黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工業(yè)釀酒酵母CICC1346中的表達

康小龍,呂曉靜,黃清媚,熊春江,林蔣海,肖文娟,劉澤寰

(暨南大學 生命科學技術學院，生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東 廣州，510632 )

?

黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工業(yè)釀酒酵母CICC1346中的表達

康小龍,呂曉靜,黃清媚,熊春江,林蔣海,肖文娟,劉澤寰*

(暨南大學 生命科學技術學院，生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東 廣州，510632 )

通過重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)擴增黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和釀酒酵母α-信號肽序列，定向重組到整合型表達載體pδRCMB中，并在CICC1346中實現分泌表達；然后通過同源建模、利用分子模擬軟件Discovery Studio 4.1分析其蛋白結構，以對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)為底物，建立并確定酶活反應條件，并進行純化、酶學性質分析；將密碼子優(yōu)化后序列在CICC1346中實現分泌表達，利用淀粉進行共發(fā)酵實驗。結果顯示：重組酶突變后相對野生型蛋白結構無影響。SDS-PAGE分析重組重組酶大小約為70 kDa；優(yōu)化后最高酶活達到0.69 U/mL，重組酶最適pH為6.5，在pH4.5.0～7.0維持90%以上的酶活；最適溫度為40 ℃，在30～40 ℃維持接近100%的酶活；受Cu2+和Mn2+嚴格抑制；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶及糖化酶協(xié)同利用淀粉產乙醇，提高淀粉水解效率。這是首次報道黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母整合型分泌表達。

釀酒酵母；黃曲霉；重疊延伸PCR(splicing by overlap extension,SOE-PCR)；同源建模；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶；淀粉

淀粉是由葡萄糖為基本單位聚合而成的多糖，是自然界中含量最豐富的碳水化合物之一。淀粉鏈主要由α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵連接葡萄糖單元而成。其中，α-1,6-糖苷鍵只占總糖苷鍵很少比例,卻是淀粉鏈形成分支結構的關鍵。α-1,6-糖苷鍵限制淀粉被酶水解效率，加入α-1,6-糖苷水解酶( 即淀粉脫支酶)，可有效地提高淀粉原料的利用率及生產效率[1]。水解淀粉α-1,6-葡萄糖苷鍵的酶，也稱為解支酶(淀粉脫支酶, Debranching enzyme)，包括寡聚-1,6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.10, Oligo-1,6-glucosidase)、普魯蘭酶( EC 3.2.1.41, Pullulanase),異淀粉酶(EC3.2.1.68, Isoamylase)、支鏈淀粉-6-葡聚糖水解酶( EC3.2.1.69, Amylopectin-6-glucanohydrase)等。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶可釋放α-1→6連接的葡萄糖[2-3]。在工業(yè)生產葡萄糖中，通過寡聚-1,6-葡萄糖苷酶(又稱為異麥芽糖酶)可降解其副產物異麥芽糖，提高葡萄糖產率[4]。目前，對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶研究主要集中在：將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熱葡糖昔酶芽胞桿菌(BacillusthermoglucosidasiusKP1006)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等細菌來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)或畢赤酵母中(Pichiapastoris)表達[5-7]；或對GH13家族中寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與新普魯蘭酶進行定性、分類研究[8]；以及利用其降解異麥芽糖的特性，提高對葡萄糖耐受性應用到工業(yè)葡萄糖生產中，以提高葡萄糖產率[4]。

