人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)滑膜中TLR4及TLR5的表達(dá)分析

閆威

人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)滑膜中TLR4及TLR5的表達(dá)分析

閆威

目的 觀察人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)時(shí)，滑膜中Toll樣受體4（TLR4）、Toll樣受體5（TLR5）表達(dá)變化及其臨床意義。方法 21例人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)（觀察組）及同期30例股骨頸骨折患者（對(duì)照組）入選本研究，采取免疫組織化學(xué)法測(cè)定滑膜TLR4及TLR5表達(dá)水平，分析TLR4及TLR5表達(dá)水平與無(wú)菌性松動(dòng)之間的相關(guān)性。結(jié)果 兩組髖關(guān)節(jié)滑膜中均有TLR4和TLR5表達(dá)，而觀察組的表達(dá)陽(yáng)性率及表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。兩組TLR4表達(dá)水平均高于TLR5（P＜0.05）。結(jié)論 人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)時(shí)，滑膜中TLR4和TLR5表達(dá)水平均顯著升高，其水平變化與無(wú)菌性松動(dòng)發(fā)生具有密切關(guān)聯(lián)。

人工髖關(guān)節(jié)；無(wú)菌性松動(dòng)；滑膜；Toll受體；

人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)臨床較為常見(jiàn)，該手術(shù)能夠緩解、消除患者疼痛及重建關(guān)節(jié)功能，并對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有重要意義［1］。調(diào)查研究表明［2］，目前世界范圍內(nèi)每年約50余萬(wàn)患者接受人工關(guān)節(jié)置換或翻修手術(shù)治療。有文獻(xiàn)報(bào)道［3］，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)雖經(jīng)快速發(fā)展，取得較佳效果，但其遠(yuǎn)期并發(fā)癥逐漸受到臨床重視。人工髖關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)為影響髖關(guān)節(jié)置換術(shù)遠(yuǎn)期療效的重要負(fù)面因素之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。有研究報(bào)道［4］，Toll樣受體（TLR）對(duì)啟動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及誘導(dǎo)獲得性免疫過(guò)程具有重要作用，本研究旨在探討TLR4及TLR5水平變化與無(wú)菌性假體松動(dòng)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選擇本院于2011年1月～2015年1月收治的因人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)需行翻修手術(shù)治療患者21例（觀察組）及同期股骨頸骨折患者30例（對(duì)照組）入選本研究，均經(jīng)患者及家屬知情同意，且得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。觀察組中，男13例，女8例，年齡49～78（56.8±9.5）歲；左側(cè)11例，右側(cè)10例。對(duì)照組中，男18例，女12例，年齡45～75（54.3±10.2）歲；左側(cè)16例，右側(cè)14例。兩組年齡、性別構(gòu)成等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡≥18歲，且＜80歲；均符合人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；術(shù)中所切除標(biāo)本HE染色后經(jīng)病理診斷為類似于纖維瘢痕樣的滑膜組織；人工髖關(guān)節(jié)假體周圍組織經(jīng)切片后，中性白細(xì)胞數(shù)目＞5個(gè)/高倍視野。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病、嚴(yán)重肝腎功能不全或者其他重大疾病不能耐受手術(shù)者；合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者、自身免疫性疾病及腫瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 觀察組取翻修術(shù)中切除的假體周圍滑膜組織為檢測(cè)標(biāo)本，對(duì)照組取人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中切除的髖關(guān)節(jié)滑膜組織為檢測(cè)標(biāo)本，新鮮標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，然后脫水、透明、石蠟包埋固定，連續(xù)切片、編號(hào)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 將標(biāo)本切片于60℃烤箱中過(guò)夜后，置于二甲苯浸泡20min，乙醇梯度脫水，PBS液漂洗3min×3次。放入滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶+30%雙氧水+9份蒸餾水中浸泡10min，蒸餾水漂洗3次。將切片置于抗原修復(fù)緩沖液5～10min，滴加5%BSA封閉液，置于37℃恒溫箱30min。滴加一抗孵育，置于4℃冰箱過(guò)夜。復(fù)溫20 min，使用PBS液清洗20 min×2次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，置于37℃下30 min，使用PBS清洗20 min×2次。滴加SABC孵育，再應(yīng)用PBS清洗30min×3次。使用DAB顯色試劑盒顯色。將標(biāo)本置于蘇木素5min，再?zèng)_洗，置于75%鹽酸酒精溶液30 s。經(jīng)70%、80%、90%、95%乙醇、無(wú)水乙醇，各5 min，置于二甲苯10min。切片風(fēng)干后滴中性樹(shù)脂蓋片，置于鏡下觀察。每種抗體均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照組。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 TLR4及TLR5陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)［6］顯微鏡10×40倍視野下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察，染色顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜，其中，細(xì)胞未著色即陰性（-）；染色陽(yáng)性細(xì)胞占視野炎性細(xì)胞0～25%為弱陽(yáng)性 （+）；陽(yáng)性細(xì)胞占25%～50%為陽(yáng)性（++）；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）［7］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采取成組設(shè)計(jì)兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)比較兩組TLR4及TLR5表達(dá)水平，并應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析TLR4及TLR5表達(dá)之間相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR4表達(dá)情況比較 兩組髖關(guān)節(jié)滑膜均有TLR4表達(dá)，其中對(duì)照組主要見(jiàn)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及滑膜表層細(xì)胞，觀察組主要見(jiàn)于滑膜表層細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，少量成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)表達(dá)；觀察組TLR4表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，表1）。

