基于線粒體控制區(qū)部分序列的南海大斑石鱸遺傳多樣性分析

郜星晨, 章 群, 薛 丹, 宮亞運, 曹 艷, 韓博平

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基于線粒體控制區(qū)部分序列的南海大斑石鱸遺傳多樣性分析

郜星晨1, 2, 章 群1, 薛 丹1, 宮亞運1, 曹 艷1, 韓博平1

(1. 暨南大學(xué)生態(tài)系, 熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心, 廣州 510632; 2. 中國長江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所, 湖北宜昌443100)

為了研究南海大斑石鱸()不同地理群體的遺傳多樣性情況, 作者測定了東興、烏石、潭門、閘坡4個群體共計61尾大斑石鱸控制區(qū)的993 bp序列。檢測出變異位點35個, 單倍型47種, 平均單倍型多樣性指數(shù)為0.9884, 核苷酸多樣性指數(shù)為0.0076, 總體表現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點, 其中潭門群體核苷酸多樣性相對較高(0.00879)。中性檢驗結(jié)果顯示Fu’s Fs值均為顯著負(fù)值–5.34(=0.03), 核苷酸不配對分布沒有顯著偏離群體擴(kuò)張模型呈現(xiàn)出單峰(SSD值和Rg指數(shù)較小), 表明大斑石鱸在歷史上經(jīng)歷過種群擴(kuò)張, 推測擴(kuò)張時間約4.74萬~1.18萬年間。群體間(0.0065~0.0089)與群體內(nèi)遺傳距離(0.0066~0.0089)處于同一水平, 總遺傳分化指數(shù)Fst為–0.0057 (>0.05), 群體間基因流Nm=33.76。不同組群劃分方式的分子方差分析均表明群體內(nèi)遺傳差異顯著大于群體間, 遺傳變異主要來源于群體內(nèi)部。南海海域大斑石鱸群體遺傳多樣性匱乏, 群體間不存在顯著的遺傳分化, 可劃歸一個管理保護(hù)單元, 潭門群體建議優(yōu)先給予保護(hù)。

大斑石鱸(); 控制區(qū); 遺傳多樣性

大斑石鱸()隸屬鱸形目(Perciformes)、石鱸科(Pomadasyidae)、石鱸屬(), 俗名猴鱸、海猴, 廣泛分布于印度洋和太平洋西部, 在中國分布于南海和東海近海, 主要漁場為北部灣沿岸及潿洲島附近。大斑石鱸為暖水性中下層中小型魚類, 肉質(zhì)鮮美, 生長較快, 有一定經(jīng)濟(jì)價值[1]。近年來由于北部灣海區(qū)一直處于過度捕撈狀態(tài), 魚類資源持續(xù)衰退, 自然海區(qū)大斑石鱸魚類數(shù)量減少, 分布區(qū)域也大為縮小[2]。目前大斑石鱸研究僅局限于形態(tài)、分類和分布, 分子遺傳學(xué)方面僅在石鱸科系統(tǒng)發(fā)育研究中有所涉及, 如朱世華[2]等探討了大斑石鱸及其他4種石鱸科魚類親緣關(guān)系; 梁日深[3]等基于S7核糖體蛋白基因序列分析了大斑石鱸在內(nèi)11種石鱸屬魚類分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系; 任崗[4]等選用16S rRNA基因研究石鱸科魚類種間關(guān)系, 尚未見到大斑石鱸遺傳多樣性及種質(zhì)資源方面研究報道。

遺傳多樣性是生物進(jìn)化和適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ), 是種質(zhì)資源有效保護(hù)和合理利用的依據(jù)[5]。線粒體DNA(mtDNA)具有分子結(jié)構(gòu)簡單, 嚴(yán)格的母系遺傳、無重組和進(jìn)化速度快等優(yōu)點, 是群體遺傳學(xué)研究的理想分子標(biāo)記[2]。mtDNA中存在一個非編碼區(qū), 即控制區(qū), 是整個線粒體DNA序列中變異最大的區(qū)域, 能夠敏感的反應(yīng)出海洋魚類的群體遺傳結(jié)構(gòu), 在魚類分類、系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳學(xué)等方面已有廣泛的應(yīng)用[5]。本研究通過測定南海4個海域大斑石鱸mtDNA控制區(qū)序列, 探討其遺傳多樣性和遺傳分化情況, 分析其種群遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動態(tài), 旨在促進(jìn)大斑石鱸有效開發(fā)和可持續(xù)管理, 為種質(zhì)資源的保護(hù)積累基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、DNA提取與PCR擴(kuò)增測序