統(tǒng)合生物工藝(consolidated bioprocessing，CBP)是將酶的生成、底物降解以及產物的生物轉化等一系列的生物催化過程由一種或一組微生物在一個反應器能完成，具有簡便、節(jié)省工藝、減少商業(yè)酶添加等優(yōu)點[9- 10]。其中，以釀酒酵母為表達宿主，實現了多酶表達，并開展了“纖維素-乙醇”[11]、“淀粉-乙醇”的生物統(tǒng)合工藝研究[12]。研究人員嘗試在釀酒酵母中通過共表達淀粉酶、糖化酶、以及脫支酶實現對“一步法降解淀粉”[13-15]。而作為脫支酶的一種，在釀酒酵母中表達寡聚-1,6-葡萄糖苷酶，并以此基礎探究其對淀粉降解輔助作用研究的較少。因而，本實驗嘗試在工業(yè)釀酒酵母CICC1346(“臺灣396”)[16]中通過YEp型(整合型)載體[17]實現寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的異源表達，并通過密碼優(yōu)化提高酶活，并研究了寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的酶學特性、利用淀粉共發(fā)酵等。這是報道中首次成功將黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母中實現分泌表達。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

釀酒酵母菌株CICC1346購于CICC、重組酵母pδRCMB-amy-ga為本實驗室已構建[18]；黃曲霉菌株S7由本校食品學院饋贈；大腸桿菌DH5α為本實驗室保藏；載體pMD19-T購于寶生物工程(大連)有限公司;載體pδRCMB為本實驗室構建(啟動子Ppgk1，終止子Tpgk1)。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.0，添加終質量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素；在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，篩選E.coli轉化子。YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20，添加終質量濃度為300 μg/mL的氨基糖苷類抗生素G418；在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，篩選酵母轉化子。PDA 培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15～20、去離子水1 000 mL，自然pH；在30℃，150 r/min條件下培養(yǎng)黃曲霉?？扇苄缘矸郯l(fā)酵培養(yǎng)基：將7.5 g可溶性淀粉溶解于pH5.5的50 mL緩沖液中，補加2%的蛋白胨。

pNPG(對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷)購自阿拉丁公司；肽N-糖苷酶F(PNGase F)，購自NEB。

1.2方法

1.2.1常規(guī)分子生物學操作

大腸桿菌感受態(tài)制備，質粒的提取、酶切、純化，載體與DNA片段的連接，酵母基因組提取等方法見《分子克隆實驗指南》。

1.2.2引物設計

重疊延伸PCR(OverlapPCR)、PCR驗證相關引物合成，由Invitrogen公司完成，具體見表1。

表1　引物序列

注：下劃線標注的為限制性內切酶識別序列。

1.2.3mfα(α-信號肽序列)和oli(oligo-1,6-glucosidase)及m-oli基因的擴增

根據GenBank釀酒酵母Mf(alpha)信號肽序列(NCBI登錄號:NM_001184001.1 I:296148471)，以MFαF和MFαR為引物擴增出276 bp的mfα。根據黃曲霉NRRL3357的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因(NCBI登錄號：NW_002477249.1)序列(經Sinal 4.1軟件在線檢測，無信號肽序列)，設計引物以黃曲霉菌株S7基因組DNA為模板，通過重疊延伸PCR去除內含子，將外顯子片段拼接在一起。密碼子優(yōu)化序列(m-oli)則根據擴增出的oli序列及其對應氨基酸序列，由金唯智生物公司合成。

1.2.4質粒pδRCMB-oli和pδRCMB-m-oli的構建與轉化

利用重疊延伸PCR技術將α信號肽分別與黃曲霉oli基因、m-oli基因拼接，得到oli、m-oli，在進行TA克隆，雙酶切驗證，測序。隨后將mfα-oli分別連接到pδRCMB上，得到質粒pδRCMB-oli和pδRCMB-m-oli。重組質粒利用醋酸鋰電轉化法[19-20]，分別轉入工業(yè)釀酒酵母菌株CICC1346，利用 G418抗性平板篩選得到陽性轉化子。將轉化子提取其基因組，進行PCR驗證。

1.2.5同源建模與DS4.1軟件模擬突變分析突變影響

經Blastn比對查找相似序列，對其晶體蛋白分子的重原子骨架RMSD(均方根偏差)分析，通過Discovery Studio 4.1(生物信息學分析由暨南大學姚東升課題組協(xié)助分析)進行建模、虛擬突變和分子動力學模擬等得出氨基酸突變影響。

