兩種病因弱視幼貓視網(wǎng)膜中NOS和GABA的表達

王晗敏，榮　翱，莫利娟，李青松，張興儒

?

·實驗論著·

兩種病因弱視幼貓視網(wǎng)膜中NOS和GABA的表達

王晗敏1，榮翱2，莫利娟1，李青松1，張興儒1

1Department of Ophthalmology, Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China;2Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Shanghai 200065, China

?METHODS:A total of 18 aged 3-week kittens were randomly divided into monocular deprivation, strabismus and normal groups. All types of amblyopia were developed in the experimental eyes that were detected by P-VEP 12wk later. The cats were killed and the immunocytochemistry staining method were applied to observe under the light microscope the changes of distribution and positive cells areas of NO and GABA across the amblyopic retinal, compared to that from the normal cats of identical age.

?RESULTS: The P-VEP showed that the amplitude of wave P1 was lower (P<0.05) and the P1 latent time was longer (P<0.05) in two types of amblyopic cats than those in the normal cats. Compared to the normal cats, the NO and GABA positive cells areas were obviously reduced (P<0.05) across the retina in the amblyopic cats. But no significant difference was found between two kinds of amblyopic cats.

?CONCLUSION:The NO and GABA play an important role in the formation of amblyopia in the level of retinal.

目的：分別利用單眼瞼縫合法和外直肌離斷法建立兩種不同病因的幼貓弱視模型，探討一氧化氮(NO)和γ-氨基丁酸(GABA)這兩種神經(jīng)遞質(zhì)在兩種弱視形成過程中的作用。

方法：3周齡幼貓18只，隨機分為正常組、形覺剝奪組、斜視組，利用單眼瞼縫合法和外直肌離斷法建立兩種病因的幼貓弱視模型，12wk后行圖形視覺誘發(fā)電位檢測。摘取眼球做病理切片，使用免疫組化染色法檢測兩組弱視眼和正常組視網(wǎng)膜中NOS和GABA的表達。

結(jié)果：形覺剝奪組、斜視組12wk與同齡正常組圖形視覺誘發(fā)電位(P-VEP)比較，均可見P1波潛伏期延長、振幅下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。弱視組視網(wǎng)膜內(nèi)的NOS和GABA免疫陽性神經(jīng)元染色淡，平均陽性面積減少，與同齡正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。弱視組間視網(wǎng)膜中的NOS和GABA平均陽性面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

結(jié)論：NO和GABA的水平降低可能導致弱視眼視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)興奮性的改變，二者在弱視形成過程中起著重要作用。

弱視；圖形視覺誘發(fā)電位；一氧化氮；γ-氨基丁酸

引用：王晗敏，榮翱，莫利娟，等.兩種病因弱視幼貓視網(wǎng)膜中NOS和GABA的表達.國際眼科雜志2016;16(11):2006-2009

0　引言

弱視是兒童的常見眼病，據(jù)文獻報道其患病率為2%～4%[1]。臨床上以斜視性弱視與形覺剝奪性弱視最為常見。目前弱視發(fā)病機制的研究主要認為是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)環(huán)路、突觸連接等不同水平的可塑性學說，其具體機制并不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在連接精細化發(fā)育(突觸連接的可塑性)過程中，一氧化氮(nitric oxide，NO)作為逆行信使參與了突觸前后的相互通訊，而γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)則作為一種重要的視覺神經(jīng)遞質(zhì)參與了視覺這種復雜的神經(jīng)活動。本研究建立兩種病因弱視模型，通過觀察一氧化氮合酶(NOS)和γ-氨基丁酸(GABA)在視網(wǎng)膜中的表達，探討NO和GABA這兩種神經(jīng)遞質(zhì)在弱視形成過程中的作用。

1　材料和方法

1.1材料實驗選用3周齡普通家養(yǎng)幼貓18只，雌雄不論，常規(guī)檢查雙眼，確認外眼、屈光間質(zhì)以及眼底無異常。隨機分為3組：單眼形覺剝奪組、單眼斜視組、正常對照組，每組各6只。

1.2方法

1.2.1斜視幼貓模型制備[2]每只幼貓隨機挑選1眼，共6只6眼。30g/L戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒，開瞼，顳側(cè)球結(jié)膜下注射少量利多卡因，沿角膜緣外2mm剪開球結(jié)膜并分離周圍筋膜組織，充分暴露外直肌并勾出后沿附著點離斷，予氧氟沙星眼液滴眼，每日3次。術(shù)后采用角膜映光法測得平均內(nèi)斜15°～25°。

