外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花生理代謝的影響

朱孟炎 于博帆 陳華峰

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花生理代謝的影響

朱孟炎 于博帆 陳華峰*

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

以長(zhǎng)春花為實(shí)驗(yàn)材料，采用珍珠巖為培養(yǎng)基質(zhì)，設(shè)置不同氮素濃度，對(duì)其各器官的初生和次生代謝進(jìn)行了初步研究,結(jié)果如下：植株中3種主要生物堿含量均是隨著外源氮水平的降低而降低，外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花文朵靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿在不同葉位葉片中的積累特點(diǎn)影響較明顯，而對(duì)長(zhǎng)春堿的積累影響較小。在高氮條件下，植物體內(nèi)合成和積累較高水平的游離氨基酸，可能為部分生物堿的合成提供了骨架，并能促進(jìn)生物堿含量的提高。蔗糖含量在不同葉位葉片中也是隨著葉齡的增加而緩慢增加。同時(shí)，高氮水平下，葉片中蔗糖含量明顯高于正常供氮水平下的含量。本研究為提高長(zhǎng)春花中具有重要藥用價(jià)值生物堿的含量提供參考依據(jù)。

長(zhǎng)春花；硝態(tài)氮；物堿；次生代謝

氮元素(N)是植物生長(zhǎng)和發(fā)育的必須營(yíng)養(yǎng)元素，也是植物發(fā)育過(guò)程中重要的限制因素[1]，主要以硝態(tài)氮(nitrate)和氨態(tài)氮(ammonium)兩種形式被植物所吸收利用。這兩種形態(tài)的氮在植物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中硝態(tài)氮是自然界大多數(shù)植物吸收氮的主要形式[2]。硝酸鹽既是營(yíng)養(yǎng)成分，也是氮代謝的主要調(diào)控因子，指導(dǎo)植物的碳流向，合成有利于碳同化生成氨基酸的化合物，它對(duì)植物生長(zhǎng)和新陳代謝有著重要的影響[3]。研究表明，為植物提供較高水平的硝態(tài)氮，會(huì)對(duì)植物地上部生長(zhǎng)起到積極的促進(jìn)作用，同時(shí)也推遲了植物衰老進(jìn)程[4]。氮素通常是作物生產(chǎn)中的主要限制因子[5]。雖然工業(yè)化的氮肥生產(chǎn)解決了土壤—植物之間的氮素供需矛盾,但由于人們片面追求高產(chǎn),盲目大量施用氮肥,一定程度上使作物產(chǎn)量有所提高,但也造成了人力資源浪費(fèi),同時(shí)帶來(lái)諸多弊端如經(jīng)濟(jì)效益下降,利用率下降,環(huán)境污染,生態(tài)環(huán)境條件惡化[6]。植物次生代謝產(chǎn)物的環(huán)境調(diào)控近年來(lái)頗受人們關(guān)注,也有研究報(bào)告光對(duì)植物次生代謝過(guò)程的影響,如對(duì)銀杏中的黃酮苷、高山紅景天中的紅景天苷、喜樹(shù)中的喜樹(shù)堿等次生代謝產(chǎn)物的影響等，但將氮素與可溶性糖聯(lián)系起來(lái)對(duì)長(zhǎng)春花堿的研究不多[7～9]。為了在人工栽培長(zhǎng)春花過(guò)程中提高氮素利用率,并保證目的生物堿含量穩(wěn)定提高，本研究圍繞外源氮水平對(duì)長(zhǎng)春花利用氮素的生理生化特性及氮素對(duì)植物生理生化代謝進(jìn)程的影響，研究氮素水平對(duì)長(zhǎng)春花生理生態(tài)學(xué)，特別是次生代謝產(chǎn)物積累的影響，同時(shí)分析了氮素水平對(duì)不同葉位文朵靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿和長(zhǎng)春堿含量積累的影響，以及氮素水平對(duì)不同葉位中可溶性及游離氨基酸積累的影響。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年3月上旬～7月下旬在東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)植株為播種于本試驗(yàn)室溫室中的長(zhǎng)春花。長(zhǎng)春花種子萌發(fā)后形成的幼苗置于人工氣候箱(CONV IRON,Canada)中進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)[10]。根據(jù)長(zhǎng)春花幼苗光合作用的特點(diǎn)，氣候箱設(shè)置為(500±10) μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間6:00～18:00，培養(yǎng)條件為溫度28℃，濕度60%左右。澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。待長(zhǎng)春花幼苗出現(xiàn)4對(duì)葉片時(shí)開(kāi)始進(jìn)行光強(qiáng)脅迫試驗(yàn)，從培養(yǎng)箱選取長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)架上，分為3個(gè)營(yíng)養(yǎng)梯度，低氮水平(6 mmol·L-1nitrate)中氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)，培養(yǎng)3周后取樣,進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)參數(shù)測(cè)定，重復(fù)次數(shù)分別為3次。在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)比正常氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)培養(yǎng)6周情況下，長(zhǎng)春花不同葉位初生和次生代謝產(chǎn)物的影響，以揭示植物在不同氮水平條件下如何分配體內(nèi)能量和物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花生物堿含量的影響

