貼梗海棠花粉生活力的測(cè)定

朱金儒，孫曉光，張曉曼

（1.保定市交通運(yùn)輸局，河北保定　071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定　071000）

貼梗海棠花粉生活力的測(cè)定

朱金儒1，孫曉光1，張曉曼2

（1.保定市交通運(yùn)輸局，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）

以貼梗海棠初開(kāi)花朵為試驗(yàn)材料，研究了TTC、碘原碘化鉀2種染色劑測(cè)定花粉生活力的效果，離體培養(yǎng)時(shí)葡萄糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響和3種不同溫度（15、20、25益）條件下的花粉萌發(fā)的變化規(guī)律，3種貯藏條件（常溫、4益、-23益）對(duì)花粉貯藏的影響。結(jié)果表明：不同染色劑測(cè)定的花粉生活力差異顯著，TTC染色法（76.26%）顯著優(yōu)于碘原碘化鉀染色法（42.46%）。在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)基葡萄糖濃度和萌發(fā)溫度提高能促進(jìn)花粉的萌發(fā)，超出范圍后抑制萌發(fā)。試驗(yàn)證明：最佳的葡萄糖濃度為10%，最佳的萌發(fā)溫度為20益。貯藏溫度對(duì)花粉生活力的影響顯著，其中最佳的貯藏條件是冷凍干燥，但綜合考慮成本、便捷性等因素，實(shí)際應(yīng)用中一般選擇4益。

貼梗海棠；花粉萌發(fā)；生活力測(cè)定；貯藏條件

貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）又名貼角海棠、貼梗木瓜、皺皮木瓜，薔薇科木瓜屬，落葉灌木，高達(dá)20m[1]。貼梗海棠早春葉前開(kāi)花，鮮艷美麗，簇生枝間，且有重瓣及半重瓣品種，秋天又有黃色、芳香的碩果，是一種很好的觀花、觀果灌木。宜于庭院、草坪、花壇內(nèi)孤植或叢植，又可以作為綠籬及基礎(chǔ)種植材料，同時(shí)也具有極高的藥用價(jià)值。以往對(duì)貼梗海棠的研究多數(shù)集中在組織培養(yǎng)、中藥化學(xué)成分、植株繁殖栽培、品種分類(lèi)等方面，對(duì)于花粉相關(guān)研究有鄭林等[2]對(duì)花粉形態(tài)的描述，董美芳等[3]對(duì)花粉超低溫保存1周后萌發(fā)率與不同的解凍方式的關(guān)系研究，但其試驗(yàn)中的應(yīng)用條件是水培條件，并且花粉來(lái)自盛開(kāi)的花朵，而花粉生活力受開(kāi)花程度的影響顯著。為此，本研究通過(guò)染色法、培養(yǎng)基萌發(fā)法，對(duì)不同貯藏條件下貼梗海棠花粉生活力的影響進(jìn)行了測(cè)定，以期為貼梗海棠的生產(chǎn)、科研提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)采用的貼梗海棠，種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)，試驗(yàn)當(dāng)天上午10：00采收花蕾數(shù)朵，將其快速地帶回實(shí)驗(yàn)室，并取出其花藥，混合均勻后分別裝入3個(gè)干燥的花粉瓶中，用塞子塞住瓶口，放入20益的光照培養(yǎng)箱中暫時(shí)儲(chǔ)存以備使用，用時(shí)隨機(jī)取出1份。

1.2方法

1.2.1形態(tài)觀察法

直接在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉形狀、對(duì)稱(chēng)性、極面觀和赤道面觀特點(diǎn)、萌發(fā)器官類(lèi)型、外壁紋飾特點(diǎn)等。在觀察的過(guò)程中，隨機(jī)選擇花粉20粒，測(cè)量赤道軸長(zhǎng)、極軸長(zhǎng)、條紋寬度、穿孔大小、穿孔密度、萌發(fā)溝長(zhǎng)等。

1.2.2TTC染色法

取少量花粉于載玻片上，加1滴蒸餾水，再加入1滴0.4%TTC溶液（取0.04gTTC溶解在10mL磷酸鹽溶液中，置入4益冰箱中），在25益的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min后置于顯微鏡下觀察。凡被染成紅色的花粉均為有生活力的貼梗海棠花粉。

