全血γ干擾素釋放試驗診斷結核病的臨床應用價值

孔海芳，岳娜，劉剛，李妍淳，田彬，胡志東△

全血γ干擾素釋放試驗診斷結核病的臨床應用價值

孔海芳1，岳娜1，劉剛2，李妍淳1，田彬1，胡志東1△

目的評價全血γ干擾素（IFN-γ）釋放試驗（QFT-GIT）診斷結核病的臨床應用價值。方法收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院2014年10月—2015年10月109例（確診病例45例，臨床診斷病例64例）結核病患者（結核組）和70例非結核呼吸系統(tǒng)疾病患者（非結核組）資料，同時采用QFT-GIT、膠體金抗結核抗體（TB-Ab）進行檢測，繪制IFN-γ釋放量受試者工作者特征（ROC）曲線，比較2種方法的診斷價值及QFT-GIT試驗在2組中的差異。結果QFT-GIT對結核病的診斷敏感度為93.58%，特異度為85.71%，其診斷陽性率高于TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）。2種方法聯(lián)合檢測的敏感度降至52.29%（57/109），但特異度增加至90.00%（63/70）。結核組IFN-γ釋放量明顯高于非結核組（U=330，P＜0.05），IFN-γ釋放量ROC曲線下面積為0.913（95%CI：0.864～0.963）。結論QFT-GIT試驗在結核病診斷中具有較高的敏感度和特異度，與TB-Ab聯(lián)合檢測可進一步提高診斷的特異度，為臨床結核病的診斷提供及時有效的依據(jù)。

結核；卡介苗；診斷試驗，常規(guī)；敏感性與特異性；ROC曲線；γ干擾素釋放試驗；結核抗體

結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌感染引起的嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，其造成的死亡人數(shù)僅次于艾滋病，被列為我國重要傳染病之一［1］。2013年全球估計有900萬結核病的新發(fā)病例，有150萬患者死于結核?。?］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，目前我國結核病年發(fā)病人數(shù)為130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，成為全球結核病第二大國［3］。2010年全國結核病流行病學調查顯示，活動性肺結核患病率為0.5%，約有600萬活動性肺結核患者［4］。迄今為止，臨床上用于結核分枝桿菌感染的診斷方法仍存在很多不足，結核分枝桿菌培養(yǎng)時間長，核酸檢測技術要求高，結核菌素試驗（Tuberculin skin testing，TST）易受卡介苗（BCG）的干擾。因此，開發(fā)新的快速診斷技術迫在眉睫。

全血可溶性γ干擾素（IFN-γ）釋放試驗（QuantiFERON TB Gold In-Tube，QFT-GIT）具有操作簡便、檢測自動化等優(yōu)點。本文通過比較QFTGIT試驗在結核與非結核患者中結果的差異，探討QFT-GIT試驗在結核病診斷中的臨床應用價值。

1　對象與方法

1.1研究對象收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院2014年10月—2015年10月住院患者中篩查出的109例結核患者（確診病例45例，臨床診斷病例64例）作為結核組，男53例，女56例，年齡11～99歲，中位年齡60（45，71）歲。參照《肺結核診斷標準（WS288—2008）》，結核分類標準參照《臨床診療指南（結核病分冊）》，包括呼吸系統(tǒng)結核病74例和肺外結核病35例（骨結核、頸淋巴結結核、結核性腦膜炎、結核性胸膜炎、結核性腹膜炎、支氣管結核、泌尿系統(tǒng)結核以及盆腔結核等）。31例結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，21例痰涂片抗酸染色陽性，18例病理學診斷陽性。收集同期住院患者中支氣管肺炎、大葉性肺炎、支氣管擴張以及慢性支氣管炎患者70例作為非結核組，男43例，女27例，年齡2～90歲，中位年齡59（36，80）歲。均根據(jù)臨床癥狀、常規(guī)實驗室檢查、影像學表現(xiàn)以及治療效果等證實，無結核病史和結核接觸史。所有入選患者人類免疫缺陷病毒（HIV）篩查陰性、無急性病毒感染、無免疫抑制劑的應用以及妊娠。

1.2主要試劑和儀器結核分枝桿菌抗體（IgG）檢測試劑盒（MP Biomedicals Asia Pacific）；QFT-GIT試劑盒、Sunrise酶標儀（澳大利亞Cellestis Limited公司）。離心機、振蕩器，37℃恒溫孵育箱及洗板機等，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3研究方法

1.3.1膠體金抗結核抗體（TB-Ab）檢測采集患者肘正中靜脈血3 mL于促凝管中，離心取上清25 μL至加樣孔，待樣本達到指示線時加3滴緩沖液，拉出標簽，再加1滴緩沖液，15 min后觀察結果。

