多倍體彩色馬蹄蓮抗寒性初步研究

高靜 吳景芝 郭彥兵 吳紅芝

摘 要 彩色馬蹄蓮對(duì)低溫較敏感，當(dāng)溫度低于6℃就會(huì)產(chǎn)生低溫傷害。為摸清彩色馬蹄蓮多倍體是否在抗寒性方面有所改善，以2個(gè)彩色馬蹄蓮品種（Ym039、Gold affair）的四倍體及二倍體試管苗為材料，煉苗移栽成活后，進(jìn)行低溫脅迫和常溫對(duì)照處理，并檢測(cè)抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果表明：（2±0.5）℃下10 d后二倍體死亡率超過50%，四倍體死亡率30%左右；（6±0.5）℃低溫脅迫下，多倍體品種游離脯氨酸、MDA含量低于二倍體，而游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性均不同程度高于二倍體。上述生理指標(biāo)均表明，多倍體抗寒性比二倍體增強(qiáng)，通過多倍體途徑培育抗寒性品種具有可行性。

關(guān)鍵詞 彩色馬蹄蓮 ；低溫脅迫 ；抗寒性 ；生理生化指標(biāo) ；成活率

中圖分類號(hào) S682.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.012

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）屬天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉[1]，原產(chǎn)于非洲南部及埃及的河流、沼澤地。因其佛焰苞喇叭形（部分品種先端長(zhǎng)尖）、形似馬蹄狀而得名，佛焰苞色彩豐富艷麗有紅色、黃色，粉紅色、橙色等。葉為基生型，葉柄較長(zhǎng)，葉片多為箭形或戟形鮮綠色，部分品種葉片上有銀星斑點(diǎn)分布。由于彩色馬蹄蓮色彩豐富、形態(tài)高雅、用途廣泛，被譽(yù)為“21世紀(jì)花卉之星”。近幾年彩色馬蹄蓮在國(guó)內(nèi)外都越來越受歡迎，其中以鮮切花和盆花發(fā)展較好。

與二倍體相比，多倍體由于基因劑量效應(yīng)會(huì)帶來植株器官巨大性的變化，同時(shí)多倍體基因劑量的倍增，使植株內(nèi)的基因活性及酶的差異性得以增強(qiáng)，從而加強(qiáng)了植株的生態(tài)適應(yīng)力和逆境抗性，使其在生活力、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性、抗旱、抗寒及抗病蟲害等方面都表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[2-3]。

彩色馬蹄蓮對(duì)環(huán)境條件要求比較嚴(yán)格，高溫高濕容易誘發(fā)軟腐病，溫度過低會(huì)使植株受凍。最適合彩色馬蹄蓮生長(zhǎng)的溫度范圍為18～23℃，冬季溫度過低或夏季溫度過高，植株葉會(huì)枯萎，進(jìn)入休眠狀態(tài)[4]。彩色馬蹄蓮喜溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，低溫仍然是影響彩色馬蹄蓮產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一。因此，研究提高彩色馬蹄蓮抗寒性，減少低溫造成的損失，在生產(chǎn)上有著重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。

國(guó)外已有體細(xì)胞染色體加倍培育彩色馬蹄蓮多倍體品種的報(bào)道，國(guó)內(nèi)也有關(guān)于使用秋水仙素[6]及除草劑Oryzalin[7]對(duì)彩色馬蹄蓮多倍體誘導(dǎo)的報(bào)道。但對(duì)馬蹄蓮多倍體的生物學(xué)特征、生理生化特性等的研究報(bào)道甚少。因此，研究彩色馬蹄蓮多倍體抗逆性具有重要意義，其中多倍體抗寒性特征可為抗寒性品種的篩選及培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

彩色馬蹄蓮Ym039、Gold affair的無性四倍體及二倍體組培苗，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 多倍體幼苗離體培養(yǎng)

多倍體幼苗離體培育包括無菌體系建立、增殖、壯苗、生根等階段。增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L，壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L，生根培養(yǎng)基：MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。以上過程均在溫度（23±2）℃，光照1 000～2 000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 煉苗移栽