1.2.3碘原碘化鉀染色法

根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的原理，從藍(lán)色的深淺程度來(lái)判斷貼梗海棠花粉粒中淀粉的含量，進(jìn)而確定貼梗海棠花粉?；钚缘母叩?。稱(chēng)取1.3g碘化鉀溶解于10mL的蒸餾水中，再加入0.3g的碘，等到全部溶解后加蒸餾水定容到100mL容量瓶中，配制成碘-碘化鉀溶液。用頭發(fā)絲刮取少許貼梗海棠花粉散落到載玻片上，加入1滴蒸餾水使花粉全部散開(kāi)，再滴入1滴碘-碘化鉀溶液立刻置顯微鏡下觀察。被染成藍(lán)色的均為有生活力的花粉，呈黃褐色的則是不具有生活力的花粉[4]。

1.2.4不同葡萄糖濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響

在硼酸溶液濃度均為20mg/L的基礎(chǔ)上，稱(chēng)取1g瓊脂，加入少量的硼酸溶液，加蒸餾水至100mL，裝入燒杯，加熱攪拌使瓊脂充分溶解呈透明狀即溶液沸騰（注意補(bǔ)充水分，以保持培養(yǎng)基的濃度），加入葡萄糖，配制葡萄糖濃度分別為0（清水對(duì)照）、5%、10%、15%、20%、25%共6個(gè)不同濃度的培養(yǎng)基。取6個(gè)干凈的載玻片，用滴管吸取少量的培養(yǎng)基，趁熱分別滴在載玻片的凹槽內(nèi)，放置片刻，使培養(yǎng)基凝固。用棉簽蘸取少量的貼梗海棠花粉輕輕均勻地撒播在培養(yǎng)基表面，注意切不可過(guò)多，否則難以觀察，將制備好的載玻片放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25益的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待貼梗海棠花粉萌發(fā)后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。觀察時(shí)每片隨機(jī)取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)貼梗海棠花粉總數(shù)及發(fā)芽數(shù)，計(jì)算平均萌發(fā)率（花粉觀察總數(shù)不少于100粒）。萌發(fā)率=（萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)）伊100%。在培養(yǎng)基上進(jìn)行貼梗海棠花粉的人工萌發(fā)，鑒定貼梗海棠花粉萌發(fā)率的高低[4]。

1.2.5不同溫度對(duì)花粉生活力的影響

將貼梗海棠花粉接種于僅有瓊脂的空白培養(yǎng)基上，分別在15、20、25益下培養(yǎng)4h后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.6不同貯藏條件對(duì)貼梗海棠花粉生活力的影響

為了找到貼梗海棠花粉最佳的貯藏條件，采用了TTC染色法研究了不同的貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)貼梗海棠花粉生活力的影響。將剛采集的貼梗海棠花粉裝入干燥潔凈的青霉素小瓶中，并加入硅膠粒干燥劑，采用常溫干燥貯藏、常溫貯藏、4益冷藏干燥貯藏、4益冷藏貯藏、-23益冷凍干燥貯藏、-23益冷凍貯藏6種方法，采用TTC染色法測(cè)定花粉生活力，起初每24h測(cè)定1次，1周后每5d測(cè)定1次，直到花粉完全失去生活力，方法及操作如1.2.2[4]。

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)觀察法

形態(tài)觀察法是根據(jù)不同植物典型性，如花粉粒的大小、形態(tài)、色澤等來(lái)判斷貼梗海棠花粉的生活力。結(jié)果顯示：貼梗海棠花粉為長(zhǎng)球形，赤道面觀橢圓形，花粉大?。?6.06～46.47）滋m伊（22.83～23.34）滋m，花粉為單粒、等極、輻射對(duì)稱(chēng)，極面觀三裂圓形，外壁為皺波狀紋飾，紋飾不清晰，穿孔少[5]。雖然這種方法簡(jiǎn)單易行，但不同的采集時(shí)間和保存時(shí)間對(duì)花粉的大小、色澤、形態(tài)、生活力等都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。因此，此方法較適合于貼梗海棠新鮮花粉生活力的檢測(cè)。

2.2TTC染色法與碘-碘化鉀染色法測(cè)定貼梗海棠花粉生活力的研究

觀察發(fā)現(xiàn)，貼梗海棠花粉均為長(zhǎng)球型。用TTC染色法測(cè)定貼梗海棠花粉的生活力，花粉細(xì)胞出現(xiàn)紅色（76.26%）、淡紅色（19.15%）無(wú)色（4.59%）3種顏色反應(yīng)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的染色率逐漸下降（表1）。