1.3.2QFT-GIT試驗在試驗當天清晨采集患者肘正中靜脈血3～4 mL于肝素鋰抗凝管中，2 h內將混勻的全血分裝至TB特異性抗原測試管、絲裂原陽性對照管以及空白對照管中（1 mL/管）?；靹蚝?7℃恒溫孵育16～24 h，4 000 r/min離心15 min，取上清行酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IFN-γ，采用Sunrise酶標儀進行讀數(shù)。QFT-GIT試驗結果判斷標準：TB抗原測試管-空白對照管≥0.35 IU/mL，且≥25%空白對照管值，判斷為陽性；陽性對照管-空白對照管≥0.50IU/mL，且TB抗原測試管-空白對照管＜0.35 IU/mL，判斷為陰性；陽性對照管-空白對照管＜0.50 IU/mL，且TB抗原測試管-空白對照管＜0.35 IU/mL或空白對照管＞8.00 IU/mL，為不確定結果。結果計算和判定采用澳大利亞Cellestis Limited公司提供的A-QFT軟件（版本2.62）。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，繪圖采用軟件GraphPad prism 5.0。非正態(tài)分布計量資料采用M（P25，P75）表示，組間以及組內IFN-γ釋放量比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用診斷性試驗比較2種方法的診斷價值，并繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1QFT-GIT和TB-Ab試驗在結核病診斷特性中的比較2種方法的檢測結果見表1。QFT-GIT的診斷陽性率高于TB-Ab（2種方法診斷共同陽性64例，共同陰性62例，χ2=43.68，P＜0.01）。2種方法的診斷效能見表2。兩者聯(lián)合診斷時（串聯(lián)）的敏感度降至52.29%（57/109），而特異度增加至90.00%（63/70）。

Tab.1The results of QFT-GIT and TB-Ab in two groups of patients表1　2組患者QFT-GIT與TB-Ab檢測結果（例）

2.22組IFN-γ釋放量比較排除假陽性和假陰性，陽性對照抗原（絲裂原）刺激下2組IFN-γ釋放量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1A。經(jīng)結核特異性抗原刺激下，結核組IFN-γ釋放量高于非結核組（P＜0.01），見圖1B。在結核組中，呼吸系統(tǒng)結核與肺外結核患者IFN-γ釋放量比較，差異無統(tǒng)計學意義［4.08（0.58，7.72）IU/mL vs.4.56（0.69，9.93）IU/mL，U=1 250，P＞0.05］；確診結核組與臨床診斷結核病組比較，差異無統(tǒng)計學意義［4.58（0.78，7.60）IU/mL vs.3.80（0.88，10.00）IU/mL，U=1 122，P＞0.05］。

Fig.1The comparison of the expression quantity of IFN-γ between tuberculosis group and non-tuberculosis group圖1　結核組與非結核組患者IFN-γ表達量的比較

2.3患者IFN-γ釋放量ROC曲線曲線下面積（AUC）為0.913（95%CI：0.864～0.963）。根據(jù)ROC曲線得到的最佳閾值為0.265 IU/mL，此時QFT-GIT的敏感度為82.86%，特異度為96.33%，見圖2。

Fig.2The ROC curve of IFN-γ release quantity圖2　IFN-γ釋放量ROC曲線

3　討論

3.1臨床檢測結核病常用指標現(xiàn)狀結核病的早期診斷和治療對結核病的預后至關重要。目前診斷的金標準仍是細菌學檢查，但由于痰涂片抗酸染色的敏感度低、結核分枝桿菌培養(yǎng)時間長等原因，很難滿足臨床早期診斷的需求。本實驗痰涂片抗酸染色陽性率僅為19.27%（21/109），結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為28.44%（31/109）。TST所使用的抗原是結核菌素純蛋白衍生物（PPD），與BCG、非結核分枝桿菌存在交叉反應［5］，使TST的假陽性率增加，診斷特異度降低。

3.2QFT-GIT試驗的特點QFT-GIT試驗可直接檢測全血中IFN-γ的釋放量，無需分離淋巴細胞，在臨床應用中具有操作簡便、檢測自動化等優(yōu)點。2007年美國食品和藥品管理局（FDA）批準QFTGIT試驗用于診斷結核病感染，美國疾病預防控制中心最新指南中推薦用QFT-GIT代替TST用于結核病的診斷［6］。QFT-GIT試驗使用的抗原是早期分泌靶抗原蛋白-6（ESAT-6）、培養(yǎng)濾液蛋白（CFP-10）以及RD11區(qū)編碼的TB7.7，在BCG和大部分已知的非結核桿菌中普遍缺失，可避免交叉反應［7］，提高檢測的敏感度和特異度，本研究中QFT-GIT試驗檢測結果略高于國外報道［8-9］。有研究表明在與TB患者接觸的健康人中，有10%的QFT-GIT陽性接觸者和0.4%的QFT-GIT陰性接觸者最終發(fā)展成TB，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），證明QFTGIT試驗可作為TB陽性預測指標之一［10］。QFTGIT試驗假陰性結果多見于結核合并免疫缺陷性疾病，包括腫瘤、慢性病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病、慢性腎功能衰竭以及長期服用免疫抑制劑的患者［11-13］。本研究7例假陰性患者中，4例結核分枝桿菌培養(yǎng)和痰涂片抗酸染色陽性，3例僅痰涂片抗酸染色陽性。在7例患者中，4例合并糖尿病，1例合并食管癌，1例合并慢性腎功能不全，但有1例無合并上述疾病，考慮為初次感染，T淋巴細胞無應答狀態(tài)，IFN-γ的分泌量未達到檢測下限［14］。非結核組有10例假陽性患者，經(jīng)查證為肺癌、隱球菌感染性肺炎、低鉀血癥患者，其原因需進一步探究。

