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    L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用研究

    2016-10-27 05:23:59劉遵瑩劉秋玲鄧燕莉陳凌肖文軍
    茶葉科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:腸毒素氨酸黏膜

    劉遵瑩,劉秋玲,鄧燕莉,陳凌,肖文軍,3*

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    L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用研究

    劉遵瑩1,2,劉秋玲1,2,鄧燕莉1,2,陳凌1,2,肖文軍1,2,3*

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410128;2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410128;3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長(zhǎng)沙 410128

    以SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)其適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d后連續(xù)30?d灌喂不同劑量L-茶氨酸,然后腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813誘導(dǎo)免疫應(yīng)激,5?h后取樣,分析研究了L-茶氨酸對(duì)小鼠體重,回腸組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(Homogenate catalase, CAT)與誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)活性,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量、空腸組織病理學(xué)變化,以及血清腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)表達(dá)量的影響,以探明L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用。結(jié)果表明,各劑量L-茶氨酸均能顯著增加小鼠體重,可減輕產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813引起的腸道組織病變程度,升高回腸組織GSH-Px和CAT酶活性,降低MDA含量和iNOS酶活性,在不同程度上抑制血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表達(dá)量。說(shuō)明L-茶氨酸可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平、降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度和提高抗氧化能力來(lái)維護(hù)腸道組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性,并達(dá)到保護(hù)腸道的作用。

    L-茶氨酸;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌;免疫應(yīng)激;保護(hù)腸道

    腸道不僅是消化吸收和交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所,也是保護(hù)機(jī)體免受各種病菌和毒素侵染的重要免疫器官[1-2]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(,ETEC)是一類(lèi)常見(jiàn)的致人和幼畜腹瀉的人畜共患型病原體,可通過(guò)黏附素結(jié)合到小腸黏膜上皮細(xì)胞,然后在腸道內(nèi)大量增殖,產(chǎn)生一種或多種腸毒素,進(jìn)而引起小腸分泌大量液體從而導(dǎo)致腹瀉[3-4]。長(zhǎng)期或大量使用復(fù)合抗生素不僅使ETEC產(chǎn)生耐藥性和變異,而且造成抗生素低效和在體內(nèi)累積,導(dǎo)致胃腸道菌群紊亂,引發(fā)多種疾病[5]。因此,尋找天然、安全、有效的植物功能成分來(lái)替代抗生素是未來(lái)防治大腸桿菌感染、保護(hù)腸道健康的重要發(fā)展方向[6-8]。

    L-茶氨酸(L-Theanine)是茶葉中的特征性氨基酸[9],經(jīng)口攝入后在小腸黏膜刷狀緣經(jīng)鈉離子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入血而被運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)組織器官中[10]。L-茶氨酸具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),能夠促進(jìn)生長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)、提高抗氧化能力和免疫力等生物活性[11-19],但尚未見(jiàn)L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道保護(hù)作用的研究報(bào)道。本研究以SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用L-茶氨酸預(yù)防干預(yù),再腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813,研究L-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用,為L(zhǎng)-茶氨酸的深層開(kāi)發(fā)利用及臨床大腸桿菌感染病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    L-茶氨酸(≥98%)購(gòu)于德國(guó)sigma試劑公司;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株O78:K80(44813)即E44813由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;地塞米松片(批號(hào):140911,天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司);HyClone磷酸鹽緩沖液(批號(hào):211362,北京博艾爾科技有限公司);氯化鈉注射液(批號(hào):1410032704,石家莊鵬海制藥有限公司);乙醇、乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、小鼠細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、過(guò)氧化氫酶(CAT)可見(jiàn)光試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

    1.2 儀器設(shè)備

    多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);96孔酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司);冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Starorius精密電子天平(瑞士Starorius公司);系列量程移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf公司);恒溫?fù)u床(江蘇蘇昆公司);DSY-2-8 水浴鍋(北京國(guó)華醫(yī)療器械廠);NanoDrop 2000/2000c分光光度儀(Thermo Scientific,德國(guó))。

    1.3 方法

    1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    Balb/c小鼠,SPF級(jí),雌性,6~8周齡,19~21?g,60只,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)單位許可證編號(hào):SCXK(湘)2011-0003,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):43004700009227,接受日期:20141009。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所,溫度(22±2)℃,濕度40%~60%,光照:12?h明、12?h暗,通風(fēng):≥15次·h-1全新風(fēng)。小鼠購(gòu)回后于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d,期間自由飲水進(jìn)食。

    小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,按平均體重分為6組,每組10只,分別為正常對(duì)照組(Control組)、免疫模型組(ETEC組)、L-茶氨酸低劑量組(L.L組)、L-茶氨酸中劑量組(L.M組)、L-茶氨酸高劑量組(L.H組)、地塞米松對(duì)照組(DEX組)。所有劑量處理組按體重給藥,L.H組、L.M組和L.L組分別給予L-茶氨酸500、300、100?mg·kg-1·d-1;DEX組給予地塞米松5?mg·kg-1·d-1,Control組與ETEC組給予相同劑量生理鹽水,按上述試驗(yàn)方法連續(xù)灌喂30?d。第31天采用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813造模,造模前禁食6?h,用1?mL無(wú)菌注射器腹腔注射E44813,劑量為0.02? mL·g-1,Control組腹腔注射生理鹽水0.02? mL·g-1。