而用碘-碘化鉀染色后，染成深藍(lán)色（即有生活力）的花粉有42.46%，黃褐色（即沒(méi)有生活力）的花粉為57.54%，花粉生活力低于50%（表2）。結(jié)果表明：碘一碘化鉀染色法不能準(zhǔn)確地測(cè)定貼梗海棠海棠花粉生活力。這是因?yàn)槎鄶?shù)植物正常的成熟花粉粒積累有較多的淀粉，碘原碘化鉀溶液可將其染成藍(lán)色，而貼梗海棠可能是由于積累較少淀粉的緣故，所以碘原碘化鉀溶液不能準(zhǔn)確地測(cè)定貼梗海棠花粉生活力。分析認(rèn)為，具有活性的花粉細(xì)胞產(chǎn)生的NAD2H2可將無(wú)色的TTC還原成紅色的TTF而使本身被染成紅色，次活力的被染成淡紅的，而無(wú)生活力的貼梗海棠花粉因?yàn)闆](méi)有呼吸作用或呼吸作用很弱，變化不明顯[6]。兩種測(cè)定方法比較，TTC染色法更適合用于貼梗海棠花粉生活力的測(cè)定。

表1　溫度對(duì)密度和全干干縮率的影響

表2　碘原碘化鉀染色法中花粉細(xì)胞染色變化情況

2.3培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度對(duì)花粉生活力的影響

由圖1可知，不同濃度的葡萄糖對(duì)貼梗海棠花粉的萌發(fā)率和萌發(fā)速度均有影響。在不添加葡萄糖的培養(yǎng)基中，貼梗海棠花粉仍然有萌發(fā)現(xiàn)象，但是萌發(fā)率很低，花粉萌發(fā)率僅為3.54%耀8.75%，培養(yǎng)基中加入葡萄糖時(shí)花粉萌發(fā)率顯著提高，隨著葡萄糖濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度為10%時(shí)，花粉萌發(fā)率達(dá)到最高，接種培養(yǎng)2、4、6、8h后，花粉萌發(fā)率分別為10.30%、14.02%、12.37%、8.45%，見(jiàn)圖1。當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)10%時(shí)，花粉萌發(fā)率隨著葡萄糖濃度的增大而下降，試驗(yàn)結(jié)果表明：貼梗海棠花粉萌發(fā)最適宜的葡萄糖濃度為10%。

圖1　培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)花粉生活力的影響

花粉在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著觀察時(shí)間的推移，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，過(guò)早觀察，花粉還未開(kāi)始生長(zhǎng)；過(guò)晚觀察，花粉的生活力下降。試驗(yàn)結(jié)果表明：觀察花粉萌發(fā)的最佳時(shí)間是4h后。8h后觀察，花粉的生活力明顯下降到最低。說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉生活力逐漸下降。

2.4不同溫度對(duì)花粉生活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示：在15益時(shí)花粉的萌發(fā)率為8.62%，20益時(shí)升高至9.15%，25益時(shí)又下降至8.75%。可知在15耀25益培養(yǎng)條件下，隨著溫度的升高，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，貼梗海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)溫度為20益。

2.5不同貯藏條件對(duì)貼梗海棠花粉生活力的影響

花粉生活力的強(qiáng)弱受遺傳因素和外界環(huán)境的因素影響，貯藏時(shí)間是影響花粉生活力的一個(gè)主要因素，但是由于貯藏溫度不同，貼梗海棠花粉生活力下降速度也相對(duì)不同。從圖2可以看出：貼梗海棠花粉生活力受到貯藏溫度、貯藏時(shí)間的影響較大，干燥處理對(duì)花粉生活力的影響較小。常溫保存的貼梗海棠花粉7d后萌發(fā)率迅速下降到0，說(shuō)明花粉在溫室條件下，生活力下降速度極快，可能是因溫度過(guò)高，從而增加了花粉內(nèi)部的呼吸強(qiáng)度，從而導(dǎo)致花粉內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)枯竭。在低溫條件下貯藏的花粉呼吸作用受到抑制，花粉生活力下降速度相對(duì)較慢。在4益干燥條件下，貼梗海棠花粉生活力逐漸下降，貯藏到第30天，花粉的萌發(fā)率降到0%。而在-23益冷凍干燥條件下，貼梗海棠花粉生活力下降緩慢，在貯藏30d時(shí)，花粉萌發(fā)率降到38.57%，貯藏到50d時(shí)，花粉萌發(fā)率為18.74%。與室溫貯藏相比，4益和-23益冷凍處理花粉的萌發(fā)率下降速度較慢，能夠明顯延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，但以-23益處理較好。然而，對(duì)于雜交育種來(lái)說(shuō)，遠(yuǎn)程雜交的花粉，保存時(shí)無(wú)需在冷凍條件下進(jìn)行，一般采用冷藏處理即可保存花粉，并且對(duì)設(shè)備的需求低，盡可能在采集花粉3d內(nèi)完成。