對(duì)比外源氮水平對(duì)長(zhǎng)春花葉片和葉柄中文朵靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿和長(zhǎng)春堿含量的影響特點(diǎn)(圖1)。圖1可以看出，不管是葉片中還是葉柄中三種主要生物堿含量均是隨著外源氮水平的降低而降低[11]。在低氮水平下，植物葉片中三種主要生物堿含量，包括文朵靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿和長(zhǎng)春堿，均顯著低于正常和高氮水平。但高氮水平條件下，植物葉片中生物堿含量與正常氮水平下無(wú)顯著差別，但葉柄中長(zhǎng)春堿含量在高氮水平下顯著高于正常和低氮水平下的含量。

由圖2可知，根部檢測(cè)出長(zhǎng)春質(zhì)堿含量達(dá)到3 mg·g-1DW，顯著高于葉片中長(zhǎng)春質(zhì)堿含量。同時(shí)低氮水平下，其含量顯著低于其它兩種氮水平下。

2.2外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位生物堿含量的影響

由圖3可知，在正常氮水平條件下，長(zhǎng)春花葉片中文朵靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿含量雖然總體上隨著葉片由幼嫩向成熟變化而呈降低的趨勢(shì)，但差異不大；長(zhǎng)春堿的含量在不同葉位中分布趨勢(shì)性不明顯。

高氮水平條件下，長(zhǎng)春花葉片中文朵靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿含量在不同葉位中均明顯高于正常供氮條件，同時(shí)也隨著葉齡的增加而線性降低；長(zhǎng)春堿含量在第四對(duì)葉片中最高，表明長(zhǎng)春堿優(yōu)先積累在成熟葉片中，幼嫩葉片中含量次之。

總體上看，外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花文朵靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿在不同葉位葉片中的積累特點(diǎn)影響較明顯，而對(duì)長(zhǎng)春堿的積累影響較小[12]。

2.3外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位游離氨基酸含量的影響

植物生物堿的合成和積累與游離氨基酸密切相關(guān)。供氮水平的改變能影響植物葉片中氨基酸的積累，因此對(duì)不同葉位中游離氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)，以觀察不同氮水平對(duì)氨基酸含量的影響特點(diǎn)。

脯氨酸是研究較多的植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一般與滲透脅迫等逆境響應(yīng)密切相關(guān)。結(jié)果顯示，脯氨酸隨著葉片年齡的增加而呈趨勢(shì)性下降的特點(diǎn)，特別是第四對(duì)葉片中脯氨酸含量在正常和高氮水平條件下均顯著低于其它葉位葉片的含量。另外，高氮水平條件下，較幼嫩葉片(第一和第二對(duì))中脯氨酸含量顯著高于正常氮水平條件下的對(duì)照葉片。

圖1 外源氮水平對(duì)長(zhǎng)春花葉片和葉柄中文朵靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿和長(zhǎng)春堿含量的影響 A.文朵靈；B.長(zhǎng)春質(zhì)堿；C.長(zhǎng)春堿Fig.1 Effects of exogenous nitrate levels on vindoline,catharanthine and vinblastine contents in Catharanthus leaf and leafstalk A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

圖2 外源氮水平對(duì)長(zhǎng)春花根中長(zhǎng)春質(zhì)堿含量的影響Fig.2 Effects of exogenous nitrate levels on Catharanthus catharanthine contents in roots

谷氨酸是植物中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存氮元素的氨基酸之一，也是脯氨酸等化合物合成的前體。由圖4可知，在正?；蚋叩较拢劝彼崤c脯氨酸在不同葉位中的分布情況相反，它隨著葉齡增加而增加，在成熟葉片中含量最高，是前三對(duì)葉片中含量的2倍左右[13]。

不同葉位葉片中總游離氨基酸含量與游離氨的含量變化趨勢(shì)相似，均隨著葉齡增加而呈明顯下降趨勢(shì)，該趨勢(shì)在高氮水平條件下更加顯著。同時(shí)，高氮條件下，不同葉位葉片中的總游離氨基酸含量與游離氨均顯著高于正常供氮條件。可以看出，游離氨的含量對(duì)總游離氨基酸含量的提高具有一定的促進(jìn)作用。

相關(guān)性分析表明，總游離氨基酸含量與游離氨在不同葉位中的分布情況與文朵靈及長(zhǎng)春質(zhì)堿含量變化特點(diǎn)相關(guān)性顯著(P<0.05)。由于生物堿是含氮化合物，在高氮條件下，植物體內(nèi)合成和積累較高水平的游離氨基酸，可能為部分生物堿的合成提供了骨架，能促進(jìn)生物堿含量的提高。