1.2.6超濾、凝膠層析分離以及N-糖基化分析

利用PALL的超濾離心管對發(fā)酵上清液總分泌蛋白進行超濾濃縮、分離，再利用PBS 緩沖液(pH6.5)在島津LC-20A(制備型)高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)系統(tǒng)進行凝膠層析分離純化。使用NEB公司的肽N-糖苷酶F進行N-糖基化，具體步驟參考其使用說明。

1.2.7菌體生長測定和酶活測定

利用分光光度計，測定OD600值，顯示菌體的生長情況。

根據pNPG法測定寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活[21]。以酶活力為指標，設計了不同的底物濃度、反應溫度以及反應時間下的重組酶酶活反應的單因素實驗，得出寡聚-1,6-葡萄糖苷酶最佳反應條件為：4 mmol/L的底物pNPG，40℃反應30 min。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為：在40 ℃，pH6.5的條件下，1 min時間水解1 μmolpNPG所需的酶量，以IU表示。

1.2.8利用淀粉共發(fā)酵

α-淀粉酶和糖化酶以及脫支酶在利用淀粉時具有協(xié)同作用。本實驗設計了重組了低聚-1,6-糖苷酶的釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)外加的α-淀粉酶(5 IU/g)和糖化酶(10 IU/g)、重組淀粉酶基因和糖化酶基因的重組釀酒酵母(CICC1346/p&-amy-ga)外加的重組低聚-1,6-糖苷酶(5 IU/g)等利用淀粉共發(fā)酵實驗，同時以釀酒酵母CICC1346、釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)作為對照組進行研究。重組重組釀酒酵母(CICC1346/p&-amy-ga)經測定其α-淀粉酶和糖化酶分別為1.10 IU/mL、1.89 IU/mL，重組釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)低聚-1,6-糖苷酶0.60 IU/mL。

島津LC-15C高效液相色譜系統(tǒng)，A minex HPX-87H色譜柱對發(fā)酵乙醇進行測定，α-淀粉酶與糖化酶活性測定分別參考王永剛[22]與李穎[23]的方法進行操作。淀粉含量測定參考劉海林等[24]的方法。

2　結果與分析

2.1同源建模與DS4.1軟件模擬突變

基因測序后，經Blastn分析，與已報道的黃曲霉NRRL3357的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因相比，一致性為99%，有8個核苷酸差異；經Blastp分析，氨基酸序列在第41位、第314、第524位分別由Ile變?yōu)閂al，由Glu變?yōu)長ys，Ala變?yōu)門hr；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與PDB庫中1UOK，3A47以及4M56的氨基酸序列的同一性和相似性均較高：同一性為32.2%，序列相似性為56.1%，可認為具有同源性。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶分子的第41、314和524位氨基酸并不處于保守區(qū)，突變前后殘基性質相似，因此初步判斷突變對野生型酶的結構影響不大。經晶體蛋白分子的重原子骨架RMSD(均方根偏差)分析得知它們的三維結構非常相似。因而，以1UOK、3A47和4M56的晶體結構為模板對黃曲霉的寡聚-1，6-葡萄糖苷酶分子的氨基酸序列進行同源建模，并進行虛擬突變(如圖1所示)，其突變能值(Mutation Energy)為-0.16 kcal/mol，自由能值稍微小于野生型。因此，從突變能的角度預測該類型的突變對野生型寡聚-1，6-葡萄糖苷酶分子的結構沒有影響。最后，通過分子動力學模擬，平衡后的RMSD值均<2埃(蛋白骨架的RMSD值小于3埃的情況則認為該結構是穩(wěn)定的)，說明突變后的結構是穩(wěn)定且與野生型的相近。綜上，得出本研究中的氨基酸突變對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶分子的結構無影響。

