薄荷醇麻醉剝離參苗與玻璃海鞘分離的研究

張艷萍, 韓 莎, 李成林, 趙 斌, 胡 煒

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薄荷醇麻醉剝離參苗與玻璃海鞘分離的研究

張艷萍1, 韓 莎2, 李成林2, 趙 斌2, 胡 煒2

(1. 青島農業(yè)大學, 山東青島 266109; 2. 山東省海洋生物研究院, 山東青島 266104)

在刺參苗種工廠化生產期間, 以體積濃度為0.1%~0.5%薄荷醇作為麻醉劑, 通過對玻璃海鞘和不同規(guī)格參苗進行麻醉剝離實驗, 研究參苗與敵害生物——玻璃海鞘分離的效果, 從而達到高效清除玻璃海鞘的目的。結果表明: 薄荷醇溶液對玻璃海鞘無剝離和殺除的作用效果; 大規(guī)格(0.58 g±0.05 g)刺參選用濃度0.4%~0.5%薄荷醇溶液麻醉20 min, 中規(guī)格(0.32 g±0.05 g)刺參選用濃度0.2%~0.5%薄荷醇溶液麻醉20min, 小規(guī)格(0.17 g±0.01 g)刺參選用濃度0.4%~0.5%薄荷醇溶液麻醉10min以及選用濃度0.1%~0.3%薄荷醇溶液麻醉20 min, 抖動脫落率均可達90%以上, 麻醉剝離效果顯著。麻醉剝離后的刺參經1h的恢復即可達到自然狀態(tài), 營正?；顒痈街? 無排臟或化皮等不良應激反應。因此, 采用薄荷醇麻醉剝離參苗可為安全高效清除玻璃海鞘及分苗的生產環(huán)節(jié)提供省工省力、高效便捷的方法。

刺參苗種; 玻璃海鞘; 薄荷醇; 剝離; 麻醉

玻璃海鞘()屬尾索動物亞門, 海鞘綱, 是沿海常見的附著生物, 雌雄同體, 繁殖快,附著率高, 給水產養(yǎng)殖業(yè)和海上設施帶來了危害[1]。在刺參苗種工廠化生產期間, 自6月份開始, 玻璃海鞘會大量繁殖, 并附著在刺參苗種附著基上, 不僅與刺參爭奪生活空間和餌料, 而且會大量消耗溶解氧, 同時還會向水中排泄大量代謝物, 從而抑制刺參的生長[2], 不同程度影響到刺參苗種培育的產量和質量, 是育苗系統(tǒng)中最為常見且危害較大的敵害生物。

多年來, 在刺參苗種工廠化生產過程中, 尚無有效控制和清除玻璃海鞘種群大量發(fā)生的方法, 通常只能通過勤倒池和更換附著基來減輕玻璃海鞘的大量繁生, 不僅勞動強度大、效率低, 而且對玻璃海鞘的清除極不徹底, 同時還會不同程度的傷及刺參苗種。目前, 國內已開展了玻璃海鞘生殖生物學[3-4]、代謝[1, 5]的相關研究, 而有關對玻璃海鞘防控及清除技術的研究仍然很少, 且多集中在尋找適宜的殺除藥物方面[6-7], 應用于生產中的殺除效果不甚理想。為有效控制刺參育苗期玻璃海鞘的生長和繁殖, 需要在玻璃海鞘附著期及時將其從室內育苗池中清除, 或按時將其從附著基上清除。因此, 在實際生產中亟需一種勞動強度低、安全高效地清除玻璃海鞘的方法。薄荷醇作為水產麻醉劑已應用在多毛類[8]、雙殼類[9]及腔腸類[10], 近年來應用在海參類中的研究也已陸續(xù)開展[11-13]。本研究選用薄荷醇為麻醉劑, 通過對玻璃海鞘和參苗的麻醉剝離實驗, 探索不同規(guī)格參苗適宜的麻醉剝離濃度和時間, 以期達到安全高效、快速便捷清除玻璃海鞘的目的, 為刺參苗期玻璃海鞘的清除提供有效的技術方法和參考數據。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用玻璃海鞘和刺參苗種來自山東省海洋生物研究院鰲山種質資源研究中心實驗室, 在育苗池中隨機抽取玻璃海鞘附著密度為280~450個/m2的波紋板筐參苗附著基, 放入60L的整理箱中進行暫養(yǎng)。所用刺參苗選取表觀正常、肉刺堅挺、健康活力強的個體, 按平均體重(L)0.58 g±0.05g、(M)0.32 g± 0.05g、(S)0.17 g±0.01g分為大中小三個規(guī)格, 分別暫養(yǎng)于2 m3的玻璃鋼槽中。每天15: 00按參苗體重的3%~6%投喂配合飼料, 投飼后停止充氣1 h, 日換水2/3, 3d全量換水一次, 并清除殘餌和糞便。實驗海水為經過沙濾的自然海水, 水溫19.4℃±0.8℃, 鹽度30.6~31.8, pH8.1±0.2, DO>5.6mg/L。

