重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)家兔視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型視神經(jīng)蠕變特性的分析

王玲，呂雪漫，姜琦，袁毅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科，吉林 長春 130033)

1 引 言

視神經(jīng)由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突和膠質(zhì)等組成, 其損傷可以發(fā)生在視神經(jīng)的每個(gè)部位, 引起視功能部分或全部喪失， 視神經(jīng)損傷的預(yù)防和治療是視覺科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[1]。 國內(nèi)外學(xué)者對(duì)視神經(jīng)損傷診斷和治療進(jìn)行了大量的研究[2-5]。賀致禮[6]對(duì)自發(fā)性分化的特點(diǎn)、外源性和內(nèi)源性睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)于細(xì)胞分化結(jié)果的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明， 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠起到部分介導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞自發(fā)性分化的作用。并且自發(fā)性分化是在培養(yǎng)基中去除有絲分裂原之后發(fā)生的。 Birch等[7]以CNTF-4對(duì) 3例患者縱向性研究表明，根據(jù)自適應(yīng)光學(xué)激光掃描眼底鏡提供的高分辨率圖像，與治療側(cè)眼睛相比較，假手術(shù)側(cè)眼睛的錐間距增大，錐密度降低，提示，CNTF 具有視錐細(xì)胞保護(hù)作用。

關(guān)于視神經(jīng)損傷模型以藥物干預(yù)后視神經(jīng)生物力學(xué)特性研究，Jiang等[8]對(duì)視神經(jīng)損傷家兔模型通過以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和中藥復(fù)光顆粒治療視神經(jīng)損傷家兔后，眶內(nèi)段視神經(jīng)單向拉伸力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。得出了視神經(jīng)損傷家兔模型通過以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和中藥復(fù)光顆粒干預(yù)治療后，眶內(nèi)段視神經(jīng)拉伸力學(xué)性能指標(biāo)有一定恢復(fù)的結(jié)論。以蠕變特性指標(biāo)探討重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)視神經(jīng)損傷效果罕見報(bào)道。鑒于此，實(shí)驗(yàn)以視神經(jīng)損傷兔為動(dòng)物模型，以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行干預(yù)治療，以蠕變特性研判重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療視神經(jīng)損傷的效果，為臨床視神經(jīng)損傷治療提供蠕變特性指標(biāo)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡健康日本大耳白家兔33只, 體重2.7～2.9 kg, 均為雌性,購于長春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK(吉)2003-0004。實(shí)驗(yàn)前以 10%(35 mg/Kg)水合氯醛注射家兔腹腔麻醉，檢查家兔外眼及眼底無病變的納入實(shí)驗(yàn)。家兔在兔籠中飼養(yǎng)，家兔飼養(yǎng)室自然光照，室內(nèi)溫度23℃-25℃, 家兔飼養(yǎng)室內(nèi)空氣流通，家兔飼養(yǎng)室相對(duì)濕度55%～70%,家兔食用飼料為兔顆全價(jià)粒料，家兔自由飲水、攝食。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

33只日本大耳白家兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組11只、視神經(jīng)損傷動(dòng)物以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組11只、視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組11只。

2.3 家兔視神經(jīng)損傷模型制備

按文獻(xiàn)[9]的方法復(fù)制家兔視神經(jīng)損傷模型，將家兔俯臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。以濃度為1 g /L的烏拉坦( 5 mg /kg)兔耳緣靜脈注射麻醉，以手術(shù)刀切開兔右側(cè)眼頂側(cè)眶上皮膚, 暴露眶壁、眶上緣切跡, 在眶上緣切跡處向視神經(jīng)管方向咬除兩側(cè)部分眶壁骨板(寬6 mm，深7～8 mm ), 剪開眼球后球筋膜, 沿上直肌向球后分離, 使球后視神經(jīng)暴露。視神經(jīng)游離約5 mm, 離后極部約3 mm，以上海醫(yī)療器械廠W40160(3. 7 cm )反向血管夾鉗夾同一部位視神經(jīng)5 s。術(shù)野用慶大霉素液沖洗兩次后，10～0號(hào)尼龍線分層縫合。術(shù)后在家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。

2.4 造模成功標(biāo)準(zhǔn)

家兔損傷傷眼直接對(duì)光反應(yīng)消失，瞳孔固定、散大;以檢眼鏡觀察眼底，視網(wǎng)膜血管無梗塞與出血為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)的家兔作為視神經(jīng)損傷模型納入實(shí)驗(yàn)。

2.5 以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)視神經(jīng)損傷動(dòng)物方法

視神經(jīng)損傷動(dòng)物以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組家兔于手術(shù)(造模)后立即向球后一次性注射 CNTF 50 ng/ml[9]，視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組不給予治療視神經(jīng)損傷的藥物。

2.6 各組家兔視神經(jīng)標(biāo)本取樣方法

造模30 d后, 處死重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組、視神經(jīng)損傷模型組、正常對(duì)照組家兔，在鏡下取出眶內(nèi)段視神經(jīng)標(biāo)本各11個(gè)，置于生理鹽水槽中，在4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 各組動(dòng)物視覺電生理檢測(cè)

