌表達有顯著影響，誘導(dǎo)時機早于4.5 h或晚于7.5 h均不利于普魯蘭酶的分泌，當(dāng)轉(zhuǎn)接后小于4.5 h時進行誘導(dǎo)，在上清液中難以檢測到普魯蘭酶酶活。當(dāng)轉(zhuǎn)接后5.5 h進行誘導(dǎo)，可發(fā)酵液上清液中普魯蘭酶酶活最高，因此選擇此時進行誘導(dǎo)。

圖3　培養(yǎng)基對普魯蘭酶表達的影響Fig.3　Effect ofmedium on pullulanse expression

圖4　普魯蘭酶表達的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of pullulanse expression

圖5　誘導(dǎo)時間對普魯蘭酶表達的影響Fig.5　Effect of induction time on pullulanse expression

2.4誘導(dǎo)溫度對普魯蘭酶表達的影響

誘導(dǎo)溫度對外源蛋白質(zhì)的合成與分泌極其重要，溫度過高，外源蛋白質(zhì)的合成速度較快，會因來不及折疊而形成不可溶的包涵體，而低溫誘導(dǎo)減慢了外源蛋白質(zhì)合成的速度，使新合成的肽鏈能正確折疊，減少了包涵體的形成［6］。由圖6可以看出，發(fā)酵液上清液以及周質(zhì)空間的普魯蘭酶酶活隨著誘導(dǎo)溫度的升高先升高后降低，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20℃時，發(fā)酵上清液以及周質(zhì)空間的普魯蘭酶酶活最高，因此選擇誘導(dǎo)溫度為20℃。

圖6　溫度對普魯蘭酶表達的影響Fig.6　Effect of temperature on pullulanse expression

2.5誘導(dǎo)劑濃度對普魯蘭酶表達的影響

誘導(dǎo)物IPTG的濃度直接影響目標(biāo)蛋白的表達。由圖7可以看出，不同的IPTG濃度對發(fā)酵上清液中的普魯蘭酶酶活沒有明顯的影響。盡管IPTG添加終濃度0.4 mmol/L時周質(zhì)空間普魯蘭酶酶活最高，但IPTG添加終濃度0.1mmol/L時發(fā)酵上清液中的普魯蘭酶酶活較高，且從成本的角度考慮，選擇IPTG添加終濃度為0.1 mmol/L。

圖7　IPTG濃度對普魯蘭酶表達的影響Fig.7　Effect of IPTG　concentration　on　pullulanse expression

2.6比例縮小至MTP普魯蘭酶表達的影響

高通量培養(yǎng)作為高通量篩選的第一步，只有實現(xiàn)高通量培養(yǎng)方可進行高通量篩選。為了實現(xiàn)高通量培養(yǎng)，將搖瓶規(guī)模的發(fā)酵參數(shù)比例縮小至MTP規(guī)模。MTP做為高通量培養(yǎng)的主要器具，其氧傳遞能力和混合特性會直接影響菌體的生長狀況以及發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。對照菌株在MTP的培養(yǎng)效果見圖8。若完全將搖瓶的發(fā)酵參數(shù)應(yīng)用于MTP中，菌株的生長及普魯蘭的分泌量均有所下降，但24孔MTP要優(yōu)于48孔MTP，更加接近于搖瓶水平。若提高48孔MTP誘導(dǎo)時的轉(zhuǎn)速 （48孔MTP*：230 r/min），提高氧傳遞系數(shù)以及混合效果，菌株的生長及普魯蘭的分泌量均有所提高，接近于搖瓶水平。

盡管96孔MTP的通量高，但其氧傳遞能力和混合特性較差，菌株生長狀況差，24孔MTP在氧傳遞能力和混合特性優(yōu)于48孔/96孔MTP，但其通量僅為48孔MTP的一半，且1mL的發(fā)酵液足夠用于高通量檢測，因此選擇48孔MTP進行高通量培養(yǎng)，誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)速由200 r/min提高到230 r/min。

圖8　不同培養(yǎng)器皿對普魯蘭酶表達的影響Fig.8　Effect of culture vessels on pullulanse expression