1.2 麻醉劑配制方法

將薄荷醇晶體0.56 g溶解于99%的無水乙醇100 mL中配制成母液, 在每升海水水體中按體積百分比分別加入相應體積的母液配制成體積濃度的麻醉液。

1.3 方法

1.3.1 麻醉剝離及恢復實驗

參苗的麻醉剝離及恢復實驗均在60 L整理箱中進行, 在每個整理箱中放入附有玻璃海鞘的波紋板筐, 并按大中小3個規(guī)格, 在每個整理箱中分別放入30頭參苗, 參苗經48h適應、營正常附著后進行實驗。薄荷醇濃度設置為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%, 每一個濃度組設兩個平行。實驗按不同浸泡時間段分為六組, 浸泡時間分別為10、20、30、40、50和60 min, 在實驗過程中, 觀察玻璃海鞘的脫落情況以及參苗體表及肉刺的變化情況, 實驗浸泡時間結束后記錄自動脫落的參苗數, 然后提筐輕輕抖動附著基10 s, 統(tǒng)計抖動后脫落的玻璃海鞘數、參苗數和麻醉的參苗數, 最后將附著基及脫落的參苗轉移到新鮮的海水中, 觀察并統(tǒng)計刺參恢復和活動情況。

脫落率、麻醉率和附著率按下式計算:

脫落率(%)=實驗中從附著基上脫落的參苗總數/實驗參苗總數×100%

麻醉率(%)=實驗中麻醉的參苗總數/實驗參苗總數×100%

附著率(%)=實驗中復蘇附著的參苗總數/實驗參苗總數×100%

1.3.2 結果判定

參苗脫落和麻醉狀態(tài)判別標準: 經薄荷醇溶液浸泡后, 脫離附著基并掉落于整理箱底部即可確認為脫落; 當用玻璃棒刺激時無收縮反應并保持靜止即可確認為達到麻醉狀態(tài)。

參苗復蘇狀態(tài)判別標準: 初步復蘇時活力較弱, 在整理箱底部不運動, 經外界刺激時有收縮反應, 附著力較弱; 完全復蘇時活力正常, 附著于附著基或者容器壁上, 呈自由活動爬行狀態(tài), 附著力較強。

2 結果

2.1 薄荷醇對玻璃海鞘的作用

正常情況下, 玻璃海鞘的水孔呈現有規(guī)律地進行開閉。實驗發(fā)現, 在濃度0.5%的薄荷醇溶液中, 部分玻璃海鞘的水孔有收縮的跡象, 開閉合節(jié)奏與正常情況下不同, 說明薄荷醇溶液對玻璃海鞘有一定的麻醉刺激作用。在所有實驗組中, 隨著麻醉浸泡時間的延長, 玻璃海鞘沒有出現脫落及死亡的現象, 對人為刺激仍有較敏感反應。由實驗可以得出, 在濃度0.1%~0.5%范圍內, 薄荷醇溶液對玻璃海鞘無脫落和殺除的作用效果。

