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    天津地區(qū)滑舌鰨養(yǎng)殖水體微生物多樣性研究

    2016-11-09 07:17:29馬超鄭德斌賈磊張博肖廣俠
    農業(yè)與技術 2016年15期

    馬超++鄭德斌++賈磊++張博++肖廣俠

    摘 要:天津半滑舌鰨工廠化水產養(yǎng)殖已經實現(xiàn)了快速的發(fā)展,本文對A1(漢沽地區(qū)養(yǎng)殖所用水源)、A2(漢沽區(qū)域流水式養(yǎng)殖水體)、B1(漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體)、B2(漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1)、Bb(漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體)、C1(大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體)、C2(大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1)、Cb(大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體)8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物,利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究,初步獲取微生物遺傳信息。分析方法主要為對16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列進行PCR擴增,并對拼接后的序列進行分析,包括OTUs(Operational Taxonomic Uints)的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。通過分析可知8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物多樣性之間存在著一定的差異。

    關鍵詞:半滑舌鰨養(yǎng)殖;水體微生物;多樣性分析

    中圖分類號: S966 文獻標識碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20160832010

    目前野生半滑舌鰨數量驟減,大部分都為養(yǎng)殖品種。半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖是天津水產養(yǎng)殖的支柱產業(yè)之一。其經濟價值高,適合工廠化養(yǎng)殖,在我國已形成了較大的養(yǎng)殖規(guī)模。半滑舌鰨的養(yǎng)殖環(huán)境與半滑舌鰨的生長及病害發(fā)生息息相關,因此分析工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨水環(huán)境中微生物的多樣性,對于研究半滑舌鰨的生長和病害發(fā)生有著重要意義。

    本文利用宏基因組技術對天津市工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨的水環(huán)境中的微生物多樣性進行研究,初步獲取微生物遺傳信息,解讀半滑舌鰨養(yǎng)殖水環(huán)境中細菌優(yōu)勢類群及其豐度,揭示半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群特征,分析其菌群的組成和功能。探討?zhàn)B殖水環(huán)境微生物群落同魚病之間的關系,探求微生物群落對魚體健康的影響,以期從養(yǎng)殖池原位環(huán)境鑒定并篩選具有潛在益生作用的功能微生物。

    1 實驗方法

    1.1 從樣品中提取總DNA后,針對16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列設計特異性引物進行PCR擴增

    對擴增后的產物進行提純,末端修復,連上接頭、測序引物后,采用IlluminaMiSeq進行測序。

    1.2 分析流程

    對于測序所得到的序列,通過去除低質量、接頭污染等過程完成數據過濾,得到可信的目標序列,用于后續(xù)分析。過濾后的序列,稱為Clean data或Clean Reads,將雙端測序相應的read1與read2(read1與read2是指分別從5和3端2個方向測序所得到的序列片段)進行拼接;利用軟件QIIME 1.8.0版本對拼接后的序列進行分析,包括OTUs(Operational Taxonomic Uints)的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。

    2 結果分析

    2.1 數據過濾統(tǒng)計

    某些原始序列帶有adapter序列,或含有少量低質量序列。經過一系列數據過濾處理以去除雜質數據,得到Clean Reads。Raw Reads包含低質量的序列、接頭污染的序列、含N比例大于5%的序列,以及Clean Reads。Clean Reads所占的比例越高,數據質量越好,根據每種序列所占的比例繪制如下柱狀圖,可以直觀地反映數據過濾情況。

    2.2 數據量統(tǒng)計

    數據經過過濾得到Clean Data,下圖為本項目全部樣本的Clean Data數據量統(tǒng)計圖,可以很直觀看出Clean Data數據量已滿足要求。

    2.3 測序數據質量值分布

    為了反映Clean Data的質量,以保證分析的準確性,以Q30/Q20堿基百分比作為指標進行統(tǒng)計,Q30/Q20堿基百分比越大說明測序錯誤率小于0.1%/1%的堿基在總堿基中的比例越大。下圖以所有樣本為橫軸,以Q30百分比作為對應的縱軸直觀地反映了最終過濾后的數據質量,同時也反映了過濾后各個樣本的質量的均一性(每個樣本的Q30堿基百分比相近)。

    為了粗略反映測序過程中測序質量的穩(wěn)定性,以Clean Reads的堿基位置作為橫坐標,每個位置的平均測序質量值作為縱坐標,得到每個樣本測序質量分布圖:

    2.4 物種比較分析

    在了解每個OTUs對應的物種后,由于存在同一個物種具有多個不同的OTUs的情況。把具有相同物種分類的OTUs合并到一起,統(tǒng)計不同樣品間的物種成分變化,可以了解不同樣品之間的菌群多樣性。如下柱狀圖展示的是Phylum level下的各個樣品中的物種分布:

    2.5 Alpha多樣性分析

    Alpha多樣性展示的是樣品內的菌群的多樣性情況,包括菌種的類別豐富度以及菌種數目的均勻度。Alpha多樣性越高即細菌種類越豐富,細菌數目越均勻則表示此群落愈加穩(wěn)定。根據4種不同的計算指標在不同的取樣深度下求得了alpha多樣性chao1度量指標的值,如下圖所示:

    區(qū)域Bb的物種多樣性最強,其次為C2和B1,區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

    2.6 Beta多樣性分析

    Beta多樣性展示的是樣品間的菌群的差異情況,根據樣品的物種分布,計算了unweightedUniFrac距離(只考慮各樣品中的物種類別差異)和weighted UniFrac距離(考慮了樣品之間物種類別差異以及各類別物種的豐度的差異)。

    然后,對樣品間的距離矩陣進行主成分分析,做出如下的三維PCA圖。

    3 小結

    對A1、A2、B1、B2、Bb、C1、C2、Cb8個養(yǎng)殖區(qū)域的微生物,利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究,并對拼接后的序列進行分析(OTUs(Operational Taxonomic Uints)的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等),各個區(qū)域的物種多樣性之間存在著一定的差異,其中區(qū)域Bb的物種多樣性最強,C2和B1次之,區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

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