圖2　不同貯藏條件下貼梗海棠花粉生活力隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

3　結(jié)論與討論

（1）利用染色法對(duì)花粉生活力測(cè)定具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但是受到花粉自身性質(zhì)（例如花粉細(xì)胞壁的厚薄、花粉外壁的組成物質(zhì)、花粉內(nèi)各種酶活性的強(qiáng)弱等）的影響較大，因此不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定。試驗(yàn)證明：碘原碘化鉀溶液不能準(zhǔn)確地測(cè)定貼梗海棠花粉的生活力，可能是由于貼梗海棠花粉體內(nèi)積累較少淀粉的緣故。而TTC染色法可以很快測(cè)定花粉的活力，并且具有時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等的優(yōu)點(diǎn)。

染色法對(duì)貼梗海棠花粉萌發(fā)的影響，一般情況下，染色法測(cè)定結(jié)果大都高于培養(yǎng)基萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果。但染色法和培養(yǎng)基萌發(fā)法測(cè)定的結(jié)果不能相互比較，兩者之間存在差異，差異一方面說(shuō)明花粉在染色法測(cè)定條件下可能比在柱頭上自然條件下萌發(fā)的能力高；另一方面說(shuō)明發(fā)芽法測(cè)定結(jié)果可能比實(shí)際情況偏低。在最適宜的濃度條件下，不同植物花粉的萌發(fā)力不同。不同植物的花粉生活力保持時(shí)間的長(zhǎng)短也不一樣，一方面是受環(huán)境因素的影響，另一方面也由遺傳因素所決定。雖然花粉萌發(fā)率不能完全等同于花粉生活力，但在實(shí)踐中大多數(shù)是以花粉萌發(fā)率來(lái)表示花粉生活力的[7-8]。

（2）培養(yǎng)基中葡萄糖濃度影響貼梗海棠花粉的萌發(fā)率，葡萄糖對(duì)貼梗海棠花粉的萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的影響，葡萄糖可以維持花粉與培養(yǎng)基成分之間的滲透壓平衡，為花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖濃度過(guò)高過(guò)低都不適合貼梗海棠花粉的萌發(fā)。濃度過(guò)低，則貼梗海棠花粉壁破裂而內(nèi)含物散出；濃度過(guò)高，則貼梗海棠花粉細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，從而抑制花粉萌發(fā)伸長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度為10%時(shí)，貼梗海棠花粉萌發(fā)率最高。

（3）測(cè)定不同貯藏條件對(duì)貼梗海棠花粉生活力的影響。結(jié)果證明：低溫貯藏優(yōu)于常溫貯藏處理；干燥貯藏法優(yōu)于非干燥貯藏法；在6種花粉的貯藏方法中，以低溫干燥貯藏法最好。證明了低溫干燥貯藏法比較有利于保持貼梗海棠花粉的生活力，采用此方法貯藏的花粉在貯藏20d后仍然有生活力。

［1］陳有民.園林樹(shù)木學(xué)［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2011：516-517.

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Studies on Measurement Methods of Pollen Viability

ZHU Jin-ru，SUN Xiao-guang1，ZHANG Xiao-man2
（1.Baoding City Transprotation Bureau，Baoding，Hebei 071000；
2.Agricultural University of Hebei Province，Baoding，Hebei 071000）

The birth of quince flowers as experimental material,studied the TTC，iodine,potassium iodide determination of two kinds of stain pollen viability,the effect of glucose on pollen germination in vitro culture and the influence of three dif原ferent temperature）15益。20益，25益）under the condition of the rule of variation of pollen germination,three kinds of storage conditions（temperature，4益，-23益）affect pollen storage.The results showed that:significant difference was found in determina原tion of different stain of pollen viability,TTC staining（76.26%）were significantly better than iodine-potassium iodide staining（42.46%）.Within a certain range,glucose and temperature can promote the germination of pollen，beyond the scope of in原h(huán)ibiting germination,the experiment proved that the best glucose concentration was 10%,the best germination temperature is 20益.Storage temperature has significant influence on pollen viability,one of the best storage conditions is 4益.

Chaenomeles speciosa；Pollen Germination；Pollen viability；Storage

Q944.58

A

1002-3356（2016）03-0010-04

2016-05-22

河北省林業(yè)廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（1402450），河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2016132）

朱金儒（1966-），男，工程師。E-mail：958890646@qq.com。

張曉曼（1977-），女，副教授。E-mail：173610925@qq.com。