移植腎急性排斥反應(yīng)相關(guān)免疫基因芯片的應(yīng)用

宋文利，鄭建明，莫春柏，馮剛（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300192）

移植免疫學(xué)的發(fā)展和外科技術(shù)的成熟，使器官移植從夢想變成了現(xiàn)實，并已成為一門體現(xiàn)醫(yī)院綜合實力的新型學(xué)科。腎移植作為器官移植的代表，是治療終末期腎病的有效措施[1]。我國的腎移植發(fā)展更為迅速。腎移植術(shù)后1年的移植物存活率不斷提高，但長期（10年）存活率卻停滯在10年前的水平[2]。

盡管各種新型免疫抑制劑的應(yīng)用使人、腎存活率得到了很大程度的提高，但移植排斥反應(yīng)仍然是器官移植所面臨的主要障礙。急性排斥反應(yīng)（AR）是最為常見的排斥反應(yīng)，約35%的腎移植受者在移植后1年內(nèi)發(fā)生過AR[3]。AR也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)（CR）發(fā)生的一個重要危險因素[4]。因此，AR的早期診斷及干預(yù)，對移植腎功能的恢復(fù)至關(guān)重要。盡管移植腎活檢仍然是移植腎排斥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但受穿刺活檢有創(chuàng)性檢查及患者意愿的限制，更愿意接受非侵襲性的診斷方法，細(xì)胞因子在器官移植AR的發(fā)生和發(fā)展中的作用受到了廣泛的重視和深入的研究。

移植腎活檢標(biāo)本的基因研究表明，細(xì)胞因子、趨化因子、信使核糖核酸等標(biāo)記物在移植腎失功的診斷中扮演重要角色[6]。移植物進入機體后其人類白細(xì)胞抗原（HLA）致敏機體免疫細(xì)胞，激活的免疫細(xì)胞通過識別移植物細(xì)胞，產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10）、γ- 干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF）等多種細(xì)胞因子，引起免疫排斥反應(yīng)，而細(xì)胞因子常常在排斥反應(yīng)早期即被釋放，因此，可以作為排斥反應(yīng)的早期診斷指標(biāo)。研究表明，采用基因表達譜芯片能夠研究大鼠肝移植后發(fā)生AR時T淋巴細(xì)胞作用的分子機制[7]。

基因芯片技術(shù)作為一種工具，是指在固相支持物上將大量DNA探針以微陣列的方式固化，具有高通量的特點，為解析腎移植中復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一項嶄新的技術(shù)手段。

1 資料與方法

1.1 樣本資料選擇：選取天津市第一中心醫(yī)院實施的同種異體腎移植術(shù)712例，對可能具有良好依從性及門診能追蹤隨訪的217例患者，于腎移植術(shù)當(dāng)日（術(shù)前）取10 ml外周血作為隨訪血樣庫，其中發(fā)生AR確診的患者在移植腎穿刺活檢的當(dāng)日（治療前）取10 ml外周血作為實驗血樣，以其在隨訪血樣庫中的血樣作為對照樣本。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。所有入選的患者按病例編號。

1.2 樣本資料處理：所有血樣均采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。淋巴細(xì)胞分離：在無菌條件下采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核淋巴細(xì)胞，用無RNA酶的PBS清洗細(xì)胞，并回收細(xì)胞，置于液氮中保存。

總RNA提?。翰捎肨rizol試劑提取總RNA，加入RNase-free H2O完全溶解RNA，以電泳和吸光度值進行檢測驗證，將總RNA在-80℃中保存。

探針標(biāo)記：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用隨機引物標(biāo)記試劑盒，Cy3標(biāo)記術(shù)前樣品，Cy5標(biāo)記腎穿刺當(dāng)日樣品。

1.3 基因芯片：選擇本實驗平臺前期提供的基因芯片，由轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、α-干擾素（IFN-α）、IL-10、受激活調(diào)節(jié)正常細(xì)胞表達和分泌因子（RANTES）、白細(xì)胞介素（IL-2、IL-7，IL-10、IL-15、IL-4、IL-8），F(xiàn)as配體，穿孔素，顆粒酶B、IFN-γ等475個基因構(gòu)建，通過BLAST比對特異序列片斷，根據(jù)實驗預(yù)定的分辨度范圍設(shè)計探針。芯片雜交：取30 μl雜交混和液 （PCR產(chǎn)物，100 μg/ml鮭精 DNA，2×SSC，1%SDS，ddH2O）覆蓋片基上點好的矩陣區(qū)域，加放蓋玻片。保濕條件下雜交盒中置于雜交艙40℃放置2小時。

1.4 數(shù)據(jù)分析：基因芯片技術(shù)可以同時檢測上萬個基因的表達水平，然而從樣本準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)處理的過程中每一步都可能導(dǎo)致誤差和偏移，標(biāo)準(zhǔn)化可以調(diào)整標(biāo)記效率的差異和不同芯片上熒光強度的差別。

1.4.1 線性標(biāo)準(zhǔn)化：設(shè)R為Cy5的熒光強度值，G為Cy3的熒光強度值，A＝1/2Log2（RG）。理論上所有點都應(yīng)該滿足下面的方程：M＝b0 + b1A，根據(jù)最小二乘法的原理計算出直線方程，并對每個點進行校正。