2.2 薄荷醇對不同規(guī)格參苗麻醉剝離的效果及復蘇的影響

3種不同規(guī)格參苗在不同濃度薄荷醇溶液中的麻醉剝離效果及恢復情況, 如表1、表2、表3所示。

表1 薄荷醇對小規(guī)格參苗的麻醉剝離和復蘇附著情況

表2 薄荷醇對中規(guī)格參苗的麻醉剝離和復蘇附著情況

表3 薄荷醇溶液對大規(guī)格參苗的麻醉剝離和復蘇附著情況

實驗參苗在薄荷醇溶液中隨浸泡時間的延長, 管足的附著力逐漸降低, 當粘附不牢時便自動脫落, 參苗的自動脫落率較低, 抖動后脫落率顯著提高。從總體趨勢來看, 參苗的脫落率隨薄荷醇濃度的增大和浸泡時間的延長而增加。不同規(guī)格參苗剝離效率有較大差別, 參苗的自動脫落率隨規(guī)格的增大而增大, 大規(guī)格參苗的自動脫落率顯著高于中小規(guī)格, 而抖動脫落率的趨勢則相反, 在薄荷醇溶液中浸泡20 min后, 抖動脫落率隨規(guī)格的減小而增大。浸泡20 min時, 在0.1%~0.5%的薄荷醇溶液中的小規(guī)格參苗經抖動后, 90%以上脫落, 在0.2%~0.5%的薄荷醇溶液中的中規(guī)格參苗抖動脫落率也可達90%以上, 而大規(guī)格參苗要達到相同的剝離效率, 則需要較高的濃度, 在濃度0.4%~0.5%時, 浸泡20 min時抖動脫落率可達93.3%以上。其中, 濃度0.5%的薄荷醇溶液剝離效果最好, 抖動脫落率達100%時需時分別為大規(guī)格參苗30 min、中規(guī)格參苗20 min、小規(guī)格參苗10 min; 0.1%濃度的薄荷醇溶液對大規(guī)格參苗麻醉剝離效果最差, 麻醉40~50 min的抖動脫落率僅40%。

參苗的麻醉率隨薄荷醇濃度的增大和浸泡時間的延長而增加, 大規(guī)格參苗麻醉率低于自動脫落率, 中小規(guī)格的麻醉率高于自動脫落率。同等條件下, 規(guī)格越大的參苗麻醉率越低, 復蘇也越快。在濃度0.1%~0.5%的薄荷醇溶液中, 隨著浸泡時間的增加, 參苗復蘇后的附著率逐漸下降, 規(guī)格越小附著率越低, 附著率達100%所需的時間也越長。當浸泡30 min時, 在濃度0.1%~0.5%時, 大規(guī)格參苗恢復1 h的附著率均可達100%; 在濃度0.1%~0.4%時, 中規(guī)格參苗恢復1 h的附著率可達100%, 而在濃度0.5%時需恢復2 h附著率才達100%; 在濃度0.1%~0.2%時, 小規(guī)格參苗恢復1 h時的附著率可達100%, 而在濃度0.3%~0.5%時需恢復2 h附著率才達100%。當浸泡60 min時, 大規(guī)格參苗恢復1 h后, 除在濃度0.5%的附著率為88.3%外, 附著率均可達100%; 在濃度0.1%~0.2%時, 中規(guī)格參苗恢復2 h附著率可達100%,而在濃度0.3%~0.5%時需恢復3h附著率才達100%; 在濃度0.4%~0.5%時, 小規(guī)格參苗恢復3h附著率達95%以上。在麻醉剝離及恢復過程中參苗生理狀態(tài)均正常, 沒有出現諸如化皮、排臟等異?，F象的過度應激反應, 表明在濃度0.1%~0.5%范圍內, 薄荷醇麻醉剝離刺參苗種是安全有效的。

實驗結果表明: 濃度0.4%~0.5%的薄荷醇對大規(guī)格參苗的剝離效果較好, 麻醉20 min的抖動脫落率可達93.3%以上; 濃度0.2%~0.5%的薄荷醇溶液對中規(guī)格的剝離效果較好, 麻醉20 min的抖動脫落率可達90%以上; 濃度0.1%~0.5%的薄荷醇溶液對小規(guī)格的剝離效果均較好, 濃度0.4%~0.5%的薄荷醇溶液麻醉10 min, 或濃度0.1%~0.3%的薄荷醇溶液麻醉20min, 抖動脫落率均可達90%以上, 麻醉剝離的參苗經過1h的恢復后附著率均可達100%。