A：野生型的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶蛋白結構；B：突變后的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶蛋白結構；第59、344和567位氨基酸殘基分別突變?yōu)槔i氨酸、賴氨酸和絲氨酸圖1　寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的蛋白結構Fig.1　Protein structure of oligo-1,6-glucosidase

2.2寡聚-1,6-葡萄糖苷酶在重組工業(yè)釀酒酵母CICC1346中表達

重組載體pδRCMB-oli、pδRCMB-m-oli轉入CICC1346后，以重組釀酒酵母基因組DNA為模板進行PCR反應，通過瓊脂糖凝膠電泳分析表明(如圖2所示)經密碼子優(yōu)化后的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因已成功轉入工業(yè)釀酒酵母CICC 1346(選取陽性菌株進行酶活測定)。

M-DNA Marker；1～3-CICC1346/ pδRCMB-oli的PCR產物；4～5-CICC1346/pδRCMB-m-oli6：陽性對照；7-陰性對照圖2　重組釀酒酵母的PCR產物電泳圖Fig.2　Agarose gel analysis of PCR product of m-oli gene from recombinant yeast

利用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線檢測，重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶只在第109位氨基酸可能會發(fā)生N-糖基化。N-糖基位點經去糖基化酶作用后蛋白大小無明顯變化，可能重組酶糖基化水平低。純化后重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶經SDS-PAGE檢測(如圖3所示)，重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli、重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli如圖3中 A、B泳道在約70 kDa處(預測重組蛋白分子約為68.65 kDa)均有明顯的條帶，證明重組酶成功在釀酒酵母CICC1346中表達。

M-標準蛋白；A-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli；B-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli圖3　重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of heterologous recombinant oligo-1,6-glucosidase

2.3重組釀酒酵母生長及產酶曲線

對重組釀酒酵母進行生長和產酶分析，由圖4可知，重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的合成屬于生長偶聯型，約在60 h達到平臺期。而經密碼子優(yōu)化后，重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli分泌最高酶活約為0.69 U/mL，而未有優(yōu)化重組酶最高約為0.16 U/mL，約提高了4.3倍。

■-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli的生物量(OD600)；▲-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli生物量的(OD600)；□-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活；△-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活圖4　重組釀酒酵母的生長及產酶曲線Fig.4　Growth and oligo-1,6-glucosidase biosynthesis curve of recombinant yeasts

2.4重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶學特性

由圖5-A可知，重組釀酒酵母的重組酶的最適pH是在pH6.5，黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的也在pH6.5。由圖5-B可知，在pH4.5～7.0時，寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力較穩(wěn)定，維持90%以上的酶活；當pH值大于7.5時，酶活力受到抑制。由圖5-C可知，寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最適溫度為40 ℃。由圖5-D可知，在低于40 ℃時酶活力能夠較好地保持，基本達到了100%的酶活力。而當在50℃以上時，重組酶和野生型的酶穩(wěn)定性均迅速下降。

A：pH對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力的影響；B：pH對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響;C：溫度對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶活力的影響；D：溫度對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響圖5　寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的酶學特性Fig.5　Characterization of recombinant oligo-1,6-glucosida

由圖6可知，在10 mmol/L的離子濃度，選取的金屬離子中Cu2+和Mn2+對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活抑制明顯，酶活性下降到10%以下，而其他的金屬離子Mg2+、Ca2+以及Ba2+對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活有促進作用。

圖6　金屬離子對寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的影響Fig.6　Effect of 10 mM metal ions on the activity of oligo-1,6-glucosida