選取生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)且大小一致的Ym039和Gold affair的二倍體及四倍體試管苗各75瓶（每瓶5株），從培養(yǎng)室搬到準(zhǔn)備室放置1 d后，揭開瓶膜使其適應(yīng)與培養(yǎng)室不同的環(huán)境。移栽前準(zhǔn)備工作：（1）小心將苗從瓶子取出，去除根部培養(yǎng)基；（2）用洗滌劑小心清洗殘留的培養(yǎng)基，清水清洗3遍；（3）用500～1 000倍液的多菌靈或百菌清浸根30 min；（4）清水清洗2～3遍；（5）配制基質(zhì)及種植。按上述方法分2批種植4種彩色馬蹄蓮試管苗，分別于揭膜后第1天和第3天種植，觀察其成活率。

1.2.3 低溫處理

（2±0.5）℃低溫處理：2013年冬天昆明遭遇雨雪低溫天氣約一周，種植于簡(jiǎn)易大棚中（溫度為2～10℃），彩色馬蹄蓮受到嚴(yán)重影響。采收后發(fā)現(xiàn)二倍體的死亡率明顯高于四倍體。為了驗(yàn)證多倍體的抗寒性是否優(yōu)于二倍體，以不同倍性的Ym039及Gold affair的植株為材料，每個(gè)品種挑選40株，轉(zhuǎn)入溫度為（2±0.5）℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時(shí)間14 h，10 d后統(tǒng)計(jì)死亡率。

6℃低溫處理：將不同倍性彩色馬蹄蓮植株連花盤一同移入光照培養(yǎng)箱中，在平均溫度（6±0.5）℃，光照時(shí)間14 h條件下進(jìn)行低溫脅迫處理。7 d后，分別取對(duì)照與低溫處理的植株葉片，測(cè)定其生理生化指標(biāo)并作對(duì)比分析。

1.2.4 生理指標(biāo)及測(cè)定

脯氨酸（Pro）用茚三酮顯色法測(cè)定[8]；過氧化物酶（POD）用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）用NBT顯色法測(cè)定；丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[9]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用DPS6.55crack分析數(shù)據(jù)。文中顯著性分析均是在同一品種不同倍性間進(jìn)行，不同品種間無相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同移栽時(shí)間對(duì)彩色馬蹄蓮移栽成活率的影響

不同移栽時(shí)間對(duì)彩色馬蹄蓮成活率的影響見表1。由表1可以看出，試管苗煉苗移栽分揭膜后1 d和3 d兩批進(jìn)行，其煉苗成活率差異巨大。揭膜1 d后移栽成活率均高于90%，揭膜3 d后移栽的成活率在66%～76%，同一時(shí)間移栽的多倍體與二倍體植株間成活率無顯著差異，同一品種不同時(shí)間移栽成活率有極顯著差異。

2.2 低溫處理對(duì)成活率的影響

低溫對(duì)彩色馬蹄蓮的影響見表2。由表2可以看出，（2±0.5）℃低溫處理后，部分植株死亡，多倍體的死亡率在30%左右，二倍體死亡率超過50%。低溫脅迫處理后四倍體死亡率明顯低于二倍體，與二倍體相比，多倍體的抗寒能力有所增強(qiáng)。（6±0.5）℃低溫處理7 d后，并未發(fā)現(xiàn)完全死亡的植株，Gold affair四倍體體和二倍體均正常生長(zhǎng)，未出現(xiàn)嚴(yán)重凍害的癥狀。Ym039（2X）部分葉片出現(xiàn)葉片水漬狀及失水變軟等受害癥狀，取出放置于室溫，幾天后部分受害葉片恢復(fù)正常生長(zhǎng)，Ym039（4X）無明顯受害癥狀。

2.3 游離脯氨酸含量

在植物體內(nèi)，脯氨酸作為滲透物質(zhì)，起著滲透調(diào)節(jié)的作用[10]。植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時(shí)，游離脯氨酸含量便會(huì)大量積累，并且積累量與植物抗逆性有關(guān)[8]。由表3可以看出，低溫脅迫處理后植株體內(nèi)脯氨酸含量有所增加。運(yùn)用DPS進(jìn)行顯著性分析可得，各品種經(jīng)過低溫脅迫處理的植株脯氨酸含量都顯著高于對(duì)照。經(jīng)過低溫脅迫處理的Ym039（2X）其游離脯氨酸含量顯著高于Ym039（4X），常溫下對(duì)照組無顯著性差異；低溫脅迫處理的Gold affair（2X）其游離脯氨酸含量極顯著高于Gold affair（4X），常溫對(duì)照組二倍體顯著高于四倍體。脯氨酸含量與植物品種抗寒性呈負(fù)相關(guān)。

