高效液相色譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中的人工合成色素

周峰

（海南熱帶海洋學(xué)院體育與健康學(xué)院，海南三亞572000）

高效液相色譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中的人工合成色素

周峰

（海南熱帶海洋學(xué)院體育與健康學(xué)院，海南三亞572000）

建立一種同時(shí)測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)等6種人工合成色素的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）方法。樣品前處理采用固相萃取小柱進(jìn)行富集和凈化，淋洗液選擇甲酸-水溶液，洗脫液選擇氨化甲醇，氮?dú)獯蹈珊笥盟畯?fù)溶上機(jī)檢測(cè)。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以甲醇-乙酸銨水溶液（20.0 mmol/L）作為流動(dòng)相，用PDA檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，6種人工合成色素在2.00 μg/mL～32.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.99，檢出限在0.04 μg/mL～0.15 μg/mL，定量限為0.12 μg/mL～0.50 μg/mL，加標(biāo)回收率達(dá)到85.6%～92.4%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、凈化效果好、靈敏度高和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，適用于運(yùn)動(dòng)飲料中人工合成色素的分離和定量檢測(cè)。

高效液相色譜；運(yùn)動(dòng)飲料；人工合成色素

人工合成色素屬于化工染色劑，大多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過(guò)磺化、硝化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成。由于人工合成色素，生產(chǎn)成本低，給人的感觀度好，易溶于水，可直接進(jìn)行添加等特點(diǎn)，一定程度上彌補(bǔ)了天然色素的一些不足，因此在食品生產(chǎn)加工中被大量應(yīng)用。但是，大量合成色素的攝入可能引起過(guò)敏、哮喘、喉頭水腫、鼻炎、蕁麻疫、皮膚瘙癢以及神經(jīng)性頭痛等癥狀，特別是兒童的成長(zhǎng)期間，若長(zhǎng)期過(guò)量攝入合成色素，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)造成極為不利的影響［1-4］。因此，世界各國(guó)對(duì)合成色素的使用種類，使用范圍和使用量都做了嚴(yán)格限制。在我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中，針對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料GB15266-2009《運(yùn)動(dòng)飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了允許使用的色素品種、使用范圍及最大使用量［5］。

運(yùn)動(dòng)飲料是根據(jù)人體運(yùn)動(dòng)的生理消耗而配置的，針對(duì)特殊人群的飲料。運(yùn)動(dòng)飲料中主要含有電解質(zhì)，維生素，氨基酸等成分，能補(bǔ)充人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，抗疲勞，平衡新陳代謝［6］。但是近些年來(lái)運(yùn)動(dòng)飲料市場(chǎng)魚(yú)龍混雜，不法商家為了追求飲料的色澤亮麗，超量或者違規(guī)添加人工合成色素。由于現(xiàn)行國(guó)標(biāo)中人工合成色素的檢驗(yàn)方法GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》［7］中的處理方法操作繁瑣，加標(biāo)回收率低等因素，本實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中前處理方法進(jìn)行了一些相應(yīng)改變，并進(jìn)行了加標(biāo)回收驗(yàn)證。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 2695，配PDA檢測(cè)器：Waters 2998。

檸檬黃（99%）、莧菜紅（98%）、胭脂紅（92%）、日落黃（97%）、誘惑紅（99%）、亮藍(lán)（92%）標(biāo)準(zhǔn)品：均購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

HLB固相萃取小柱：Waters公司，規(guī)格3cc。

1.2樣品來(lái)源

樣品均為隨機(jī)抽取市場(chǎng)上銷售的運(yùn)動(dòng)型飲料。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙酸銨（20 mmol/L）水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序?yàn)? min～5.0 min，20% B～35%B；3.0 min～5.0 min，35%B；5.0 min～10.0 min，35%B～98%B；10.0 min～15.0 min，98%B；15.0 min～16.0 min，90%B～15%B。