2.5重組釀酒酵母利用淀粉共發(fā)酵產乙醇

如圖7-a所示，釀酒酵母CICC1346和重組低聚-1,6-糖苷酶釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)基本不能利用可溶性淀粉，低聚-1,6-糖苷酶作用于支鏈的支點α-1,6-糖苷鍵，無法直接利用淀粉；而重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)以及釀酒酵母CICC1346，在外加淀粉酶和糖化酶能夠利用淀粉；二基因重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-amy-ga)也能利用淀粉。因而，如圖7-b所示，釀酒酵母CICC1346和重組低聚-1,6-糖苷酶釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)菌體生長較差，增加約2個OD600(利用種子液殘留少量葡萄糖)；其余實驗組能夠利用可溶性淀粉，生長速率接近，最終OD600約為19。

a：淀粉消耗曲線；b：菌體生長曲線；c：乙醇生產曲線圖7　重組釀酒酵母利用淀粉共發(fā)酵產乙醇Fig.7　Growth curve, time courses of starch hydrolysis and ethanol production via fermentation from starch

如圖7-c所示，外加了α-淀粉酶和糖化酶后的釀酒酵母CICC1346和重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)生成乙醇速率最快，且外加酶的重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)乙醇濃度略高于外加酶釀酒酵母CICC1346。外加酶時，酶量相對較多，能夠迅速降解底物，相應乙醇產率較快，且低聚-1,6-糖苷酶與α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同作用淀粉底物；二基因重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-amy-ga)與其在外加了低聚-1,6-糖苷酶的乙醇產率接近，脫支酶(包括低聚-1,6-糖苷酶)在支鏈的分枝點足夠多時作用效果才明顯，這需要足量的α-淀粉酶和糖化酶；而釀酒酵母CICC1346和重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)可能利用種子液殘?zhí)?，生產少量的乙醇(少于0.5 g/L)。

3　討論

寡聚-1,6-葡萄糖苷酶是專一性水解α-1,6-葡萄糖苷鍵的水解酶, 它偏愛短鏈的寡糖底物,在動物腸道參與碳水化合物的代謝[25]，參與寡糖底物的進一步降解利用。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶作為“淀粉脫支酶”的一種，屬于間接性脫支酶，它不直接作用于分支點的α-1,6-糖苷鍵，是能從多糖的非還原端水解解α-1,6-葡萄糖苷鍵的外切酶[5]。國內外多將芽孢桿菌屬來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶克隆到大腸桿菌或畢赤酵母里實現異源性表達[2, 6, 25]，而較少采用真核生物來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶進行異源性表達，也尚未在釀酒酵母里實現異源表達。蔣思婧等將枯草芽孢桿菌來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中進行誘導后表達，酶活能夠達到0.34～2.2 U/mL[2]。本文首次將黃曲霉來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母里實現分泌表達，經密碼子優(yōu)化后的實驗菌株其酶活最高可以達到0.69 U/mL。

本文實現了首次將黃曲霉來源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因通過δ整合方式在釀酒酵母里分泌表達，而δ整合是通過同源重組方式將目的基因穩(wěn)定的整合到酵母染色體，不易丟失目的基因，被認為是工業(yè)上采用的主要重組方式，可減少利用抗生素等進行抗性篩選[26-27]。本文在實現了在釀酒酵母中分泌表達黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的基礎上，并利用淀粉進行共發(fā)酵實驗探索其輔助淀粉酶、糖化酶降解淀粉的作用。希望以后通過分子生物學方法定向改造其酶學特性或提高其酶活，構建三基因共表達的重組菌株以真正實現對支鏈淀粉的統(tǒng)合生物加工工藝。

[1]段緒果, 吳敬. 微生物 GH13 家族淀粉脫支酶研究進展 [J]. 微生物學報, 2013, 53(7):648-656.

[2]蔣思婧, 張維林, 馬立新. 枯草芽孢桿菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中的表達研究 [J]. 湖北大學學報:自然科學版, 2006, 27(3):272-274.

[3]WATANABE K, MIYAKE K, SUZUKI Y. Identification of catalytic and substrate-binding site residues inBacilluscereusATCC7064 oligo-1, 6-glucosidase [J]. Bioscience Biotechnol Biochemistry, 2001, 65(9):2 058-2 064.

