細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵基因ipt應(yīng)用研究進(jìn)展

皮照興 廉玉利 李依娜 孟德勇

（朝陽(yáng)師范高等?？茖W(xué)校，遼寧朝陽(yáng) 122000）

細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵基因ipt應(yīng)用研究進(jìn)展

皮照興 廉玉利 李依娜 孟德勇

（朝陽(yáng)師范高等?？茖W(xué)校，遼寧朝陽(yáng) 122000）

本文介紹了細(xì)胞分裂素的種類和生物合成過程，闡述了異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞分裂素生物合成過程中的重要限速酶，其編碼基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到廣泛應(yīng)用。重點(diǎn)綜述了轉(zhuǎn)化ipt基因可增加植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素的含量，在延緩葉片衰老、提高作物產(chǎn)量、誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)、抗旱、抗病蟲害、抗寒等方面起到了顯著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中應(yīng)用研究方向。

細(xì)胞分裂素 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 基因工程

細(xì)胞分裂素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中五大類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一，在促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大、誘導(dǎo)器官分化、延緩葉片衰老進(jìn)程以及在種子萌發(fā)和逆境應(yīng)答等重要生理生化反應(yīng)方面均發(fā)揮著重要的作用。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是催化細(xì)胞分裂素生物合成的關(guān)鍵酶，也是最重要的限速酶。本文就細(xì)胞分裂素的合成、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（簡(jiǎn)稱ipt基因）以及其在植物基因工程上應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為探索細(xì)胞分裂素生理作用機(jī)理及異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因在植物基因工程上應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為通過調(diào)整植物激素進(jìn)行作物遺傳育種展示了廣闊的應(yīng)用前景。

1　細(xì)胞分裂素的生物合成與 ipt基因

細(xì)胞分裂素在植物種子萌發(fā)、去黃化現(xiàn)象、葉綠體分化、頂端優(yōu)勢(shì)、植物抗逆反應(yīng)、花和果實(shí)的發(fā)育和葉片衰老等生長(zhǎng)發(fā)育都具有十分重要作用。Lethan在1963年報(bào)道的從未成熟玉米種子中分離出的反式玉米素是發(fā)現(xiàn)最早并純化的細(xì)胞分裂素（t-Zeatin）［1］。細(xì)胞分裂素主要包括嘌呤型和苯基脲型兩種類型，至今尚未在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然存在的苯基脲型細(xì)胞分裂素或有活性代謝物。

1.1細(xì)胞分裂素的生物合成

細(xì)胞分裂素的生物合成包括tRNA合成途徑與從頭合成途徑。其中tRNA合成途徑是以tRNA分解釋放出來的順式玉米素為底物，在順反異構(gòu)酶的催化下合成高活性的反式玉米素［2，3］，該途徑是細(xì)胞分裂素合成的次要途徑。從頭合成途徑是細(xì)胞分裂素生物合成的主要途徑，包括ATP/ADP途徑、AMP途徑和旁路途徑如圖1所示。

1.2ipt基因

Taya等［4］和Akiyoshi等［5］分別從黏菌（Dictyostelium discoideum）和致癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中鑒定出一種酶，該酶可催化AMP和IPP合成有活性的細(xì)胞分裂素iPMP，該酶稱之為IPT酶，它是細(xì)胞分裂素從頭生物合成限速酶，編碼該酶的基因稱為ipt基因。隨后在其它細(xì)菌和植物中也發(fā)現(xiàn)有ipt基因，2001年，Takei等［6］和 Kakimoto等［7］從擬南芥中鑒定出9個(gè)ipt同系物，命名為AtIPT1～AtIPT9。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析表明AtIPT2和AtIPT9編碼準(zhǔn)tRNA-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（tRNA合成途徑），而其它的7個(gè)基因在大腸桿菌中的表達(dá)可導(dǎo)致異戊烯基腺嘌呤和玉米素的分泌，表明這7個(gè)基因在擬南芥中是編碼細(xì)胞分裂素生物合成的基因且具有組織特異性。Sakamoto等在水稻中鑒定出8個(gè)ipt基因（OsIPT1～OsIPT8）編碼異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶并參與到細(xì)胞分裂素生物合成的過程中［8］。

從圖1可以看出，細(xì)菌中純化到的IPT酶利用AMP為底物合成玉米素，而擬南芥中純化得到的AtIPT酶優(yōu)先利用ATP和ADP作為底物，推測(cè)該酶可能先合成iPTP和iPDP，再經(jīng)羥基化合成嘌呤型的細(xì)胞分裂素［9］。近年來研究表明，在擬南芥中存在一個(gè)不依賴于iPTP/iPDP、iPMP的細(xì)胞分裂素合成途徑，該途徑可能是由ATP、ADP、AMP和萜類化合物前體（HMBDP）直接完成的［10］，在農(nóng)桿菌、大腸桿菌和黃木樨根瘤菌也分離鑒定出了間接途徑合成異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因——miaA基因［11］。