1.4方法

1.4.1甲醇-乙酸銨水溶液體系中乙酸銨對(duì)6種人工合成色素色譜行為的影響

固定流動(dòng)相梯度洗脫程序，配制不同濃度的乙酸銨水溶液5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mmol/L，考察乙酸銨對(duì)6種合成人工合成色素色譜行為的影響。

1.4.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（掃描范圍200 nm～600 nm），根據(jù)6種人工合成色素的全波長(zhǎng)掃描圖，選擇比較合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)飲料中除了固有的一些食品基質(zhì)外，還含有很多的人為添加的營(yíng)養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對(duì)前處理要求高，所以本實(shí)驗(yàn)樣品前處理使用HLB固相萃取小柱，對(duì)人工合成色素起到一個(gè)凈化和富集的作用。并對(duì)HLB固相萃取小柱操作條件進(jìn)行優(yōu)化，以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.4.5加標(biāo)回收試驗(yàn)

以市售未檢出人工合成色素的運(yùn)動(dòng)飲料為空白基質(zhì)，加入混合標(biāo)準(zhǔn)液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，氮吹近干后再用水定容，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2　結(jié)果與討論

2.1甲醇-乙酸銨水溶液體系中乙酸銨對(duì)6種人工合成色素色譜行為的影響

為了了解乙酸銨對(duì)6種人工合成色素色譜行為的影響，本研究固定流動(dòng)相梯度洗脫程序，配制不同濃度的乙酸銨水溶液，乙酸銨濃度分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mmol/L，考察了乙酸銨對(duì)六種合成人工合成色素色譜行為的影響。如圖1所示。

結(jié)果表明：在甲醇-乙酸銨水溶液體系中，乙酸銨濃度對(duì)6種合成人工合成色素的色譜保留行為有不同程度的影響，其濃度與6種合成人工合成色素保留因子的相互關(guān)系符合lnk=a+cCB方程［8-10］，且具有良好的線性（r2＞0.99）。當(dāng)乙酸銨濃度在20.0 mmol/L時(shí)，6種合成人工合成色素在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

圖1　6種合成人工合成色素的色譜圖Fig.1The chromatogram of six synthetic colorants

這6種人工合成色素均為水溶性酸性染料，在國(guó)標(biāo)方法中選用254 nm作為這6種人工合成色素的檢測(cè)波長(zhǎng)。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)型飲料經(jīng)前處理后樣品的譜圖在254 nm波長(zhǎng)處的干擾峰比較多，難以滿足實(shí)際檢測(cè)需要。所以本試驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（掃描范圍210 nm～700 nm），如圖2所示。

圖2　6種合成人工合成色素的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.2Full wavelength scanning chart of six synthetic colorants

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以上6種人工合成色素除了在紫外區(qū)有著較強(qiáng)特征吸收外，由于各種色素的結(jié)構(gòu)中含有不同的發(fā)色及助色基團(tuán)，在可見(jiàn)光區(qū)也有最大吸收波長(zhǎng)。6種色素最大吸收波長(zhǎng)分別為檸檬黃：257.2、427.1 nm；莧菜紅215.9、520.7 nm；胭脂紅214.7、 509.7 nm；日落黃234.7、484.2 nm；誘惑紅212.3、509.7 nm；亮藍(lán)307.2、407.8 nm。綜合考慮，選擇在500 nm的條件下同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)6種人工合成色素，此時(shí)各組分的響應(yīng)值高，背景干擾小，符合試驗(yàn)的要求。如圖3。

圖3　運(yùn)動(dòng)飲料中莧菜紅、胭脂紅分別在254 nm波長(zhǎng)、500 nm波長(zhǎng)下的色譜圖Fig.3The chromatograms of amaranth，carmine in sports drink at 254 nm wavelength and 500 nm wavelength