對(duì)視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組、視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組動(dòng)物于造模30 d后分別對(duì)動(dòng)物損傷眼(右眼)和正常眼(左眼)以德國羅蘭REFZ-POZE21sompace型視覺電生理儀進(jìn)行閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP) 檢測(cè)。記錄電極放于家兔枕骨結(jié)節(jié)上1.5～2.0 cm處，參考電極置于家兔額部正中，接地電極置于家兔耳垂；將角膜接觸鏡電極放好，接地皮膚電極置于耳垂，參考皮膚電極置于眼眶顳側(cè)，。電極放好后，以全視域閃光刺激器, 白色閃光, 閃光照度2 擋, 60 lx, 時(shí)間頻率2 Hz進(jìn)行刺激。分析時(shí)間250 ms, 數(shù)據(jù)經(jīng)由算機(jī)進(jìn)行采集。

1.若等腰三角形的一邊長為6cm，另一邊長為9cm，求此等腰三角形的周長。（6cm是腰長還是底邊長？）

2.8 光學(xué)顯微鏡觀察兔視神經(jīng)縱斷面的組織結(jié)構(gòu)

取各組家兔眶內(nèi)視神經(jīng)各一條，標(biāo)本固定于10%中性福爾馬林液 24 h。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；縱向切片，厚度為 3 μm，蠟帶裱于涂有蛋白甘油的載玻片上；溫箱烤片，切片常規(guī)脫臘；蘇木精染色3 min，自來水沖洗；1%鹽酸分化，自來水沖洗；弱氨水返藍(lán)，自來水沖洗；伊紅染色2 min；常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；以日本東京Olympus BX51光學(xué)顯微鏡分別觀察每個(gè)視神經(jīng)的形態(tài)。

2.9 蠕變實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)備為長春試驗(yàn)機(jī)研究所集團(tuán)生產(chǎn)的電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)，以長春市第三光學(xué)儀器廠生產(chǎn)的讀數(shù)顯微鏡測(cè)量各組家兔視神經(jīng)試樣的長度和直徑，各組家兔視神經(jīng)拉伸試樣長度為10 mm，正常對(duì)照組家兔視神經(jīng)試樣直徑1.01～1.03 mm，視神經(jīng)損傷模型組家兔視神經(jīng)試樣直徑0.97～0.99 mm，視神經(jīng)損傷以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組家兔視神經(jīng)試樣直徑1.00～1.02 mm。按文獻(xiàn)[10-12]的方法分別對(duì)每個(gè)家兔視神經(jīng)試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)處理。視神經(jīng)拉伸實(shí)驗(yàn)溫度為36.5±1.0℃，分別將3組家兔視神經(jīng)試樣裝夾在試驗(yàn)機(jī)夾頭內(nèi)，以0.2 Mpa/s的速度對(duì)試樣施加應(yīng)力，當(dāng)正常對(duì)照組視神經(jīng)試樣應(yīng)變達(dá)到3.98%、視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組試樣應(yīng)變達(dá)到3.85%、視神經(jīng)損傷模型組試樣應(yīng)變達(dá)到3.78%時(shí)，各組視神經(jīng)試樣應(yīng)力達(dá)到0.454 Mpa時(shí)，保持應(yīng)力恒定，設(shè)定視神經(jīng)試樣蠕變實(shí)驗(yàn)時(shí)間為7 200 s。觀察視神經(jīng)試樣應(yīng)力與時(shí)間的變化關(guān)系。為在實(shí)驗(yàn)中保持試樣的濕度，在實(shí)驗(yàn)中向視神經(jīng)試樣噴灑生理鹽水。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以mean±SD表示，用SPSS16.0 軟件包(SPSS, Chicago, IL, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間數(shù)據(jù)差異的比較采用單因素方差分析法和Sceffe法，P<0.05 為差異有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 各組視神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果

F- VEP 記錄 圖形分析標(biāo)準(zhǔn): P1 波幅值為自N1 波谷底至P1 波峰頂, 潛伏期為自觸發(fā)時(shí)至P1峰為止, 由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄, 各組動(dòng)物電生理檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 各組視神經(jīng)電生理檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組視神經(jīng)電生理檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組Pl峰值大于視神經(jīng)損傷模型組和視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組，差異顯著(P<0.05)，正常對(duì)照組pl峰潛時(shí)值小于視神經(jīng)損傷模型組和視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組，差異顯著(P<0.05)。視神經(jīng)損傷模型以人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子組Pl峰值大于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組組pl峰潛時(shí)值小于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05)。

3.2 各組視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)

正常對(duì)照組視神經(jīng)縱斷面的組織形態(tài)(HE染色，×400)纖維呈密集的平行排列，結(jié)構(gòu)排列整齊規(guī)則，染色均勻，膠質(zhì)細(xì)胞大小、排列均勻見圖1(a)，視神經(jīng)損傷模型組兔視神經(jīng)縱斷面的病理學(xué)改變(HE染色，×400)神經(jīng)纖維束結(jié)構(gòu)消失，神經(jīng)纖維和膠質(zhì)細(xì)胞變性、壞死，偶見溶解的細(xì)胞核見圖1(b)，視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組的兔損傷視神經(jīng)縱斷面的病理學(xué)改變(HE染色，×400)視神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)尚存，較少部分視神經(jīng)纖維排列不規(guī)則，視神經(jīng)無明顯變細(xì)，見圖1(c)。