2.7普魯蘭酶活高通量檢測體系的建立

由圖9可以看出，當(dāng)以96孔MTP作為反應(yīng)容器進行DNS比色法測定還原糖時，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)為0.996 3，線性良好，CV≤0.07，因此該方法可行。同時與傳統(tǒng)比色管相比，該方法具有以下優(yōu)點：通量高，利用單個96孔MTP可同時處理96個樣品，處理后的樣品可通過8通道或96通道移液器快速轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板中，并在幾分鐘內(nèi)完成信號值的讀??；操作方便，可利用8通道移液器快速完成反應(yīng)體系的配制；節(jié)約試劑材料，反應(yīng)體系僅為750μL，而比色管的反應(yīng)體系一般需要2.5mL。該方法可作為淀粉酶、纖維素酶等的高通量分析檢測。

圖9　DNS比色法測定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9　Standard curve of DNS colorimetric assay

2.8突變體文庫的篩選及搖瓶復(fù)驗

普魯蘭酶高通量篩選流程圖見圖10。陽性克隆轉(zhuǎn)化子經(jīng)過高通量篩選，從突變文庫2 100個轉(zhuǎn)化子中篩選出一株分泌性提高的普魯蘭酶克隆4A4，上清液中普魯蘭酶酶活提高了46.5%。通過在TB/ SB培養(yǎng)基中（不添加甘氨酸和氯化鈉）進行發(fā)酵復(fù)驗，結(jié)果見圖11。在發(fā)酵液上清液以及周質(zhì)空間中，突變株4A4的普魯蘭酶酶活均顯著高于對照菌株。

圖10　普魯蘭酶高通量篩選流程圖Fig.10　Schematic presentation for the high-throughput screening of pullulanase

圖11　搖瓶復(fù)驗突變株的分泌表達Fig.11　Retest secretory expression of mutation strain by shake flask

該高通量篩選方法可同時展開768個克隆的篩選 （考慮到手動操作的疲勞以及搖床的裝載量，以單人完全手動操作以及單個搖床為例），3個批次的篩選即可完成篩選。若采用三角搖瓶進行篩選，工作量將是巨大的，且耗時耗力。

2.9進化酶序列分析

基因測序委托上海生工生物公司完成，利用DNAMAN軟件對野生型與突變體酶基因序列進行比對分析，突變體基因有5個氨基酸發(fā)生突變。L190P/V240D/G386E/V707A/I897V，結(jié)果表明利用易錯PCR方法成功地向普魯蘭酶基因引入了突變。

3　結(jié)語

作者以普魯蘭酶為例闡述了從DNA到進化后酶蛋白的整體流程，首先實現(xiàn)了普魯蘭酶基因（GenBank Accession No：AX203843）的異源表達，并在搖瓶水平對發(fā)酵條件進行了初步研究，單因素優(yōu)化得到的誘導(dǎo)條件為：采用TB/SB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后OD5950.025，37℃、230 r/min培養(yǎng)5.5 h后進行誘導(dǎo)，IPTG終濃度0.1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度20℃，誘導(dǎo)時添加終濃度為0.16mol/L甘氨酸和0.1 mol/L氯化鈉，誘導(dǎo)20 h后，上清液中重組普魯蘭酶的酶活為5.1 U/mL。重組宿主在LB培養(yǎng)基中生長狀況較差，無論周質(zhì)還是上清液，普魯蘭酶的表達量均明顯低于在TB/SB培養(yǎng)，這主要是由于LB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，而LB/SB培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富，宿主菌可達到一個較高的生物量，且有足夠的能量進行異源蛋白質(zhì)的表達。重組宿主的最佳誘導(dǎo)時機為發(fā)酵5.5 h后 （OD595≈6.2），而Xuguo Duan［7］等人研究的誘導(dǎo)時機為OD595為1.0。本研究普魯蘭基因來源于Bacillus acidopullulyticus，后者來源于 Bacillus deramificans，兩者的相似性為63.38%，長度僅相差7個氨基酸，但最適誘導(dǎo)時間卻相差很大。這也表明即使相似性高的基因在進行異源表達時也不能照搬，這也為異源表達帶來一定困難。

高通量篩選技術(shù)的誕生大大的提高了篩選效率，可以減少勞力以及原料成本，大大縮減了研發(fā)成本。規(guī)?？s小至深孔板水平是實現(xiàn)高通量篩選的途徑之一，MTP可比搖瓶縮小至少50倍培養(yǎng)基使用量［8］。但規(guī)模縮小時需要盡量使菌株的培養(yǎng)條件接近于搖瓶乃至發(fā)酵罐，只有這樣通過規(guī)?？s小模型篩選出的菌株以及發(fā)酵參數(shù)在進行規(guī)模放大時才能體現(xiàn)一致性。而OTR（Oxygen Transfer Rate，氧傳遞速率）是進行規(guī)?？s小著重考慮的因素之一，OTR偏低時會使生物量以及產(chǎn)物產(chǎn)量的降低，振蕩頻率、偏心距、裝填體積等對OTR有顯著影響［8-10］，在進行Scale-down時需要對振蕩頻率、偏心距、裝填體積等參數(shù)進行探索以保證縮放的合理性。