是一款運(yùn)動(dòng)型飲料中兩種人工合成色素分別在254 nm和500 nm的檢測(cè)條件下的色譜圖對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)在500 nm的檢測(cè)條件下，樣品的色譜圖中雜峰干擾明顯小于254 nm檢測(cè)條件下的譜圖。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證6種合成人工合成色素在甲醇-乙酸銨（20 mmol/L）水溶液流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，6種合成人工合成色素在2.00μg/mL～32.00 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到6種目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.04 μg/mL～0.15 μg/mL和0.12 μg/mL～0.50 μg/mL。

表1　6種合成人工合成色素的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of six synthetic colorants

2.4淋洗液、洗脫液的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］后，針對(duì)于運(yùn)動(dòng)飲料的固相萃取流程，樣品選擇過(guò)濾后上樣，然后淋洗，最后洗脫。淋洗液是在樣品進(jìn)入吸附劑、目標(biāo)化合物被吸附后，用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉，一般有用酸化甲醇-水溶液、甲酸-水溶液、檸檬酸-水溶液、水這四種淋洗方式，分別對(duì)這4種的淋洗效果進(jìn)行比較；洗脫液一般是用較強(qiáng)的溶劑將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)，常用的有氨化甲醇、甲醇、酸化甲醇3種洗脫溶劑。

試驗(yàn)結(jié)果以6種人工合成色素的平均回收率為比較依據(jù)，如圖4所示：甲酸-水溶液作為淋洗液效果最好；氨化甲醇的洗脫效果要優(yōu)于甲醇和酸化甲醇。

圖4　淋洗液、洗脫液的選擇對(duì)6種人工合成色素平均回收率的影響Fig.4The effect of leaching solution and elution solution on the average recovery rate of six synthetic colorants

2.5樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收

在我們隨機(jī)抽取的30個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料樣品中，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后儀器條件，上樣后選擇甲酸-水溶液淋洗HLB小柱，氨化甲醇洗脫后氮吹，最后用水復(fù)容上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明：在所檢測(cè)的運(yùn)動(dòng)飲料樣品中，6種合成人工合成色素檢出7批次，但均未超過(guò)國(guó)家限量值。加標(biāo)回收試驗(yàn)中，在加標(biāo)濃度為16.00 μg/mL的飲料樣品中，6種色素的加標(biāo)回收率在85.6%～92.4%之間，符合檢測(cè)要求。

3　結(jié)論

建立了一種固相萃取-反相高效液相色譜法梯度洗脫同時(shí)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中6種人工合成色素的分析方法。結(jié)果表明，在甲醇-乙酸銨體系中，乙酸銨對(duì)于溶質(zhì)的色譜保留行為具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力；在甲醇與乙酸銨的協(xié)同作用下，甲醇-乙酸銨（20 mmol/L）水溶液流動(dòng)相體系中，6種人工人工合成色素得到了良好的基線分離。在500 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，優(yōu)化后的HLB固相萃取柱法可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)6種人工人工合成色素的凈化與富集，準(zhǔn)確有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中的人工合成色素。

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Analysis of Synthetic Colorants in Sports Drink by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Feng
（School of Physical Education and Health，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572000，Hainan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of six synthetic colorants，including tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，allura red，and brilliant blue in sports drink by solid－phase extraction coupled with reversed-phase high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were concentrated and purified by solid phase extraction column，and the leaching solution of formic acid aqueous solution，the eluent of amonium methanol The elution liquid was dried under nitrogen，and detected after re-dissolution with water.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using ammonium acetate aqueous solution（20.0 mmol/L）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of 6 synthetic colorants was inthe range of 2.00 μg/mL-32.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.99.The detection limit was 0.04 μg/mL-0.15 μg/mL and the quantitative limit was 0.12 μg/mL-0.50 μg/mL.The recovery rate was 85.6%-92.4%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，andis suitable for the separationandquantitative detectionofsynthetic colorants insports drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；synthetic colorants

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.037

周峰（1970—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

2016-07-04