2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧生物體內(nèi)普遍存在的一種含金屬的保護(hù)性酶。SOD活性和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率都可以表示植物抗寒過程中的生理狀況[11]，所以測(cè)定SOD活性的變化可以作為植物抗逆性分析的參考指標(biāo)。由表4可以看出，經(jīng)過低溫脅迫處理的植株SOD活性都不同程度高于常溫對(duì)照。使用DPS進(jìn)行顯著性分析后，Ym039四倍體SOD活性在低溫脅迫后顯著高于二倍體，常溫下對(duì)照組無顯著性差異。Gold affair在低溫處理后，多倍體極顯著高于二倍體，常溫對(duì)照組四倍體與二倍體之間都沒有顯著性差異。根據(jù)SOD活性分析，抗寒性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篩m039（4X）>Ym039（2X），Gold affair（4X）>Gold affair（2X）。

2.5 過氧化物酶（POD）活性

POD是膜保護(hù)系統(tǒng)的組成部分，它是植物內(nèi)的自由基的有效清除劑[14]。從表5可以看出，低溫脅迫處理后，所有植株的POD活性都有不同程度上升。Ym039四倍體POD活性增加幅度大于二倍體，Ym039（2X）比Ym039（4X）對(duì)低溫更敏感；Gold affair四倍體POD活性增加幅度大于二倍體，Gold affair （2X）比Gold affair （4X）對(duì)低溫更敏感。運(yùn)用DPS軟件分析得到經(jīng)過低溫脅迫處理的Ym039（4X）的POD活性極顯著高于Ym039（2X），對(duì)照組無顯著性差異。經(jīng)過低溫脅迫處理的Gold affair（4X） SOD活性極顯著高于Gold affair（2X），對(duì)照組多倍體顯著高于二倍體。根據(jù)POD活性比較，抗寒性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篏old affair（4X）>Gold affair（2X），Ymo39（4X）>Ym039（2X）。

2.6 丙二醛（MDA）含量

當(dāng)植株受到低溫、高溫、干旱等逆境后，細(xì)胞膜透性會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶系統(tǒng)和代謝過程遭到破壞，引發(fā)和加劇了膜脂過氧化作用，膜脂過氧化產(chǎn)物 MDA 增多，并且擴(kuò)散到其他部位，影響了組織內(nèi)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行[12-13]。MDA含量增加越多說明膜脂過氧化程度越嚴(yán)重。由表6可以看出，低溫脅迫后，二倍體MDA上升均明顯。通過DPS顯著性分析可知，Gold affair低溫脅迫處理二倍體MDA含量顯著高于多倍體，常溫對(duì)照組無顯著性差異。Ym039低溫脅迫處理二倍體MDA含量顯著高于多倍體，常溫對(duì)照組無顯著性差異。

2.7 可溶性蛋白質(zhì)含量

在植物體內(nèi)，可溶性蛋白可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、能量物質(zhì)和信息傳遞物質(zhì)，在植物抵御逆境過程中起到較大的作用[15]。植物生長(zhǎng)過程中遇到低溫脅迫時(shí)，植物會(huì)通過改變體內(nèi)可溶性蛋白含量來增加保水能力以防止組織結(jié)冰而造成傷害。從圖1可以看出，低溫脅迫后Ym039（4X）的可溶性蛋白含量比Ym039（2X）增加了6.4%，Gold affair（4X）可溶性蛋白含量比Gold affair（2X）增加了23%。2個(gè)品種的四倍體可溶性蛋白含量均大于二倍體。

3 結(jié)論與討論

3.1 影響彩色馬蹄蓮無菌苗移栽成活的關(guān)鍵因子

張馨月等報(bào)道，揭膜3 d后進(jìn)行移栽，那時(shí)彩色馬蹄蓮的葉片由嫩綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，成活率達(dá)到95%以上[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：揭膜1 d后移栽的成活率高于90%，揭膜3 d后移栽的成活率只有66%～76%。試管苗煉苗移栽的成活率受許多因素的影響，如苗本身質(zhì)量、光照、溫度、基質(zhì)、移栽時(shí)間等。試管苗揭膜后無菌的環(huán)境被破壞，培養(yǎng)基上可能滋生不同種類的菌類使幼苗被感染，實(shí)際感染情況因幼苗本身的健壯程度及環(huán)境因子的不同而不同，高溫尤其促進(jìn)病菌的滋長(zhǎng)。因此，用于煉苗的試管苗要生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)達(dá)，并在揭膜1 d后盡快移栽，尤其是高溫季節(jié)，以此來提高移栽成活率。