    1.3.2 取樣及樣品分析

    按小鼠分組和體重給藥,連續(xù)灌喂30?d,分別在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天記錄小鼠體重。E44813造模5?h后取樣。小鼠摘眼球采血,常溫靜置2?h,3?500?r·min-1離心10?min取上清,用ELISA試劑盒檢測(cè)各處理組小鼠血清中TNF-α、ICAM-1和IL-1β的表達(dá)量。脫頸椎處死取腸道組織,取空腸末端2?cm放入10%中性甲醛中固定用于HE染色,觀察小鼠空腸組織的病變情況。取回腸組織約100?g研磨后置于生理鹽水中制備10%的回腸組織勻漿,用于檢測(cè)各處理組小鼠回腸GSH-Px、CAT、MDA和iNOS活性。

    1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

    2 結(jié)果與分析

    2.1 L-茶氨酸對(duì)小鼠體重變化的影響

    不同劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中體重變化的影響如表1所示。連續(xù)灌喂過(guò)程中正常對(duì)照組、免疫模型組、L-茶氨酸各劑量組小鼠體質(zhì)量均增加,且L-茶氨酸各劑量組與正常對(duì)照組之間均有顯著性差異(<0.05),其中L-茶氨酸中劑量組小鼠體質(zhì)量的增加量顯著高于L-茶氨酸低劑量組和L-茶氨酸高劑量組。地塞米松對(duì)照組與正常對(duì)照組相比,小鼠體重下降,這可能是由于地塞米松作為一種治療型的抗炎藥物,對(duì)正常小鼠腸道吸收與消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有影響所致。

    表1 不同劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中體重變化的影響(n=10)

    注:*:與control組比較,<0.05;#:與L.M組比較,<0.05。

    Note: *: Compared with control,<0.05. #: compared with L.M,<0.05.

    2.2 L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

    由圖1可知,與正常對(duì)照組相比,免疫模型組小鼠血清中TNF-α含量顯著增加(<0.05),不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中TNF-α含量較免疫模型組顯著降低(<0.05);與正常對(duì)照組相比,免疫模型組小鼠血清中IL-1β含量顯著增加(<0.05),不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中IL-1β含量較免疫模型組均降低,其中中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異(<0.05)。

    注:1:正常對(duì)照組;2:免疫模型組;3:L-茶氨酸低劑量組;4:L-茶氨酸中劑量組;5:L-茶氨酸高劑量組6:地塞米松對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較,*:P<0.05;與免疫模型組比較,#:P<0.05,下同。

    L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量的影響見(jiàn)圖2。從圖中可以看出,與正常對(duì)照組相比,各處理組小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量顯著增加(<0.05),不同劑量L-茶氨酸組小鼠血清中ICAM-1表達(dá)量較免疫模型組均降低,其中低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間差異顯著(<0.05);高劑量L-茶氨酸組ICAM-1表達(dá)量高于低、中劑量L-茶氨酸組的表達(dá)量,這可能是因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸劑量過(guò)高,對(duì)機(jī)體造成輕微的損傷,促進(jìn)了血清中ICAM-1的表達(dá)水平。因此,一定劑量范圍內(nèi)的L-茶氨酸對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)具有抑制作用。

    2.3 L-茶氨酸對(duì)免疫應(yīng)激小鼠腸道組織病理的影響

    各處理小鼠空腸組織切片見(jiàn)圖3。從圖中可以看出,正常對(duì)照組小鼠空腸組織腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,層次分明,腸黏膜上皮細(xì)胞的輪廓清晰,排列規(guī)則。免疫模型組小鼠空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)病理改變明顯,黏膜上皮受損,部分上皮細(xì)胞脫落,固有層裸露,黏膜層、黏膜下層及肌層大量淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血較為嚴(yán)重,并且大范圍水腫。地塞米松對(duì)照組和L-茶氨酸各劑量處理組空腸組織病變程度較輕,其中,L-茶氨酸中劑量組病變程度最輕,高劑量組次之,黏膜層、黏膜下層及肌層輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血,僅局部水腫,說(shuō)明L-茶氨酸能夠減輕ETEC引起的空腸組織病變。

    注:1:正常對(duì)照組;2:免疫模型組;3:L-茶氨酸低劑量組;4:L-茶氨酸中劑量組;5:L-茶氨酸高劑量組6:地塞米松對(duì)照組。

    2.4 L-茶氨酸對(duì)小鼠回腸組織酶活性的影響

    各處理組小鼠回腸組織GSH-Px和CAT酶活性如圖4所示。與正常對(duì)照組相比,免疫模型組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性均降低;不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中GSH-Px和CAT活性較免疫模型組均增加,其中,中、高劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間均具有顯著性差異(<0.05),低劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間無(wú)顯著性差異。因此,L-茶氨酸具有提高小鼠回腸組織GSH-Px和CAT活性的作用。