易錯PCR是諸多體外定向進化方法中一種簡便、易行的手段，其核心是在PCR系統(tǒng)中引入不同濃度的Mn2+，導(dǎo)致目的基因擴增過程中引入非互補配對堿基。由于絕大多數(shù)突變是有害的［11］，因而必須采用高效快速的篩選方法才能對文庫進行快速精準(zhǔn)的篩選。盡管易錯PCR被廣泛地應(yīng)用于酶的定向進化，但對于龐大的突變文庫的篩選環(huán)節(jié)，多避重就輕或采用低通量的方法［12］。利用透明圈法［13］可作為突變文庫的初篩，在一定程度上大大降低了復(fù)篩的勞動強度。但對于異源表達的蛋白質(zhì)，大都需要誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)方可表達，而宿主菌的最適生長溫度與誘導(dǎo)溫度差異較大，且誘導(dǎo)時機對外源蛋白質(zhì)的表達有顯著影響，因而該方法存在一定的缺陷。該高通量篩選結(jié)合ELISA方法可用于生物醫(yī)藥的研發(fā)。

本研究僅從分泌性作為例證進行該方法的驗證，該方法亦可拓展于耐熱性、耐酸/堿等耐性突變酶的篩選。在精準(zhǔn)度方面，人工手動操作下MTP與搖瓶相差不大，且在配備全自動化設(shè)備進行操作時，MTP的精確度會進一步提高。

本研究結(jié)果為普魯蘭酶的異源表達提供了理論基礎(chǔ)，同時建立的普魯蘭酶高通量篩選方法為突變文庫的快速篩選提供了指導(dǎo)，也為普魯蘭酶結(jié)構(gòu)解析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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科技信息

歐盟評估一種發(fā)酵大豆提取物作為新資源食品的安全性

2016年7月28日，歐盟食品安全局發(fā)布了發(fā)酵大豆提取物NSK-SD○R作為新資源食品的安全性。

發(fā)酵大豆提取物NSK-SD○R經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)處理后納豆激酶酶活性為20 000-28 000纖維蛋白降解單位/克。歐盟評估小組認(rèn)為發(fā)酵大豆提取物NSK-SD○R的產(chǎn)品說明、批次差異性以及穩(wěn)定性較好不存在安全隱患。作為膳食補充劑每天的限量為100mgNSK-SD○R，適宜人群為35歲以上健康人群，孕婦和哺乳期婦女除外。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).歐盟評估一種發(fā)酵大豆提取物作為新資源食品的安全性［EB/OL］.（2016-8-1）.http://news. foodmate.net/2016/08/389608.html

Establishment and Application of High-Throughput Screening M ethod for Pullulanase M utant Library

NIE Jianqi1，2，3，CHEN Ana1，2，3，LIU Xiuxia1，2，3，YANG Yankun1，2，3，BAIZhonghu*1，2，3
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermention Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Carbohydrate Chem istry and Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Pullulanase gene（GenBank Accession No：AX203843）washeterologous expression in BL21（DE3）in shake flask and scale-down to them icrotiter plate scale successfully.Based on microtiter plate，ahigh-throughputculturemethod and an efficienthigh-throughputdetectionmethod for pullulanase activity were established.Random mutagenesis on pullulanase gene was performed through error-prone PCR strategy.The error-prone PCR productswere recombinated in expression vector pET-28a（+）-pelB and then introducted into BL21（DE3）to constructmutant library.The High-throughput screening method for Pullulanase in study was used to screen themutant library efficiently and optimum mutant4A4 was screened，the pullulanase activity in supernatant improved 1.465 folds.Thismethod not only is also applicable to high-throughput screening of amylase andcellulase，but also provides a new way for high-throughput screening of strain library and directed evolution of proteins.

pullulanase，m icrotiterplate，high-throughputscreening，scale-down，mutant library

Q 815

A

1673—1689（2016）09—0993—08

2015-01-09

國家973計劃項目（2013CB733602）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（JUSRP51401A）。

白仲虎（1965—），男，河南鄭州人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物醫(yī)藥蛋白高效表達和過程方面的研究。E-mail：baizhonghu@jiangnan.edu.cn