3 討論

3.1 刺參苗期敵害生物——玻璃海鞘的清除

玻璃海鞘是刺參生產過程中極為常見的主要敵害生物, 目前尚無有效控制其種群大量發(fā)生的方法, 一直是困擾刺參室內育苗及養(yǎng)殖的難題。在無脊椎動物生活史中, 常出現2個不同的發(fā)育階段: 一為浮游生活階段, 二為固著生活階段[14]。玻璃海鞘的幼蟲浮游期較短, 在刺參苗種培育過程中, 可通過加大換水量、換水時對海水進行過濾等方法來預防玻璃海鞘的附著。長期以來, 應對玻璃海鞘大量滋生僅能通過人工清除或化學藥物殺除的方法, 既費時費力又增加了生產成本, 同時對參苗和海水水質也均有不同程度影響和危害。王印庚等研究的利用中草藥組合殺除玻璃海鞘的方法低毒、無害, 通過每天藥浴24 h后換水、連續(xù)3 d后倒池、7 d后更換附著基[7], 可達到良好的殺除玻璃海鞘效果。但是, 與其他或傳統(tǒng)清除玻璃海鞘的方式不同的是, 本實驗采用薄荷醇對參苗進行麻醉使之脫離附著基, 而玻璃海鞘可能由于體外套有一層類似植物纖維素的被囊的原因, 在薄荷醇作用下無應激和脫落的現象發(fā)生, 從而達到參苗與玻璃海鞘分離的效果。此種方法極大提高了清除效率和清除效果, 勞動強度小且對刺參無任何毒副作用, 為安全高效的清除玻璃海鞘提供了新的思路和途徑。

3.2 薄荷醇麻醉剝離刺參脫離附著基的效果

海洋無脊椎動物與外部表面的附著主要分為兩類: 一是分泌黏物質使身體固定在附著基上; 二是靠身體的運動器官, 使身體固定在附著基上, 這類動物用器官的變化和分泌的黏液來移動換位, 如刺參靠管足和觸手粘附于基質上[15], 可以用物質刺激其運動器官使其脫離附著基, 當刺參的附著力無法抵消重力時刺參便脫落。據研究報道, 酒精[15]、鹽度[15]、氯化鉀[16]等均有刺激刺參收縮而脫落的作用, 但這些物質對刺參刺激性較大, 易引起刺參身體收縮、體表棘刺及口收入體內, 更有甚者引起刺參排臟或皮膚受損而化皮。韓莎等[11]研究表明, 在薄荷醇溶液濃度小于4%時對仿刺參麻醉安全有效, 刺參不僅能夠較快地達到麻醉狀態(tài), 且能在短時間內復蘇達到良好的自然狀態(tài), 能夠正常攝食并保持較好的活力, 無化皮或排臟等不良現象。在麻醉剝離參苗脫離附著基與玻璃海鞘分離的實驗中發(fā)現, 參苗在麻醉后管足伸展呈直立狀態(tài), 附著力逐漸下降, 在重力作用下自動脫落或者輕微抖動便可脫落, 剝離效果較佳, 不僅剝離效率高, 而且剝離后可以迅速恢復正?；顒雍透街?。

不同規(guī)格參苗的剝離效率有較大的差異, 自動脫落率與參苗的體重和麻醉程度均相關。大規(guī)格參苗因自身體重較大, 自動脫落率明顯高于中小規(guī)格。但同等情況下, 薄荷醇對中小規(guī)格麻醉程度高于大規(guī)格, 因此中小規(guī)格的抖動脫落率要高于大規(guī)格。實驗中還發(fā)現, 在一定的薄荷醇濃度下, 隨浸泡時間的增加抖動脫落率增加不顯著, 但麻醉率顯著增加。在麻醉剝離過程中, 提高效率與降低對苗種的損傷無疑都是非常重要的, 單一麻醉處理不能使刺參完全自動脫落。因此, 適當地輔助一定程度的手工操作, 如選用抖動附著基的方式, 不僅能夠大大提高參苗的剝離效率, 同時還可以避免參苗受過度麻醉的影響, 對參苗的迅速恢復是非常必要的。綜合不同規(guī)格苗種的抖動脫落效果及恢復情況考慮, 可以得出: 大規(guī)格刺參選用濃度為0.4%~0.5%的薄荷醇溶液、中規(guī)格刺參選用濃度為0.2%~0.5%薄荷醇溶液麻醉剝離20 min, 小規(guī)格刺參選用濃度為0.4%~0.5%薄荷醇溶液麻醉剝離10 min, 或選用濃度0.1%~ 0.3%薄荷醇溶液剝離20 min的剝離效果較佳, 抖動脫落率均可達90%以上甚至100%, 麻醉剝離后刺參經1 h即可完全恢復到自然狀態(tài), 營正?；顒?、附著與攝食。