圖3 不同供氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位葉片中3種生物堿含量的影響 A.文朵靈；B.長(zhǎng)春質(zhì)堿；C.長(zhǎng)春堿Fig.3 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of three kinds of alkaloids in C.roseus leaves A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

圖4 不同供氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位葉片中游離氨基酸含量的影響 A.脯氨酸；B.谷氨酸；C.游離氨基酸；D.游離氨Fig.4 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in C.roseus leaves A.Proline; B.Glutarmate; C.Free amino acide; D.Ammonium

2.4外源硝態(tài)氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位可溶性糖含量的影響

由圖5可知，長(zhǎng)春花葡萄糖含量在不同葉位中差異不顯著，但高氮水平下，不同葉位葉片中葡萄糖的含量均顯著高于正常供氮水平。

正常供氮水平條件下，長(zhǎng)春花葉片中果糖含量隨著葉齡增加而線性提高，但在高氮水平下，不同葉位葉片中果糖含量變化不顯著，并明顯低于正常供氮水平下不同葉片中的含量。果糖含量在葉片中能反映植物衰老的情況，正常供氮情況下，由于氮源有限，因此植物將固定的能量和物質(zhì)優(yōu)先分配于幼嫩葉片中，果糖較低。而在高氮水平下，由于植物氮資源較豐富，延緩了葉片的衰老進(jìn)程，因此葉片中果糖含量變化不顯著。

蔗糖含量在不同葉位葉片中也是隨著葉齡的增加，而緩慢增加，第4對(duì)葉片中的蔗糖含量達(dá)到最高值。同時(shí)，高氮水平下，葉片中蔗糖含量明顯高于正常供氮水平下的含量。原因可能是，較豐富的氮資源促進(jìn)了植物光合作用，提高了植物碳固定量，蔗糖作為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的重要分子，因此在高氮水平下其含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

圖5 不同供氮水平對(duì)長(zhǎng)春花不同葉位葉片中可溶性含量的影響 A.葡萄糖；B.果糖；C.蔗糖Fig.5 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in different leaf position leaves of C.roseus A.Glucose; B.Fructose; C.Sucrose

2.5外源硝態(tài)氮水平下長(zhǎng)春花不同葉位初生和次生代謝物質(zhì)含量之間相關(guān)性分析

為了揭示長(zhǎng)春花主要三種生物堿積累受不同氮水平和發(fā)育階段的調(diào)控特點(diǎn)，我們對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析(n=40)。由表1可知，文朵靈與長(zhǎng)春質(zhì)堿含量顯著相關(guān)，同時(shí)這兩種生物堿與總游離氨基酸、脯氨酸及游離氨之間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P<0.01)。但長(zhǎng)春堿積累與其它代謝物質(zhì)積累之間相關(guān)性不顯著。

表1長(zhǎng)春花不同葉位葉片中三種生物堿含量與其它代謝物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

Table1CorrelationanalysisbetweenthreekindsofalkaloidswiththeothermetabolitesindifferentlypositionalleavesofC.roseus

注：*表示顯著水平小于0.05;**表示顯著水平小于0.01。

Note：*Correlation is significant at the 0.05 level;**Correlation is significant at the 0.01 level.

3 討論

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《植物研究》編輯部

National Natural Science Foundation of Youth Science Foundation(31400337)

introduction：ZHU Meng-Yan(1991—),female,senior engineer,mainly engaged in plantphysiology research work.

date:2016-01-15

EffectsofNitrateNitrogenLevelsonPhysiologicalMetabolismofCatharanthusroseus

ZHU Meng-Yan YU Bo-Fan CHEN Hua-Feng*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

WithCatharanthusroseus, we used perlite as culture substrate to study the biomass and secondary metabolism. Three main alkaloids in plants were decreased with reduced levels of nitrogen. The level of exogenous nitrate on vindoline and Catharanthine inC.roseuswas with more significant accumulation in the leaves at different leaf positions, but with little effect on the accumulation of vinblastine. In high nitrogen condition, the plant synthesis and accumulation were at higher levels of free amino acids, which may provide the skeleton and promote the improvement of alkaloids in the partial synthesis. The content of sucrose in different position leaves was increased slowly with the increase of age. The content of sucrose in leaf at higher nitrogen level was significantly higher than that at normal nitrogen level. This research provide the reference basis that the important medicinal value for improving the content of alkaloid.

Catharanthusroseus;nitrate nitrogen;alkaloid;secondary metabolism

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31400337)

朱孟炎(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究工作。

* 通信作者：E-mail:biginsect2002@163.com

2016-01-15

* Corresponding author：E-mail:biginsect2002@163.com

S143.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.008