1.2.2形覺剝奪性斜視模型制備每只幼貓隨機挑選1眼，共6只6眼。30g/L戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，20g/L利多卡因0.4mL瞼緣皮下浸潤麻醉，側(cè)臥位固定，剪除瞼緣周圍毛發(fā)，常規(guī)消毒，剪除中內(nèi)1/3處至外眥1～1.5mm寬的上下瞼緣，分層縫合皮膚及皮下組織，封閉瞼裂。術(shù)眼紗布包敷，慶大霉素沖洗眼瞼每日1次。

1.2.3弱視模型鑒定各組幼貓飼養(yǎng)12wk后，采用重慶國特視覺電生理儀完成圖形視覺誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential，P-VEP)的記錄。將麻醉后的貓固定，調(diào)整貓的頭位，置刺激顯示屏于被測眼前50cm，并保證與被測眼在同一水平，遮擋對側(cè)眼。以翻轉(zhuǎn)棋盤格作為刺激，對比度96%，屏幕亮度140cd/m2，刺激頻率2.4Hz，分析時間250ms，疊加100次，所采集的電信號輸入計算機處理后并打印。

1.2.4眼球標本制備及免疫組化染色40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉處死動物，完整摘除眼球，沿角膜緣剪開眼球，去除晶狀體及玻璃體，取眼球壁，以中央凹為中心取直徑5mm的中央?yún)^(qū)，放入組織固定盒，標號后置于4%多聚甲醛的PBS緩沖液中，常溫固定24h。行石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，30mL/L H2O2浸泡10min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×3min，微波輻射抗原修復大約20min。滴加正常山羊血清封閉后加1∶100稀釋的兔抗人NOS及兔抗人GABA，以PBS代替一抗，水洗，蘇木素襯染30s，水洗，鹽酸乙醇藍化2s，水洗，微波藍化，常規(guī)樹脂封片。光鏡下拍攝圖片，計算機圖像分析測量免疫組化圖像中陽性區(qū)域面積。

2　結(jié)果

2.1P-VEP記錄結(jié)果統(tǒng)計學分析，12wk時，單眼形覺剝奪組的P波潛伏期較正常組明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.478，P<0.05)，單眼斜視組的P波潛伏期較正常組明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.558，P<0.05)，單眼形覺剝奪組的P波振幅較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.168，P<0.05)，單眼斜視組的P波振幅較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.295，P<0.05，表1)。

表1形覺剝奪組、斜視組與正常組P1波比較

±s

表2弱視組與正常組視網(wǎng)膜NOS及GABA陽性面積比較

，μm2)

注：aP<0.05，bP<0.01vs正常組。

2.2弱視眼視網(wǎng)膜中NOS陽性細胞面積變化光鏡下觀察，正常組視網(wǎng)膜內(nèi)的NOS免疫陽性神經(jīng)元較多，胞體較大，多分布于神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層，胞體和近端樹突染色較深，呈棕褐色。陽性區(qū)域面積為1696.20±151.90μm2。兩組弱視組視網(wǎng)膜內(nèi)均可見NOS免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡。其陽性細胞區(qū)域面積為：形覺剝奪組1072.36±101.67μm2，斜視組1173.34±123.77μm2。兩組弱視組的NOS陽性區(qū)域面積分別與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000)。兩組弱視組間NOS陽性區(qū)域面積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.211)。

2.3弱視眼視網(wǎng)膜中GABA陽性細胞面積變化在光鏡下，正常組視網(wǎng)膜內(nèi)的GABA免疫陽性神經(jīng)元較多，細胞染色深呈棕褐色，胞體較大，多位于內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層和神經(jīng)纖維層，高倍鏡下，陽性細胞呈圓形或卵圓形，胞體及軸、樹突內(nèi)有免疫陽性物質(zhì)，細胞核著色不明顯。陽性區(qū)域面積為：2589.81±239.28μm2。兩組弱視組視網(wǎng)膜內(nèi)均可見GABA免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡，胞核皺縮。其陽性區(qū)域面積為：形覺剝奪組1939.41±105.76μm2，斜視組1894.45±155.45μm2。兩組弱視組GABA陽性區(qū)域面積分別與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000)。兩組弱視組間GABA陽性區(qū)域面積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.758，表2，圖1、2)。