據研究, 薄荷醇在水溫高時作用效果更好[13]。因此, 在刺參苗種生產中應根據不同水溫環(huán)境, 適當調節(jié)麻醉劑的使用劑量和作用時間, 建立清除玻璃海鞘的技術工藝, 為有效清除玻璃海鞘和工廠化刺參苗種安全生產提供可靠的技術方法。同時, 針對玻璃海鞘的不同發(fā)育階段, 探求其適宜的清除方法, 諸如在浮游期, 通過電滅卵裝置進行海水處理的方式, 在固著期, 通過查找抑制玻璃海鞘生長的生物來控制玻璃海鞘的生長和繁殖等等, 有待于今后進一步實驗研究。

此外, 在刺參育苗生產中, 不同規(guī)格的刺參要定期進行分級培育, 不同規(guī)格苗種的篩選, 剝離作業(yè)必不可少, 傳統(tǒng)分苗方式不僅損傷參苗, 而且分苗后通常會施用化學藥物來避免刺參的病害發(fā)生和應激反應。因此, 為減輕在分苗環(huán)節(jié)中的勞動強度, 提高分苗效率并降低或避免對參苗的損傷, 采用薄荷醇麻醉剝離使其脫離附著基不失為一種行之有效的方法。

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Detaching effect of menthol on the attachment of sea cucumber (Apostichopus japonicus) apart from sea squirt (Ciona intestinalis)

ZHANG Yan-ping1, HAN Sha2, LI Cheng-lin2, ZHAO Bin2, HU Wei2

(1. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, China)Received：Nov. 11, 2015

seeding;; menthol; detach; anesthetization

This study aims to develop an efficient method for removing sea squirtfrom the sea cucumber nursery system. The detaching effects of menthol (0.1%~0.5% in volume) on the attachment of sea squirtand different-sized sea cucumber () were tested. The results showed that menthol was ineffective in killing or detachingfrom the attachment. The detaching effect of menthol on different-sized sea cucumbers significantly differed. Over 90% of detachment shaking from settlement substrate was found in the large-sized (0.58 g ± 0.05 g) juveniles exposed to 0.4%~0.5% of menthol for 20 min, medium-sized (0.32 g ± 0.05 g) juveniles exposed to 0.2%~0.5% of menthol for 20 min, and small-sized (0.17 g ± 0.01g) exposed to 0.4%~0.5% of menthol for 10 min or exposed to 0.1%~0.3% of menthol for 20 min. These juveniles, after being detached from the attachment, recovered to reattach after 1 h without ulceration and evisceration. Therefore, this method is highly effective and requires minimum effort, which is desired when removing sea squirt or seed grading from a sea cucumber nursery system.

S917.4

A

1000-3096(2016)07-0083-08

10.11759/hykx20160412001

2015-11-11;

2016-05-22

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系刺參產業(yè)創(chuàng)新團隊建設項目(SDAIT-22-01、SDAIT-22-05); 山東省農業(yè)良種工程項目(2014-2016); 山東省自然科學基金項目(ZR2014CQ056); 國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項經費項目(201305001-4); 山東省農業(yè)科技成果轉化資金項目(2014-2016)

[Foundation: Sea cucumber Innovation Team of Shandong Province Agriculture Research System, No.SDAIT-22-01, SDAIT-22-05; Agriculture Seed Project of Shandong Province; Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2014CQ056; Oceanic Research Special Funds for Public Welfare Projects of State Oceanic Administration, No. 201305001-4; Agricultural Science and Technology Achievement Transformation Program of Shandong Province, No. 2014-2016]

張艷萍(1980-), 女, 山東臨沂人, 實驗師, 主要從事細胞與分子生物學和生理學研究, E-mail: yanpingzh@163.com

(本文編輯: 梁德海)