表1　兩組TLR4表達(dá)情況比較［n（%）］

2.2 兩組TLR5表達(dá)情況比較 對(duì)照組髖關(guān)節(jié)滑膜中，TLR5主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及滑膜表層細(xì)胞，且陽(yáng)性程度較弱；觀察組假體周圍均有TLR5表達(dá)，主要見(jiàn)于巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞；觀察組TLR5表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，表2）。

表2　兩組TLR5表達(dá)情況比較［n（%）］

2.3 兩組TLR4及TLR5表達(dá)比較 觀察組TLR4及TLR5表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。另外，兩組TLR4表達(dá)水平均高于TLR5（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3　兩組TLR4及TLR5表達(dá)水平比較

3 討論

髖關(guān)節(jié)置換為臨床重要手術(shù)之一，隨著臨床研究深入，其遠(yuǎn)期療效及壽命問(wèn)題逐漸受到臨床重視。研究報(bào)道［8］，目前超過(guò)70%需行髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)原因?yàn)榧袤w松動(dòng)造成，假體松動(dòng)已成為制約人工假體壽命的重要制約因素。正因如此，研究假體松動(dòng)發(fā)生機(jī)制、原因具有重要臨床價(jià)值。

目前，假體松動(dòng)發(fā)生機(jī)制并未闡明，有文獻(xiàn)報(bào)道［9］，部分患者發(fā)生假體松動(dòng)常伴有假體周圍骨溶解，此可能為假體松動(dòng)發(fā)生的直接原因之一。研究表明［10］，巨噬細(xì)胞在假體松動(dòng)過(guò)程中參與了骨溶解，此可能為機(jī)制之一。Toll樣受體與其配體結(jié)合，可經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致具有溶骨作用的腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子大量釋放。Toll樣受體首先于果蠅上發(fā)現(xiàn)，可經(jīng)復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞因子合成及分泌，進(jìn)而激活宿主防御機(jī)制，發(fā)揮抗真菌感染作用［11］。相關(guān)研究表明［12］，Toll樣受體表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，其識(shí)別并結(jié)合后可致下游信號(hào)及轉(zhuǎn)錄因子激活，進(jìn)而誘導(dǎo)抗生物分子及化學(xué)趨化因子、細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮作用。本研究測(cè)定假體松動(dòng)患者髖關(guān)節(jié)周圍組織TLR4及TLR5水平，結(jié)果表明均顯著升高（P＜0.05），表明TLR4及TLR5表達(dá)上調(diào)與假體無(wú)菌性松動(dòng)具有密切關(guān)聯(lián)。有研究報(bào)道［13］，TLR4與透明質(zhì)酸信號(hào)及透明質(zhì)酸誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)具有密切關(guān)聯(lián)，此可能與其參與假體松動(dòng)機(jī)制之一。

TLR4主要配體為L(zhǎng)PS，而LPS為致感染性休克的常見(jiàn)激活劑之一。已有研究表明［14］，LPS對(duì)磨損顆粒具有高度親和力，可引起炎癥反應(yīng)。本研究進(jìn)一步分析假體松動(dòng)組TLR4及TLR5表達(dá)水平，結(jié)果TLR4顯著高于TLR5表達(dá)水平，但二者之間并無(wú)明顯相關(guān)性，可能TLR4及TLR5通過(guò)不同通路參與假體無(wú)菌性松動(dòng)。

總之，人工髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)時(shí)，滑膜中TLR4及TLR5表達(dá)水平顯著升高，其水平變化與無(wú)菌性松動(dòng)發(fā)生具有密切關(guān)聯(lián)。

［1］Amstutz HC，Le Duff MJ.Aseptic loosening of cobalt chromium monoblock sockets after hip resurfacing［J］.Hip Int，2015，29（7）：110-113.