3.3QFT-GIT試驗結果在2組中的差異2組標本經(jīng)結核特異性抗原刺激后IFN-γ釋放量差異有統(tǒng)計學意義，而經(jīng)陽性對照抗原（絲裂原）刺激后無差異，避免了免疫功能狀態(tài)差異影響QFT-GIT試驗結果的混雜，從而保證結果的可靠性。IFN-γ釋放量ROC曲線的最佳閾值為0.265 IU/mL，此時QFTGIT的敏感度為82.86%，特異度為96.33%。因此，QFT-GIT試驗診斷結核病有較高的可靠性。QFTGIT試驗診斷結核病的敏感度、準確度顯著高于TB-Ab，兩試驗聯(lián)合診斷的敏感度降至52.29%，而特異度增加至90.00%。特異度的增加可以有效地降低假陽性率，支氣管擴張、肺炎等較結核病的預后好，如將其誤診為結核病，在進行抗結核治療過程中會給患者帶來巨大的傷害。因此，提高結核病診斷的特異度比敏感度更重要。

3.2QFT-GIT試驗的優(yōu)勢QFT-GIT試驗雖不能區(qū)分肺內結核病與肺外結核病，但可以用于結核病與其他呼吸系統(tǒng)疾病的鑒別診斷，且不受BCG的干擾，具有較高的敏感度和特異度，可用于臨床結核病的診斷。QFT-GIT試驗與國外常用的T-SPOT·TB方法相比，具有操作簡便、快速，技術要求低，客觀性強，自動化程度高等優(yōu)點，可在醫(yī)院推廣使用，具有較高的臨床應用價值。

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（2016-05-10收稿2016-06-20修回）

（本文編輯李鵬）

The diagnosis value of the whole blood interferon-γ release assay in tuberculosis

KONG Haifang1，YUE Na1，LIU Gang2，LI Yanchun1，TIAN Bin1，HU Zhidong1△
1 Department of Laboratory Medicine，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Tianjin Haihe Hospital Laboratory△

E-mail：huzhidong27@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical application of the whole blood interferon γ（IFN-γ）release assay of QuantiFERON TB Gold in tube（QFT-GIT）in diagnosis of tuberculosis.MethodsFrom October 2014 to October 2015，109 patients with tuberculosis（45 cases of confirmed patients and 64 cases of clinically diagnosed patients）and 70 patients with non-tuberculosis were enrolled in Tianjin Medical University General Hospital.In order to evaluate diagnosis value between two kinds of tests，and to compare the differences between two groups，QFT-GIT test and colloidal gold anti tuberculosis antibody（TB-Ab）were employed to detect in two groups of patients.The ROC curve of IFN-γ release quantity was analyzed in two groups.ResultsThe sensitivity and specificity of QFT-GIT were 93.58%and 85.71%respectively. The positive rate was significantly higher in QFT-GIT than that of TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）.The sensitivity of combined detection of the two methods decreased to 52.3%（57/109），but the specificity increased to 90.0%（63/70）.The release quantity of IFN-γ was significantly higher in tuberculosis group than that in the non-tuberculosis group（U=330，P＜0.05）. The area under the ROC curve of IFN-γ release quantity was 0.913（95%CI:0.864-0.963）.ConclusionThe whole blood IFN-γ release assay of QFT-GIT is a sensitive and specific assay for detecting tuberculosis infection.The combination QFTGIT with TB-Ab can improve the specificity further，which could be a useful tool for the diagnosis of tuberculosis.

tuberculosis；BCG vaccine；diagnostic tests，routine；sensitivity and specificity；ROC curve；interferon-γ release assay；TB-Ab

R446.51，R52

A

10.11958/20160397

1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學檢驗科（郵編300052）；2天津市海河醫(yī)院檢驗科

孔海芳（1990），女，碩士在讀，主要從事細菌耐藥方面的研究

E-mail：huzhidong27@163.com