圖1 各組視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)照片

3.3 各組視神經(jīng)試樣蠕變曲線

由各組試樣的蠕變?cè)囼?yàn)數(shù)據(jù)以計(jì)算機(jī)進(jìn)行曲線擬合，蠕變曲線見圖2。

3.4 各組視神經(jīng)試樣的歸一化蠕變函數(shù)曲線

對(duì)各組視神經(jīng)試樣歸一化蠕變函數(shù)數(shù)據(jù)以計(jì)算機(jī)進(jìn)行曲線擬合，各組視神經(jīng)試樣歸一化蠕變函數(shù)曲線見圖3。

圖2 各組視神經(jīng)試樣蠕變曲線

圖3 各組視神經(jīng)試樣歸一化蠕變函數(shù)曲線

3.5 各組視神經(jīng)試樣歸一化蠕變函數(shù)方程的建立

J(t)=a+be-t

(3)

令：

正則方程：

(4)

分別將各組視神經(jīng)蠕變實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入(4)式，解出各組試樣的a、b值，將各組試樣的a、b值分別代入(3)式得出兩組試樣的歸一化蠕變函數(shù)方程如下：

正常對(duì)照組：

視神經(jīng)損傷模型組：

視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組：

4 討論

各組家兔視神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果表明，視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組Pl峰值大于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組pl峰潛時(shí)值小于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，說明重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型的視神經(jīng)具有一定的療效。

各組視神經(jīng)蠕變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組7 200 s應(yīng)變上升量大于視神經(jīng)損傷模型組(P<0.05)。各組家兔視神經(jīng)蠕變實(shí)驗(yàn)最初1 800 s應(yīng)變上升速度快，之后應(yīng)變緩慢上升，達(dá)到設(shè)定的蠕變實(shí)驗(yàn)時(shí)間7 200 s時(shí)，各組家兔視神經(jīng)試樣蠕變曲線基本接近于水平，各組視神經(jīng)試樣蠕變曲線變化趨勢(shì)呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。蠕變是視神經(jīng)對(duì)生理應(yīng)力適應(yīng)性的反應(yīng)，視神經(jīng)生理范圍內(nèi)的蠕變特性有利于抵抗應(yīng)力，視神經(jīng)的生理功能要求視神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)完整，結(jié)構(gòu)完整的視神經(jīng)才具有良好的蠕變特性。分析認(rèn)為視神經(jīng)損傷模型家兔視神經(jīng)受到鉗夾傷后，使視神經(jīng)結(jié)構(gòu)喪失了完整性，將會(huì)使視神經(jīng)全部和部分喪失抵抗應(yīng)力的能力，所以，視神經(jīng)損傷模型組的蠕變特性發(fā)生了改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNTF組視神經(jīng)纖維排列較紊亂，膠質(zhì)細(xì)胞核增多，部分排列不規(guī)則，可見少量細(xì)胞空泡，胞核溶視神經(jīng)纖維迂曲、偶見胞核碎片，但視神經(jīng)無明顯變細(xì)，較模型組損傷程度輕，通過以CNTF對(duì)視神經(jīng)損傷動(dòng)物進(jìn)行治療，對(duì)破壞的視神經(jīng)組織形態(tài)有所改變，在長時(shí)間恒應(yīng)力作用下的應(yīng)變上升量有所提高，說明視神經(jīng)損傷以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)后蠕變特性具有一定的恢復(fù)，說明CNTF對(duì)治療動(dòng)物視神經(jīng)損傷具有一定的作用。

視神經(jīng)的損傷發(fā)生機(jī)制與視神經(jīng)的生物力學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。我們研究了以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)家兔視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型視神經(jīng)的蠕變特性。以回歸分析的方法根據(jù)已得的蠕變實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及以往的經(jīng)驗(yàn)建立統(tǒng)計(jì)模型構(gòu)建了各組坐骨神的蠕變函數(shù)方程；研究了各組視神經(jīng)應(yīng)變與時(shí)間之間的相關(guān)關(guān)系，建立起應(yīng)變與時(shí)間變量之間的函數(shù)關(guān)系。各組視神經(jīng)蠕變函數(shù)方程的建立能更好的闡明視神經(jīng)的蠕變特性。從而給臨床中相同發(fā)病機(jī)制而造成視神經(jīng)損傷提供粘彈性力學(xué)方面的理論依據(jù)。

以往對(duì)動(dòng)物視神經(jīng)損傷模型藥物干預(yù)效果分析，以生物學(xué)、組織形態(tài)學(xué)觀察等居多。本研究是以蠕變指標(biāo)研判重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)視神經(jīng)損傷的效果，具有創(chuàng)新性。