[4]OGAWA S, SHIOTA K, YOSHIDA T. Improvement of the Glucose Tolerance of Oligo-1, 6-glucosidase fromGeobacillusthermoglucosidasius[J]. Journal of Applied Glycoscience, 2015, 8(1):77-83

[5]SUZUKI Y, TOMURA Y. Purification and characterization ofBacilluscoagulansoligo-1,6-glucosidase [J]. European Jounal of Biochemistry, 1986, 62(1):21-24.

[6]JIANG S, MA L. Cloning and expression inEscherichiacoliof oligo-1,6-glucosidase gene fromBacillussubtilisHB002 [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2002, 42(2):145-152.

[7]WATANABE K, FUJIWARA H, INUI K, et al. Oligo-1,6-glucosidase from a thermophile,BacillusthermoglucosidasiusKP1006, was efficiently produced by combinatorial expression of GroEL inEscherichiacoli[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2002, 35(1):35-43.

[8]MAJZLOVA K, PUKAJOVA Z, JANECEK S. Tracing the evolution of the α-amylase subfamily GH13_36 covering the amylolytic enzymes intermediate between oligo-1, 6-glucosidases and neopullulanases [J]. Carbohydrate Polymers Carbohydr, 2013, 367:48-57.

[9]HASUNUMA T, KONDO A. Consolidated bioprocessing and simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulose to ethanol with thermotolerant yeast strains [J]. Process Biochemistry, 2012, 47(9):1 287-1 294.

[10]FAVARO L, VIKTOR M, ROSE S, et al. Consolidated bioprocessing of starchy substrates into ethanol by industrialSaccharomycescerevisiaestrains secreting fungal amylases [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2015, 112(9):1 751-1 760.

[11]HASUNUMA T, OKAZAKI F, OKAI N, et al. A review of enzymes and microbes for lignocellulosic biorefinery and the possibility of their application to consolidated bioprocessing technology [J]. Bioresource Technoly, 2013, 135:513-522.

[12]VIKTOR M, ROSE S H, VAN ZYL W H, et al. Raw starch conversion bySaccharomycescerevisiaeexpressingAspergillustubingensisamylases [J]. Biotechnol for Biofuels, 2013, 6(1):167-178.

[13]KIM JH, KIM HR, LIM MH, et al. Construction of a direct starch-fermenting industrial strain ofSaccharomycescerevisiaeproducing glucoamylase, α-amylase and debranching enzyme [J]. Biotechnol Letts, 2010, 32(5):713-719.

[14]JANSE B, PRETORIUS I. One-step enzymatic hydrolysis of starch using a recombinant strain ofSaccharomycescerevisiaeproducing α-amylase, glucoamylase and pullulanase [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995, 42(6):878-883.

[15]TALEKAR S, PANDHARBALE A, LADOLE M, et al. Carrier free co-immobilization of alpha amylase, glucoamylase and pullulanase as combined cross-linked enzyme aggregates (combi-CLEAs):A tri-enzyme biocatalyst with one pot starch hydrolytic activity [J]. Bioresource Technology, 2013, 147:269-275.

[16]岳國君. 現代酒精工藝學 [M]. 北京：化學工業(yè)出版社, 2011.

[17]CHRISTIANSON T W, SIKORSKI R S, DANTE M, et al. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors [J]. Gene, 1992, 110(1):119-122.

[18]閆凱. 餐廚廢棄物-燃料乙醇生物轉化研究 [D].廣州：暨南大學, 2013.

[19]GIETZ R D, SCHIESTL R H, WILLEMS A R, et al. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure [J]. Yeast, 1995, 11(4):355-360.

[20]SIKORSKI R S, HIETER P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA inSaccharomycescerevisiae[J]. Genetics, 1989, 122(1):19-27.