    各處理組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性如圖5所示。與正常對(duì)照組相比,免疫模型組小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均升高,不同劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織中MDA含量較免疫模型組均下降,其中低、中劑量組與免疫模型組之間有顯著性差異(<0.05);低、中劑量L-茶氨酸組小鼠回腸組織iNOS活性低于免疫模型組,高劑量L-茶氨酸組的高于免疫模型組,且低、中劑量L-茶氨酸組與免疫模型組之間有顯著性差異(<0.05)。與免疫模型組比較,高劑量L-茶氨酸對(duì)小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性均無(wú)顯著影響,這可能是因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸劑量過(guò)高,對(duì)機(jī)體造成輕微的損傷,削弱了其抑制腸道MDA含量和iNOS活性的作用??梢?jiàn),在一定的劑量范圍內(nèi),L-茶氨酸具有降低小鼠回腸組織MDA含量和iNOS活性的作用。

    3 討論

    ETEC感染腸道后與腸道上皮細(xì)胞受體結(jié)合,隨后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)宿主細(xì)胞的蛋白磷酸化等作用,使ETEC定殖并大量生長(zhǎng)繁殖,大量毒素持續(xù)不斷地釋放到腸腔內(nèi),超出腸道自身免疫調(diào)節(jié)能力范圍,引起Cl-、Na+、HCO3-和水在小腸內(nèi)的分泌量大量增加,從而導(dǎo)致腹瀉,并且細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β和ICAM-1等。若大量細(xì)胞因子持續(xù)釋放則會(huì)導(dǎo)致炎癥擴(kuò)大和加重,腸腔內(nèi)液體的過(guò)量分泌導(dǎo)致脫水及代謝性酸中毒等,使腸道黏膜組織損傷、脫落,進(jìn)而糜爛,嚴(yán)重影響腸道吸收功能和免疫功能[20-21]。

    從研究結(jié)果中不難看出,以L-茶氨酸干預(yù)小鼠,能顯著增加小鼠體重,并以中劑量最佳;對(duì)小鼠腹腔注射產(chǎn)腸毒素大腸桿菌E44813后,小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)受損、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血等病變情況嚴(yán)重,其血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1表達(dá)量以及回腸組織勻漿MDA含量和iNOS活性顯著升高,而GSH-Px和CAT活性顯著降低,說(shuō)明ETEC感染造成小鼠腸道抗氧化能力下降、炎癥反應(yīng)劇烈,嚴(yán)重?fù)p傷腸道。各劑量L-茶氨酸均能減輕E44813引起的空腸組織病變,且能降低TNF-α、IL-1β、ICAM-1表達(dá)量以及MDA含量和iNOS活性,升高GSH-Px和CAT活性,并也以300?mg·kg-1劑量最佳,說(shuō)明L-茶氨酸可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平、降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度和提高抗氧化能力等途徑,保護(hù)由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染所致免疫應(yīng)激小鼠腸道組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性,并達(dá)到保護(hù)腸道的作用。

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    Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Intestinal in Mice with Immune Stress Induced by ETEC

    LIU Zunying1,2, LIU Qiuling1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Ling1,2, XIAO Wenjun1,2,3*

    1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

    SPF grade Balb/c female mice were used as experimental animals. After adaptive feeding for 3 days, mice were orally pre-treated with different dosages of L-theanine once daily for 30 days before ETEC E44813 intraperitoneal injection. The body weight change in mice was analyzed during the breeding process. Mice were scarified 5 hours after ETEC injection and tissues were collected for analysis. The activities of ileum Glutathione peroxidase (GSH-Px), homogenate Catalase (CAT), Malondialdehyde (MDA) and Inducible nitric oxide synthase (iNOS) were measured and the pathological changes of intestinal and the levels of serum Tumornecrosisfactor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) and Intercellular cell adhesion moleculeICAM-1) were examined. This study was aimed to explore the protective effects of L-theanine on intestinal of ETEC-induced immune stress model in mice. The results showed that: pretreatment with L-theanine at different dosages significantly increased mouse body weight; lowered the levels of ileum homogenate MDA and iNOS, improved the activities ofileum homogenate CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and improved pathological structure of jejunum tissue. These data demonstrated that pre-treatment with L-theanine prevented ETEC-induced intestinal injury through inhibiting TNF-α、IL-1β and ICAM-1, and inflammatory reaction and enhancing intestinal antioxidant abilities.

    L-theanine,, immune stress, intestinal protection

    Q51;Q939.1

    A

    1000-369X(2016)05-469-08

    2016-03-24

    2016-06-18

    國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD10B00)

    劉遵瑩,女,碩士研究生,主要從事茶葉功能成分利用研究。

    xiaowenjun88@sina.com

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