［2］Voort PV，Pijls BG，Nieuwenhuijse MJ，et al.Early subsidence of shape-closed hip arthroplasty stems is associated with late revision［J］.Acta Orthop，2015，24（11）：1-11.

［3］Abele JT，Swami VG，Russell G，et al.The accuracy of single photon emission computed tomography/computed tomography arthrography in evaluating aseptic loosening of hip and knee prostheses［J］.JArthroplasty，2015，31（21）：98-103.

［4］Ryu KJ.Corr insights：what host factors affect aseptic loosening after THA and TKA［J］？Clin Orthop Relat Res，2015，14（11）：95-99.

［5］Tomankova T，KriegováE，F(xiàn)illerova R，et al.Low expression of Tlr-1，-2，-4 a il-2，-2r，-10，-10r and TgFb1 in pseudosynovial tissue collected at revision total knee arthroplasty for aseptic loosening［J］.Acta Chir Orthop Traumatol Cech，2015，82（1）：67-75.

［6］Wang FD，Gao YZ，Yuan W，et al.Augmentative locking compression plate （LCP）combined with bone graft for the treatment of aseptic femoral shaft nonunion after intramedullary nailing［J］.Zhong guo Gu Shang，2014，27（10）：815-818.

［7］Ding Y，Qiu Y，Zou L，et al.Three conserved MyD88-recruiting TLR residues exert different effects on the human TLR4 signaling pathway［J］.Immunol Res，2015，7（9）：1185-1189.

［8］Zhu YX，Wang XB，Wang J，et al.Influence of TLR2-and TLR4-activated mesenchymal stem cells on migration of cord blood CD34（+）cells［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2015，23（2）：512-516.

［9］Wang W，Yuan HY，Liu GM，et al.Escherichia coli maltose-binding protein induces M1 polarity of RAW264.7 macrophage cells via a TLR2-and TLR4-dependent manner［J］. Int JMol Sci，2015，16（5）：9896-9909.

［10］Yang H，Li J，Wang Y，et al.Role of CD14 and TLR4 in type I，type Ⅲ collagen expression，synthesis and secretion in LPS-induced normal human skin fibroblasts［J］.Int JClin Exp Med，2015，8（2）：2429-2434.

［11］Wang C，Sun H，Song Y.Pterostilbene attenuates inflammation in rat heart subjected to ischemia-reperfusion：role of TLR4/NF-κB signaling pathway［J］.Int JClin Exp Med，2015，8（2）：1737-1746.

［12］Rashidi N， Mirahmadian M， Jeddi-Tehrani M，et al. Lipopolysaccharide- and lipoteichoic acid-mediated proinflammatory cytokine production and modulation of TLR2，TLR4 and MyD88 expression in human endometrial cells［J］.JReprod Infertil，2015，16（2）：72-81.

［13］Tahoun A，Jensen K，Corripio-Miyar Y，et al.Functional analysis of bovine TLR5 and association with IgA responses of cattle following systemic immunisation with H7 flagella［J］.Vet Res，2015，46（1）：9-12.

［14］Meena NK，Ahuja V，Meena K，et al.Association of TLR5 gene polymorphisms in ulcerative colitis patients of north India and their role in cytokine homeostasis［J］.PLoSOne，2015，10（3）：15-21.

Analysis of expression of TLR4 and TLR5 in aseptic loosened synovium of artificial hip prosthesis

Yan Wei
Departmentof Orthopaedics，Nanzhang People′s Hospital，Nanzhang，Hubei，441500，China

Objective To observe the changes in the expression of TLR4 and TLR5 in aseptic loosened synovium of artificial hip prosthesis and the clinical significance of the changes.Methods 21 patientswith aseptic loosening of artificial hip prosthesis（the observation group）and 30 patients with femoral neck fracture in the corresponding period （the control group）were enrolled in this study.The expression levels of TLR4 and TLR5 in the two groups were determined by immunohistochemicalmethod to analyze the correlation between the expression levels and aseptic loosening.Results There was expression of TLR4 and TLR5 in hip joint synovium.The positive expression rate and expression levels in the observation group were much higher than those in the control group（P＜0.05）.The expression levels of TLR4 in the two groups were higher than those of TLR5（P＜0.05）.Conclusion The expression levels of TLR4 and TLR5 in aseptic loosening of artificial hip prosthesis aremuch higher，and changes in the levels are closely related to the aseptic loosening.

artificial hip prosthesis；aseptic loosening；synovium；toll-like receptor

R 687.4

A

1004-0188（2016）10-1102-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.10.004

2016-04-07）

441500湖北 南漳，南漳縣人民醫(yī)院骨科