2011年~2014年于廣東閘坡(ZP)、廣東烏石(WS)、海南潭門(TM)和廣西東興(DX)分別采集大斑石鱸(圖1), 測得叉長范圍9~22 cm, 體質(zhì)量250~ 400 g。樣品用95%的酒精固定后保存, 采用高鹽法提取總基因組DNA[6]。采用自行設(shè)計的引物DL1 (5′-GTT GGA ATC CTC CCT ACT GCTC-3′), DL2 (5′-TCT TAA CCA CCC TTT ACG CCGA-3′)進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件與檢測參照任崗等[4]的方法, PCR產(chǎn)物送至北京六和華大基因有限公司切膠純化并測序。

1.2 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 6軟件上對手工校對后的測定序列進(jìn)行對位排列, 統(tǒng)計序列的堿基組成、變異位點、多態(tài)簡約信息位點、轉(zhuǎn)換或顛換比值等, 根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter, K2P), 計算遺傳距離。使用Dnasp 5.10計算群體的單倍型數(shù)、核苷酸酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd), 分析群體間遺傳變異指數(shù)(), 1000次重復(fù)隨機(jī)抽樣重排后進(jìn)行顯著性檢驗, 群體間的基因流值()=(1–)/(2), 通過分子方差(AMOVA)分析檢驗遺傳變異分布模式[7]。借助TCS 2.1構(gòu)建單倍型簡約網(wǎng)絡(luò)圖, 分析單倍型分布情況。以Arlequin 3.5軟件進(jìn)行Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗分析, 并通過核苷酸不配對分布分析檢驗種群歷史動態(tài); 采用廣義非線性最小方差估算擴(kuò)張參數(shù), 根據(jù)=2估算群體歷史擴(kuò)張時間, 其中=2(為所研究的控制區(qū)基因的變異速率,表示片段長度),為自擴(kuò)張以來經(jīng)歷的代數(shù)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大斑石鱸的控制區(qū)基因序列特征

序列比對分析后獲得控制區(qū)前段序列993 bp, A、T、C、G組成的平均值分別是30.7%、29.0%、24.3%、16.0%。A+T平均含量59.6%, G+C平均含量40.4%, 表現(xiàn)出明顯的反G偏倚, 與脊椎動物線粒體DNA的特點一致。全部序列共有變異位點35個(占DNA核苷酸總數(shù)的3.5%), 簡約信息位點30個。轉(zhuǎn)換與顛換比例為17.6, 遠(yuǎn)大于劉朋朋等[5]提出的期望值0.5, 表明此片段沒有飽和, 適合系統(tǒng)發(fā)育分析。大斑石鱸遺傳多樣性參數(shù)見表1。其中潭門群體核苷酸多態(tài)性指數(shù)最高, 烏石群體單倍型多樣性和核苷酸多態(tài)性均最低。

表1 不同群體大斑石鱸的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 大斑石鱸的系統(tǒng)發(fā)育與遺傳分化

在以K2P模型構(gòu)建的單倍型鄰接樹和單倍型TCS最大簡約網(wǎng)絡(luò)中(圖2)不同來源的單倍型散亂無序分布于各個分支, 不呈現(xiàn)地方群體為單位的家系式分支現(xiàn)象, 沒有明顯的地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)[8]。47個單倍型中, 39個為獨享單倍型, 僅有4個單倍型為2個以上個體共享, 顯示大部分單倍型頻率較低。

群體間平均遺傳距離為0.0077(0.0065~0.0085), 群體內(nèi)遺傳距離0.0066~0.0089, 二者處于同一水平。群體之間的遺傳變異指數(shù)值為–0.022~0.003, 總遺傳變異指數(shù)值為–0.0057, 均未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)顯著性。4個群體基因流值均大于4, 平均基因流值為33.76, 群體間存在較大基因流。通過設(shè)定兩種AMOVA分析檢測大斑石鱸的群體遺傳結(jié)構(gòu): (1)將南海4個群體劃分為一個組群以檢驗群體間是否存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu); (2)按樣品的來源將4個群體劃分為2群組檢驗是否存在顯著地理結(jié)構(gòu): 將瓊州海峽東側(cè)潭門、閘坡為一地理區(qū), 華南大陸沿海西部烏石、東興為另一地理區(qū); 將瓊州海峽南部潭門為一地理區(qū), 北部烏石、東興、閘坡為另一地理區(qū)[7]。兩種AMOVA分析顯示, 4個群體間(=0.659)及不同地理區(qū)劃分方式(=0.559)均不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu), 遺傳變異主要集中在群體內(nèi)個體間(99.08%~100.65%), 只有–0.16%~ 0.01%發(fā)生在群體間。