2　IPT基因在植物基因工程上的應(yīng)用

已有研究表明通過轉(zhuǎn)化ipt基因可增加植物內(nèi)源的細(xì)胞分裂素含量，可以延緩植物葉片的衰老，增強(qiáng)植物對(duì)非生物逆境的抗性，使植株保持高水平的光合作用，以提升農(nóng)作物的產(chǎn)量、改善品質(zhì)。

2.1延緩葉片衰老

植物葉片衰老的遺傳機(jī)制是通過細(xì)胞核基因表達(dá)調(diào)控和環(huán)境因子影響來啟動(dòng)衰老程序發(fā)揮作用的，它已成為一個(gè)重要指標(biāo)來增加作物遺傳改良的潛力。Huang［12］等認(rèn)為植物葉片在衰老過程中，內(nèi)源激素含量可能最先發(fā)生變化，由此導(dǎo)致葉綠體和蛋白質(zhì)降解，光合速率下降。在20世紀(jì)30年代末就有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素延緩葉片衰老的效應(yīng)，其主要通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和代謝途徑等提高細(xì)胞抗氧化酶的活性、減少膜脂類的過氧化作用、促進(jìn)活性氧的清除、增加光合作用、降低對(duì)乙烯和脫落酸的敏感性延緩植物葉片的衰老［13，14］。王哲［15］用PSAG12-ipt融合基因轉(zhuǎn)化煙草，全株青葉片數(shù)明顯增多，植株下部葉片衰老得到明顯延緩。李秋慶［16］用PSAG12-IPT基因轉(zhuǎn)化辣椒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)性植物出現(xiàn)葉片衰老延緩及植株生命周期延長(zhǎng)等現(xiàn)象，花的衰老也有所延緩。

2.2提高作物產(chǎn)量

細(xì)胞分裂素對(duì)植物的生理功能和作用是多方面的，具有誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向其含量高的部位運(yùn)輸?shù)哪芰Γ翘岣吖酀{效率的重要調(diào)控因子。在生產(chǎn)實(shí)踐中，施用外源細(xì)胞分裂素可有效增加籽粒的重量，提高座果率以及增大果實(shí)等［17］。ipt基因在水稻醇溶蛋白種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)使得煙草種子的iPA含量提高了4.73 倍，種子的重量增加了12.8%［18］。毛自朝等［19］將果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12驅(qū)動(dòng)ipt基因在番茄中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)果實(shí)中的細(xì)胞分裂素增高，番茄的坐果率、產(chǎn)量以及果實(shí)中的干物質(zhì)和粗蛋白均有不同程度的提高，且果實(shí)采摘后貯藏保鮮時(shí)間延長(zhǎng)了1-2周。很多科學(xué)工作者已把這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)化水果、農(nóng)作物、花卉和蔬菜等研究之中，這為提高農(nóng)作物、果蔬的產(chǎn)量與品質(zhì)提供了新的途徑。

2.3誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)

外源細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)黃瓜、西瓜、梨和蘋果的未授粉果實(shí)的發(fā)育，從而產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)。在番茄中利用果實(shí)特異性啟動(dòng)子大量表達(dá)ipt基因能得到穩(wěn)定的單性結(jié)實(shí)株系［20］，這為細(xì)胞分裂素調(diào)控植物的單性結(jié)實(shí)提供了直接證據(jù)。毛自朝等［19］將果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12驅(qū)動(dòng)ipt基因在番茄中的表達(dá)，也得到了無(wú)籽番茄。黃瓜ipt基因CsIPT2在授粉后的黃瓜果實(shí)發(fā)育中表達(dá)量上調(diào)，且在黃瓜天然單性結(jié)實(shí)前期和人工誘導(dǎo)的單性結(jié)實(shí)后期表達(dá)量均有增加，推測(cè)其在黃瓜單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［21］。

2.4參與抗逆反應(yīng)

編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因在作物中表達(dá)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生活體酶和逆境脅迫蛋白等生理變化，促進(jìn)光合作用，產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)，使細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫因子、機(jī)械損傷或昆蟲咬傷等作出響應(yīng)。