3　討論

3.1NO在弱視眼視網(wǎng)膜中的表達及作用NO作為一種逆行信使加強興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放，穩(wěn)定突觸前后的連接；能依據(jù)不同的突觸活性發(fā)揮興奮性或抑制性作用，選擇性地增強被激活的神經(jīng)通路，而抑制周圍不被刺激的神經(jīng)通路。近年來研究表明，NO可影響視覺的發(fā)育，參與視覺的形成、整合和傳遞，推測NO可影響弱視的形成[3]。而NO是在一氧化氮合酶(NOS)催化下由L-精氨酸分解為L-肌氨酸和NO而來的，只有那些能夠合成NO的細胞才存在NOS，因此可以利用純化的NOS制備抗體進行免疫組織化學染色，顯示含有NOS的神經(jīng)細胞，這種NOS陽性細胞的分布面積能夠間接反映內(nèi)源性NO水平[4]。

本研究采用免疫組化的方法檢測兩種病因弱視貓視網(wǎng)膜中NOS的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種病因弱視，關(guān)鍵期內(nèi)的異常視覺經(jīng)驗均造成了視網(wǎng)膜中NO及NOS含量減少，與正常眼相比，差異有統(tǒng)計學意義。說明NOS陽性細胞數(shù)受到異常視覺經(jīng)驗的影響，推測NO可能在各種病因弱視的形成過程中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)，在大鼠、兔、貓、猴及人的視網(wǎng)膜中均存在NOS陽性神經(jīng)細胞，主要分布于水平細胞、無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞[5]。有實驗證明，NO可能是無長突細胞的神經(jīng)遞質(zhì)之一。這些NOS陽性細胞與雙極細胞、神經(jīng)節(jié)細胞形成突觸，在視網(wǎng)膜內(nèi)與一些神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽共同參與視覺形成、局部整合、信息傳遞和調(diào)節(jié)神經(jīng)節(jié)細胞的on/off感受野的功能[6]?？梢奛O可能參與了視網(wǎng)膜視覺沖動突觸傳導的過程，并通過調(diào)節(jié)一些神經(jīng)遞質(zhì)的表達，影響視覺信號傳導的強弱?？赡艿挠绊憴C制為：(1)NO水平的降低與視網(wǎng)膜細胞突觸傳遞的興奮性降低有關(guān)。已有研究表明，內(nèi)源性NO調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能的主要生理作用是易化興奮[7]，大量的電生理研究已經(jīng)證實異常的視覺經(jīng)驗導致弱視眼視覺沖動傳遞的抑制及興奮性降低，推測這可能與內(nèi)源性NO水平降低有一定的聯(lián)系。(2)NO通過介導興奮性氨基酸遞質(zhì)引起cGMP的變化而起作用[8]。谷氨酸為視網(wǎng)膜最常見的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，關(guān)鍵期內(nèi)的異常視覺經(jīng)驗使視網(wǎng)膜失去清晰的光刺激，興奮性刺激的減少使谷氨酸生成減少，通過反饋機制導致NOS水平下降，從而導致NO合成不足，不足以升高細胞內(nèi)的環(huán)鳥苷酸(cGMP)的含量，以致于不能活化依賴cGMP的蛋白激酶，影響視覺的形成、整合和傳遞。(3)NOS陽性神經(jīng)元廢用性發(fā)育障礙[9]。異常的視覺經(jīng)驗使弱視眼相應輸入層長期失去正常視信息的刺激，導致NOS神經(jīng)元發(fā)育障礙，使得正常的突觸聯(lián)系的建立受阻，進一步使視沖動的傳遞受到抑制，視功能減弱從而形成了弱視。我們認為，異常視覺經(jīng)驗能夠降低視網(wǎng)膜中NO的水平，推測NO參與了弱視眼視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)興奮性的改變，NO水平的降低可能是弱視對視網(wǎng)膜影響機制中的一個重要環(huán)節(jié)。

圖1三組幼貓視網(wǎng)膜NOS免疫組化染色(×200)A：正常組：視網(wǎng)膜NOS免疫陽性神經(jīng)元較多，胞體較大，多分布于神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層，胞體和近端樹突染色較深，呈棕褐色；B：形覺剝奪組：視網(wǎng)膜內(nèi)NOS免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡；C：斜視組：視網(wǎng)膜內(nèi)NOS免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡。

圖2三組幼貓弱視眼視網(wǎng)膜GABA免疫組化染色(×200)A：正常組：視網(wǎng)膜GABA免疫陽性神經(jīng)元較多，細胞染色深呈棕褐色，胞體較大，多位于內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層和神經(jīng)纖維層，高倍鏡下，陽性細胞呈圓形或卵圓形，胞體及軸、樹突內(nèi)有免疫陽性物質(zhì)；B：形覺剝奪組：GABA免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡；C：斜視組：GABA免疫陽性神經(jīng)元減少，胞體染色淡。