2.3 種群歷史動態(tài)

Tajima’s D和Fu’s Fs檢驗結(jié)果表明(表2), 分別對4個地理群體及群體整體進(jìn)行中性分析, 不同群體Tajima’s D多為負(fù)值, 整體Tajima’s D= –0.23 (>0.1), 統(tǒng)計學(xué)檢驗不顯著; 4個群體Fu’s Fs中性檢驗均為顯著性負(fù)值, 整體Fu’s Fs值為–5.34且顯著(=0.03), 明顯偏離中性突變。由于在相同條件下, Fu’s Fs檢驗對種群近期擴(kuò)張事件比較敏感, 故可判斷大斑石鱸近期可能經(jīng)歷了快速種群擴(kuò)張[5]。南海大斑石鱸各個地理群體和整體核苷酸岐點分布呈單峰(圖3); 對核苷酸不配對的觀測分布和擴(kuò)張模式下的預(yù)期分布一致性進(jìn)行擬合優(yōu)度檢驗顯示群體平均方差之和(SSD)和平滑性檢驗統(tǒng)計值(Raggedness)均較小, 統(tǒng)計檢驗均不顯著, 證實了所觀測的核苷酸錯配分布與群體擴(kuò)張模式相符[8], 表明4個群體歷史上發(fā)生了不同程度的種群擴(kuò)張。θ1/θ0表明有效群體大小在擴(kuò)張前后發(fā)生很大變化[8], 也提示南海大斑石鱸發(fā)生快速擴(kuò)張, 核苷酸不配對分析與中性進(jìn)化檢驗結(jié)果基本一致。根據(jù)核苷酸錯配分析總的τ觀察值3.76, 以生殖周期為3 年計, (3%~10%)/百萬年的控制區(qū)分歧速率, 估算擴(kuò)張時間約為4.74萬年~1.18萬年, 處于末次冰期期間。

表2 南海近海4個大斑石鱸群體的中性檢驗和錯配分布參數(shù)

注: *. 統(tǒng)計顯著水平(<0.05), **. 統(tǒng)計極顯著水平(<0.01)

3 討論

3.1 大斑石鱸的種群動態(tài)與遺傳多樣性

大斑石鱸總體表現(xiàn)出高Hd低Pi的特點, 中性檢驗Fu’s Fs為顯著負(fù)值, 核苷酸不配對分布為單峰, 表明在末次冰盛期后期(4.74萬年~1.18萬年)經(jīng)歷了種群擴(kuò)張。大斑石鱸為近岸繁殖的暖水性魚類, 棲息在20~110 m的底質(zhì)海區(qū)[1]。在末次冰盛期南海海平面比現(xiàn)在低130~150 m[9], 隨著間冰期氣溫回升海平面不斷上升, 生存空間擴(kuò)大到整個南海大陸架區(qū), 大斑石鱸得以快速擴(kuò)張。大斑石鱸繁殖周期長(可從1月長達(dá)4月份)、產(chǎn)卵場較集中(多在南海北部)等特點[1], 可能利于群體快速增長, 產(chǎn)生高的單倍型多樣性, 但尚缺乏足夠時間積累核苷酸序列的多樣化。類似的高Hd低Pi遺傳多樣性模式在同海域分布的軍曹魚()[9]、花鱸()[10]等魚類研究中也被檢測到。

群體mtDNA的Pi值是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo), Pi值越大表示群體mtDNA多態(tài)程度越高[9]。南海大斑石鱸Hd和Pi平均值分別為0.9884±0.0060和0.0076±0.0040, 核苷酸多樣性值較同海域分布魚類如紅鰭笛鯛()[11](Pi=0.031)、黃鰭鯛()[12](Pi=0.026)等低, 較石鱸科其他魚類如斜帶髭鯛()[13](Pi=0.022)、三線磯鱸()[14](Pi=0.0058)等也處于中等偏下水平。海洋魚類遺傳多樣性水平受多種因素如有效種群大小、群體擴(kuò)張等影響, 也與自身棲息地環(huán)境相關(guān)。大斑石鱸經(jīng)歷過近期種群擴(kuò)張或“遺傳瓶頸”, 群體尚缺乏足夠時間在遷移和漂變之間取得平衡, 導(dǎo)致遺傳多樣性較為匱乏[9]。另外該海域環(huán)境污染、過度捕撈等人為因素也可能導(dǎo)致資源的衰退和有效種群的減少, 影響大斑石鱸遺傳多樣性水平。