[21]SUZUKI Y, TOMURA Y. Purification and characterization ofBacilluscoagulansoligo-1,6-glucosidase [J]. European Journal of Biochemistry, 1986, 158(1):77-83.

[22]王永剛. 馬鈴薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因的分子克隆及其在畢赤酵母菌中的表達 [D]. 蘭州：蘭州理工大學, 2010,

[23]李穎, 宋存義, 邱并生, 等. 耐熱糖化酶基因的克隆及其在枯草桿菌中的表達 [J]. 微生物學通報, 2006, 33(5):45-49.

[24]劉海林, 賀麗. 淀粉含量的快速比較測定法 [J]. 技術監(jiān)督縱橫, 2001(6):49-50.

[25]OSLANCOVA A, JANECEK S. Oligo-1,6-glucosidase and neopullulanase enzyme subfamilies from the alpha-amylase family defined by the fifth conserved sequence region [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, 59(11):1 945-1 959.

[26]GUERRA O G, RUBIO I G, DASILVAFILHO C G, et al. A novel system of genetic transformation allows multiple integrations of a desired gene inSaccharomycescerevisiaechromosomes [J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 67(3):437-445.

[27]BAIFLAGFELDT D, SIEWERS V, HUANG L, et al. Characterization of chromosomal integration sites for heterologous gene expression inSaccharomycescerevisiae[J]. Yeast, 2009, 26(10):545-551.

Cloning and expression of oligo-1,6-glucosidase fromAspergillusflavusin industrialSaccharomycescerevisiaeCICC 1346

KANG Xiao-long,LV Xiao-jing, HUANG Qing-mei,XIONG Chun-jiang,LIN Jiang-hai,Xiao Wen-juan,Liu Ze-huan*

(Research Center for Molecular Biology, Institutes of Life and Health Engineering,College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632，China)

The oligo-1,6-glucosidase gene fromAspergillusflavuswas cloned and heterologously expressed in industrialSaccharomycescerevisiaeCICC 1346.Theopen reading frame(ORF)of oligo-1,6-glucosidase gene and the sequence of α-signal ofS.cerevisiaewas splicing by overlap extension (SOE-PCR), and ligated into the integrative expression vector pδRCMB and then was functionally expressed in industryS.cerevisiaeCICC1346.The protein structure of recombinant oligo-1,6-glucosidase was analysised by homology modeling and molecular modeling software Discovery Studio 4.1. We tried to build enzyme activity determination conditions which suit forrecombinant oligo-1,6-glucosidase byp-nitrophenyl-α-D-glucose-pyran-glycosides(pNPG), and then the enzyme characterizations were analysed and purificated. Analysising by DS4.1 and the result showed that the structure of recombinal oligo-1,6-glucosidasedoes not changed. The protein is probably an apparent molecular mass about 70 kDa as judged from mobility in SDS-PAGE gels .The results of enzymatic characterization showed that the temperature and optimal pH for enzyme reaction was pH 6.5 and 40 ℃ respectively, and stability and activity (>90% ) at pH4.5-7.0, stability and activity (>100%) at 30-40 ℃, strongly inhibited by Cu2+and Mn2+. The highest activity for the recombinant oligo-1,6-glucosidase reached 0.69 U/mL. The result of starch-fermentation showed thatthe synergism of recombination oligo-1,6-glucosidase and α-amylase and glucoamylase on hydrolyzing starch for ethanol production, which could improve the efficiency of starch hydrolysis .The heterologous expression of oligo-1,6-glucosidase fromA.flavus，S.cerevisiaein was first reported．

Saccharomycescerevisiae；Aspergillusflavus； splicing by overlap extension-PCR (SOE-PCR)； homology modelling； oligo-1,6-glucosidase; starch

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608008

碩士研究生(劉澤寰研究員為通訊作者，E-mail:zhliu@jnu.edu.cn)。

2015-07-28，改回日期：2016-04-12