3.2GABA在弱視眼視網(wǎng)膜中的表達及作用GABA是谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下轉(zhuǎn)化而成的，是一種重要的抑制性遞質(zhì)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，對視覺發(fā)育起著重要作用。GABA抑制能力的減弱將直接影響貓視皮層神經(jīng)元對視覺刺激的反應及對刺激反應的方向選擇性[10]。Leventhal等[11]證實GABA、GABAA受體的激動劑可提高老年猴的視覺功能，而GABAA受體拮抗劑對年輕成年猴的視覺功能的抑制作用較強。提示視皮層中GABA抑制系統(tǒng)減弱很可能是導致老年猴視覺功能衰退的重要原因。此外，GABA受體可能還參與了雙眼優(yōu)勢柱的轉(zhuǎn)移[12]。除了抑制作用，GABA在發(fā)育早期神經(jīng)元也可引起類似的去極化電位和興奮性活動，其興奮性作用主要是由谷氨酸介導的，通過升高胞內(nèi)Ca2+濃度，從而對發(fā)育細胞產(chǎn)生興奮性作用，此時GABA發(fā)揮了重要的神經(jīng)營養(yǎng)性作用[13]。

GABA在視網(wǎng)膜主要分布于內(nèi)核層內(nèi)邊緣的無長突細胞、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維層，其含量的變化可以反映視網(wǎng)膜的功能狀態(tài)。本研究表明，剝奪正常視覺刺激12wk后，各組病因弱視眼視網(wǎng)膜GABA免疫陽性細胞染色淡，陽性面積減少，與正常眼相比，差異有統(tǒng)計學意義。提示GABA可能參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)元早期發(fā)育過程。有研究發(fā)現(xiàn)感光細胞-雙極細胞-節(jié)細胞鏈使用興奮性遞質(zhì)谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)，而形成側(cè)向鏈的水平細胞、無長突細胞等中間神經(jīng)元使用甘氨酸或GABA作為神經(jīng)遞質(zhì)[14]。猜測在幼貓視覺發(fā)育敏感期，異常的視覺經(jīng)驗使視網(wǎng)膜相應興奮性神經(jīng)元長期失去正常的視覺沖動，功能廢用導致發(fā)育不良、胞體皺縮及數(shù)量減少，除向視中樞傳導障礙外，與GABA能神經(jīng)元形成的側(cè)突沖動也減少，使它所支配的GABA能神經(jīng)元發(fā)育障礙，如此形成退變循環(huán)，從而加速了弱視過程的發(fā)生。此外，GABA可能還介導視網(wǎng)膜神經(jīng)突觸的可塑性，長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)是興奮性谷氨酸能突觸可塑性的兩種重要形式。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，在新生海馬LTD和LTP的產(chǎn)生是由GABAA受體所介導的，而Ca2+濃度的增加是GABA能突觸可塑性的始動原因。我們認為，GABA水平對關(guān)鍵期內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的發(fā)育以及神經(jīng)突觸可塑性的改變起著重要作用。目前有關(guān)GABA在視網(wǎng)膜層面的研究較少，其在弱視形成過程中的具體神經(jīng)機制還有待于進一步探討。

弱視的發(fā)病是從視網(wǎng)膜到視皮質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常改變的復雜過程，視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期內(nèi)異常的視覺經(jīng)驗可能導致神經(jīng)元突觸分子水平的變化，NO及GABA的異常變化可能是其中的重要環(huán)節(jié)，這將為弱視發(fā)病機制的分子生物學研究提供重要基礎(chǔ)。

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Expression of nitric oxide and γ-aminobutyric acid in the retina of two kinds of amblyopia cats

Han-Min Wang1, Ao Rong2, Li-Juan Mo1, Qing-Song Li1, Xing-Ru Zhang1

Han-Min Wang. Department of Ophthalmology, Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China. langrisser_wang@163.com

2016-06-30Accepted：2016-09-29

?AIM: To study the role of nitric oxide (NO) and γ-aminobutyric acid (GABA) in the formation of amblyopia by establishing 2 different types of amblyopic models.

amblyopia; pattern visual evoked potentials; nitric oxide; γ-aminobutyric acid

1(200062)中國上海市，上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院眼科；2(200065)中國上海市，上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院眼科

王晗敏，畢業(yè)于同濟大學醫(yī)學院，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：眼表疾病。

王晗敏.langrisser_wang@163.com

2016-06-30

2016-09-29

Wang HM, Rong A, Mo LJ,etal. Expression of nitric oxide and γ-aminobutyric acid in the retina of two kinds of amblyopia cats.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(11):2006-2009

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.11.06