3.2 大斑石鱸的遺傳分化

TCS網(wǎng)絡(luò)圖中不同來源個體混雜分布, 無明顯地理結(jié)構(gòu)?；跇悠穪碓吹牡乩砀窬? 假設(shè)華南沿海與海南島種群關(guān)系較遠(yuǎn), 但AMOVA分析顯示群體內(nèi)個體的變異是變異的主要來源, 不同地理區(qū)群體間差異不顯著, 說明瓊州海峽并未起到有效的地理屏障作用。在缺少阻礙擴(kuò)散的開放海洋環(huán)境里, 大斑石鱸的卵、幼體及成體都具有較強(qiáng)的遷移能力, 以致分化水平較低, 群體沒有地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)[14]。遺傳分化也與生態(tài)習(xí)性及生活史密切相關(guān), 大斑石鱸春季繁殖期會洄游向近岸或者河口, 洄游過程中不同群體間個體的混合可能導(dǎo)致群體間產(chǎn)生基因交流。此外, 南海沿海季風(fēng)漂流、黑潮分支、南海暖流、南海冷水等海流的輸送作用加強(qiáng)了大斑石鱸卵和幼體的擴(kuò)散, 也是遺傳分化程度較低的推動原因。

3.3 種質(zhì)資源的保護(hù)

物種的生存適應(yīng)能力、進(jìn)化潛力與遺傳多樣性密切相關(guān), 遺傳多樣性的降低可導(dǎo)致物種生存抵抗力與生殖力下降、物種退化等[13], 因此遺傳多樣性受到極大威脅的大斑石鱸野生群體應(yīng)得到足夠保護(hù)。本研究4個南海地理群體無明顯的遺傳差異, 可劃歸同一個保護(hù)單元, 潭門群體野生資源較多, 遺傳多樣性水平相對較高, 建議優(yōu)先加以保護(hù)。本研究涉及的地理群體量和種群數(shù)量有限, 同時控制區(qū)單一標(biāo)記, 可能還不足以準(zhǔn)確反映大斑石鱸的遺傳結(jié)構(gòu)。為了更好地保護(hù)大斑石鱸種質(zhì)資源, 今后的研究中應(yīng)增加采樣地點和樣品量, 并采取多種分子標(biāo)記分析大斑石鱸遺傳變異, 以期為制定科學(xué)管理保護(hù)措施提供理論依據(jù)。

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Genetic diversity ofin coastal waters of South China Sea via mtDNA control region partial sequences

GAO Xing-chen1, 2, ZHANG Qun1, XUE Dan1, GONG Ya-yun1, CAO Yan1, HAN Bo-ping1

(1. Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering, Ministry of Education, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Chinese Sturgeon Research Institute, China Three Gorges Corporation, Yichang 443100, China)Received：Nov. 18, 2014

; control region; genetic diversity

This study determined 993bp mtDNA control region sequences of 61 individuals collected in Dongxing, Wushi, Tanmen, and Zhapo where 35 variable sites defined 47 haplotypes. Global haplotype (Hd) and nucleotide diversity (Pi) were 0.9884 and 0.0076, respectively thus indicating a pattern of high haplotype diversity and low nucleotide diversity. A combination of the significant negative neutral test values of Fu’s Fs (?5.34,= 0.03), the mismatch distribution pattern, and the network analysis revealed that a historical population expansion occurred at about 47400–11800 years ago. The genetic distance between populations (0.0065–0.0089) was at a similar level to the genetic distance within populations (0.0066–0.0089); the overall genetic differentiation index (Fst) was ?0.0057 (> 0.05), the gene flow coefficient (Nm) among four populations was 33.76, and the analysis of molecular variance showed that most of the genetic variations of the four populations was distributed throughout the populations. In addition, genetic diversity was low and genetic divergence was inconspicuous between populations of. It is thus suggested thatin the coastal waters of the South Sea should be maintained as a single management unit and that the Tanmen population within contains arelatively high genetic diversity and should thus be a priority for protection.

Q958

A

1000-3096(2016)07-0041-05

10.11759//hykx20141118001

2014-11-18;

2015-03-27;

國家自然科學(xué)基金項目(41071034); 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(21613105, 21611426)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41071034; Fundamental Scientific Research Funds for the Central Universities No. 21613105, 21611426]

郜星晨(1989-), 男, 安徽淮北人, 碩士研究生, 主要從事魚類生態(tài)學(xué)研究, 電話: 15625163028, E-mail: 13039829682@126.com;章群,通信作者, E-mail: zhangqunjnu@gmail.com

(本文編輯: 譚雪靜)