2.4.1抗旱

在干旱條件下，細(xì)胞分裂素可誘導(dǎo)過氧化氫體生成過氧化氫酶，葉綠素含量增加，促進(jìn)了光呼吸作用，提高了植物的抗旱能力，同時(shí)抑制了脫落酸的作用，延緩了葉片的衰老。張雷等［22］研究轉(zhuǎn)ipt基因四季海棠中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性植株細(xì)胞分裂素濃度增加，植株變矮，節(jié)間變短，葉片面積、氣孔密度和直徑均有不同程度的減小，主根發(fā)達(dá)且長(zhǎng)度增加，在滲透脅迫條件下，植株體內(nèi)脯氨酸含量和SOD活性較野生植株都明顯增加，抗旱能力增強(qiáng)。玉山江·麥麥提［23］研究也表明，在干旱脅迫條件下ipt轉(zhuǎn)基因水稻的細(xì)胞分裂素和葉綠素含量顯著升高、葉面溫度稍低、葉片衰老延緩、抗旱性增加、作物產(chǎn)量增加。

2.4.2抗病蟲害

細(xì)胞分裂素在調(diào)控植物的超越補(bǔ)償反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)中起著重要作用，遭受昆蟲取食的葉片，細(xì)胞分裂素含量增加，有效地促進(jìn)氣孔開放，降低氣孔的擴(kuò)散阻力而提高光合作用，促進(jìn)傷口愈合；同時(shí)導(dǎo)致植株體內(nèi)的次生代謝過程發(fā)生了變化，產(chǎn)生抗蟲效應(yīng)的毒害或趨避作用的化合物，從而產(chǎn)生抗蟲效應(yīng)。李海林等［24］研究表明轉(zhuǎn)CaMV35S-ipt基因的甘藍(lán)型油菜自交品種S65表現(xiàn)高抗蚜蟲，T1-3較野生型對(duì)蚜蟲的抑制率均為100%，而野生型植株表現(xiàn)高感蚜蟲，極易受到蚜蟲侵害。Smigocki等［25］將蛋白酶抑制劑II基因啟動(dòng)子-ipt融合基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能明顯抑制桃蚜的生長(zhǎng)發(fā)育。這種方法與導(dǎo)入抗蟲基因相比更接近于植物的天然防御能力，這將為植物基因工程技術(shù)研制抗蟲新品種提供新的的基因和思路。

2.4.3抗寒

外源ipt基因的表達(dá)，細(xì)胞分裂素含量增加，葉片葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及根系活力均增加，POD、SOD活性降低速率減慢，有利于植物抵抗低溫環(huán)境。張曉等［26］利用基因槍法將Leafy-ipt基因?qū)敫哐蛎┎?，轉(zhuǎn)基因株系植株的抗寒性明顯提高。王婷婷［27］研究表明轉(zhuǎn)ipt基因的草地早熟禾耐冷性顯著提高，隨著氣溫的降低，細(xì)胞膜受損傷程度低，出現(xiàn)凍害表型的時(shí)間晚，持綠期較長(zhǎng)，具有很好的應(yīng)用前景。李書欽［28］將ipt-bar雙元基因轉(zhuǎn)入水稻，也得到了強(qiáng)抗冷性植株，且千粒重和有效穗均有所增加。

2.5其他作用

ipt基因轉(zhuǎn)化植物提高細(xì)胞分裂素的含量，除了具有延緩植物葉片衰老、誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)、提高農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)、參與抗逆反應(yīng)外，還能提高轉(zhuǎn)化率和誘導(dǎo)率［29］、產(chǎn)生雄性不育后代、增強(qiáng)作物耐澇的能力［30］，還能作為選擇標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子［31］。但過量表達(dá)ipt基因?qū)?dǎo)致花不同程度的敗育和種子的萌發(fā)率降低［32］。

3　展望

分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用大力推動(dòng)了細(xì)胞分裂素和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因在植物基因工程的研究與應(yīng)用，但解析植物中細(xì)胞分裂素的合成代謝與器官發(fā)生發(fā)育過程的關(guān)系還需進(jìn)一步探討，尤其是細(xì)胞分裂素表達(dá)量以及細(xì)胞分裂素與其他激素的相互作用對(duì)植物生理代謝的調(diào)控以及器官發(fā)生發(fā)育過程的作用關(guān)系還需進(jìn)一步研究。我們期待今后利用特異啟動(dòng)子與異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因融合培育出更多品質(zhì)優(yōu)良的作物新品種。

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In this paper， the species and biosynthetic process of cytokinins are introduced. Isopentenyl-transferases catalyze the rate-limiting step of cytokinin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the ipt gene transformation can be increased endogenous cytokinin content which has significant effect in retard leaf senescence， increase crop yield， induced parthenocarpy， drought resistance，disease resistance and insect resistance， cold resistance and other aspects.At the same time， the paper analyzed the application and research direction of the ipt gene in plant gene engineering.

Cytokinin； Isopentenyl-transferase gene （ipt）； genetic engineering

課題項(xiàng)目：遼寧省教育廳課題，課題編號(hào)：L2013431。

皮照興（1958—），男，遼寧朝陽(yáng)人，本科，教授，研究方向：生物教學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)研究。