3.2 彩色馬蹄蓮多倍體抗低溫生理反應(yīng)特征

20世紀(jì)90年代起，很多學(xué)者以辣椒[17]、黃瓜[18]，茄子[19]為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)POD酶、SOD酶等保護(hù)酶活性變化與抗寒性的關(guān)系進(jìn)行研究，抗寒性強(qiáng)的品種相應(yīng)的酶活性也高。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫處理后彩色馬蹄蓮體內(nèi)SOD及POD活性都增強(qiáng)，其中多倍體的增加顯著高于二倍體。說明在受到低溫脅迫的時(shí)候，彩色馬蹄蓮多倍體通過增加細(xì)胞氧化相關(guān)酶SOD、POD的活性抵御低溫傷害的能力提高。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)杏[20-21]、紫椴[22]、珊瑚樹[23]等的研究結(jié)果表明，可溶性蛋白質(zhì)含量高的品種抗寒性亦強(qiáng)，在抗寒鍛煉過程中可溶性蛋白含量有增加的趨勢(shì)，其中抗寒性差的品種增加幅度較小，反之則大[24]。本研究結(jié)果表明，彩色馬蹄蓮多倍體可溶性蛋白含量高于二倍體，且在低溫脅迫時(shí)可溶性蛋白含量增加幅度比二倍體大。可溶性蛋白的含量高可提高細(xì)胞的保水能力，降低冰點(diǎn)從而提高植物的抗寒能力。因此，彩色馬蹄蓮四倍體對(duì)低溫脅迫的抵抗能力比二倍體強(qiáng)。低溫脅迫處理時(shí)，4種彩色馬蹄蓮體內(nèi)的MDA含量都有所增加，但多倍體增加幅度小于二倍體。膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量增加越多，說明膜脂過氧化程度越嚴(yán)重[13]，彩色馬蹄蓮多倍體MDA含量增加低于二倍體，彩色馬蹄蓮多倍體抗寒性強(qiáng)于二倍體。

3.3 彩色馬蹄蓮多倍體抗低溫脯氨酸調(diào)節(jié)

近年來，不少學(xué)者在抗寒育種中運(yùn)用脯氨酸含量變化作為判斷其抗寒性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，但是觀點(diǎn)尚未統(tǒng)一。包括以下幾種觀點(diǎn)：①在低溫脅迫下脯氨酸的積累能力與品種抗寒性成正相關(guān)性[25-26]。②在低溫脅迫下脯氨酸的積累能力與品種的抗凍寒力成負(fù)相關(guān)[27-28]。③低溫脅迫下脯氨酸的積累不穩(wěn)定[29]。試驗(yàn)結(jié)果表明，彩色馬蹄蓮多倍體在低溫脅迫時(shí)游離脯氨酸增加顯著低于二倍體，屬于第二種類型，脯氨酸的積累能力與品種的抗凍寒力成負(fù)相關(guān)。持這一觀點(diǎn)的研究者認(rèn)為，抗寒性弱的品種在受到低溫脅迫后，為適應(yīng)寒冷、保護(hù)體內(nèi)組織免受凍害過早地積累了大量的游離脯氨酸，而游離脯氨酸積累高峰出現(xiàn)晚的品種，抗寒性強(qiáng)；或者認(rèn)為，游離脯氨酸積累是植物的被動(dòng)反應(yīng)，作為植物低溫下的傷害程度指標(biāo)。

生理指標(biāo)測(cè)定與分析結(jié)果表明：低溫脅迫下不同品種多倍體的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性均高于二倍體，MDA含量、游離脯氨酸含量低于二倍體，彩色馬蹄蓮多倍體抗寒性比二倍體增強(qiáng)。研究結(jié)果僅限于2個(gè)品種的數(shù)據(jù)，對(duì)于其他彩色馬蹄蓮品種多倍體的抗寒性是否都優(yōu)于二倍體，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)探索。除抗寒性外，需要對(duì)馬蹄蓮多倍體抗旱性、抗病性、耐鹽脅迫性等逆境的能力進(jìn)行試驗(yàn)，以便更好地為馬蹄蓮多倍體優(yōu)良品種的培育提供支持。

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