1.4.2 不同芯片的整體標(biāo)準(zhǔn)化：假設(shè)Cy3或Cy5的熒光強度為P，M＝Log2（P），α為M的中位數(shù)。理論上所有芯片上的Cy3或Cy5的α都應(yīng)該相等，取所有α值的中位數(shù)來對所有的Cy3和Cy5的熒光強度值進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.3 共同差異基因的篩選：計算線性標(biāo)準(zhǔn)化后Cy5或Cy3的比值為Ratio值，Ratio值＞1.5或＜0.67為1.5倍差異表達基因。

1.4.4 差異基因功能：用GoMiner軟件分析共同差異表達基因的功能。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提?。▓D1）：從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，電泳結(jié)果顯示18 s和28 s條帶清晰，對照樣品和實驗樣品的OD260/OD280值均大于1.90。

2.2 雜交后芯片掃描（圖2）：芯片雜交后檢測熒光信號，Cy3/Cy5激發(fā)后的熒光可以被ScanArry GX基因芯片掃描儀捕獲。

圖1 總RNA電泳圖

圖2 雜交芯片掃描結(jié)果（a：Cy3標(biāo)記，b：Cy5標(biāo)記）

2.3 排異組差異基因：計算線性標(biāo)準(zhǔn)化后Cy5或Cy3的比值為Ratio值，Ratio值＞1.5或Ratio值＜0.67為1.5倍差異表達基因。Ratio值＞1.5的上調(diào)表達基因為20個（表1），Ratio值＜0.67的下調(diào)表達基因為11個（表2）。

表1 排異組上調(diào)基因（±s）

表1 排異組上調(diào)基因（±s）

編號 基因 Raito值1 IL-4 3.368±1.225 2 IL-6 4.528±1.078 3 IL-10 3.456±0.896 4 IL-2 2.980±1.098 5 IL-15 1.987±0.556 6 INF-γ 2.445±0.034 7 TNF-α 2.887±0.226 8 CD126 2.980±0.336 9 CTLA-4 3.123±1.445 10 IL-5 2.776±1.036 11 IL-13 1.678±0.047 12 IL-18 2.128±0.365 13 CD40L 4.187±1.479 14 Perforin 2.567±1.086 15 Granzyme B 2.433±0.556 16 FasL 4.067±2.765 17 MCP1 1.789±0.331 18 CD30 4.356±2.656 19 HLA-DR 3.677±1.032 20 MIP-1 2.045±0.089

表2 排異組下調(diào)基因（±s）

表2 排異組下調(diào)基因（±s）

編號 基因 Ratio 1 TGF-β 0.485±0.035 2 RAB5C 0.297±0.218 3 RAB6C 0.452±0.104 4 RAB10 0.360±0.071 5 IL-17 0.344±0.025 6 IL-12 0.356±0.008 7 CD4 0.298±0.165 8 CD47 0.378±0.088 9 CD24 0.229±0.122 10 CD79B 0.388±0.104 11 CD81 0.412±0.036

3 討 論

同種異體腎移植所致AR的發(fā)生，主要是由抗原識別，淋巴細(xì)胞的增殖、分化，靶細(xì)胞的損傷等一系列免疫反應(yīng)引起的[8]。往往能夠?qū)е乱浦彩。词构┠I得到挽救，大多也會對腎功能具有近期和遠(yuǎn)期的影響。

研究人類基因的功能，特別是基因之間相互作用和調(diào)控關(guān)系，迫切需要一種新的方法，以大規(guī)模、高通量的方式進行成千上萬個基因在各種生理狀態(tài)下表達狀況的研究[9]?；蛐酒菣z測樣本中上千個基因表達的新方法，不依賴于事先知道哪些基因參與AR。有利于篩查移植組織AR時表達的基因，認(rèn)識排斥機制和診斷[10]。Akalin等[11]應(yīng)用基因芯片分析了人移植腎活檢標(biāo)本中6 800個基因的表達，比較了7例急性細(xì)胞學(xué)排斥的標(biāo)本和3例沒有發(fā)生排斥的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)前者有32～219個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上調(diào)?；蛐酒查_始應(yīng)用于移植腎失功的基因組分析[12]。

目前預(yù)防和治療AR的方法主要是應(yīng)用甲潑尼龍為主的免疫抑制劑治療，雖然目前的免疫抑制劑方案已經(jīng)顯著改變了AR的臨床表現(xiàn)，但在移植物功能沒有明顯受損的情況下，通過非侵襲性或低侵襲性的方法及時、準(zhǔn)確地檢測出能夠發(fā)展為慢性排斥的AR，仍然是一個重要課題[13]。通過基因芯片技術(shù)識別AR的特征，可以對任何免疫抑制方案的患者進行免疫抑制狀態(tài)的評價，從而判斷其免疫抑制是否足夠。這將為減少免疫抑制劑提供安全保障，因為可以通過這種方法檢測移植腎情況，在移植腎出現(xiàn)明顯損傷之前發(fā)現(xiàn)排異反應(yīng)?；蛐酒夹g(shù)也可以應(yīng)用于新型免疫抑制劑的研發(fā)，特別是建立免疫抑制劑的劑量相關(guān)性反應(yīng)及與傳統(tǒng)免疫抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用。

本研究中我們初步得出了與移植腎AR相關(guān)的差異基因。據(jù)此來預(yù)見、診斷移植腎的AR，從而實現(xiàn)移植AR診斷方法上的重復(fù)性、低侵襲性與良好敏感性、特異性結(jié)合的目標(biāo)，進而實現(xiàn)免疫抑制方案的個性化，還需要進一步研究證實。