中國(guó)野生刺葡萄（Vitis davidii Foex）及其單品種葡萄酒中花旗松素含量分析

牛生洋，莫海珍，姜建福，李　華，王　華，*，樊秀彩，張　穎，劉崇懷

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009）

中國(guó)野生刺葡萄（Vitis davidii Foex）及其單品種葡萄酒中花旗松素含量分析

牛生洋1，2，3，莫海珍2，姜建福3，李華1，王華1，*，樊秀彩3，張穎3，劉崇懷3

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009）

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)原產(chǎn)中國(guó)的野生刺葡萄果實(shí)的果皮、果肉、種子及單品種葡萄酒中的花旗松素含量（以鮮質(zhì)量計(jì)算）進(jìn)行測(cè)定與分析。結(jié)果表明：刺葡萄果實(shí)果皮中花旗松素含量最高，其含量在刺葡萄黑、白果實(shí)中分別為（2.44±0.18）、（2.03±0.14） mg/kg，在種子中分別為（1.66±0.13）、（1.38±0.12） mg/kg，果肉中含量最低，分別為（0.36±0.02）、（0.25±0.02） mg/kg。刺葡萄黑、白果實(shí)中各個(gè)部位花旗松素含量均無(wú)明顯差異，但對(duì)照品種黑色果實(shí)果皮中的花旗松素含量顯著高于白色果實(shí)，這說(shuō)明花旗松素含量的高低與葡萄果皮顏色并無(wú)直接關(guān)系。在單品種酒中，白葡萄酒由于釀造工藝不同，果皮和種子中的花旗松素?zé)o法進(jìn)入酒中，花旗松素含量?jī)H為紅葡萄酒的20%；葡萄酒中的花旗松素含量略低于果實(shí)是因?yàn)樘崛」麑?shí)中花旗松素的溶劑是甲醇，而葡萄酒中只是水和乙醇的自然浸漬。

刺葡萄；花旗松素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；葡萄酒

花旗松素屬于二氫黃酮醇類(lèi)化合物（圖1），是植物次生代謝的產(chǎn)物，具有很強(qiáng)抗氧化活性?，F(xiàn)代研究表明，花旗松素還具有降血壓、抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗輻射、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物活性［1-6］。此外，有報(bào)道指出，花旗松素還是許多名貴中藥材的主要有效成分，如土茯苓、水紅花子等［7-8］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明花旗松素安全無(wú)毒，無(wú)過(guò)敏和無(wú)致突變作用，被廣泛應(yīng)用于植物油、動(dòng)物油、奶粉、甜味劑等食品相關(guān)領(lǐng)域，是一種新型的食品添加劑［9］。有關(guān)花旗松素的研究開(kāi)發(fā)也受到了許多科研工作者的密切關(guān)注。花旗松素首次從針葉植物中分離并鑒定以來(lái)［10］，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)了花旗松素及其衍生物。葡萄是公認(rèn)的富含酚類(lèi)物質(zhì)的水果，已有報(bào)道指出在葡萄及葡萄酒中發(fā)現(xiàn)含有花旗松素［11-13］，但有關(guān)葡萄品種之間含量的變化，葡萄各個(gè)部位含量以及不同果皮顏色的果實(shí)之間區(qū)別的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

圖1　花旗松素分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Molecular structure of taxifolin

刺葡萄是原產(chǎn)我國(guó)的野生葡萄資源，因其果粒大，抗性強(qiáng)，花色苷等酚類(lèi)物質(zhì)含量豐富，同時(shí)具備鮮食與釀酒特性，被廣泛種植于我國(guó)南方地區(qū)，極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值［14-15］。此外，刺葡萄還同時(shí)具有白色果實(shí)，這在野生葡萄資源中是非常罕見(jiàn)的，也為準(zhǔn)確比較有色及白色葡萄果實(shí)中相關(guān)物質(zhì)含量的差異提供了非常理想的材料。本研究利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)刺葡萄黑色及白色果實(shí)在充分成熟期果皮、果肉及種子中的花旗松素進(jìn)行精確測(cè)定，并選擇歐亞種（Vitis vinifera）葡萄‘黑比諾’及其白色芽變品種‘白比諾’［16］作為對(duì)照，同時(shí)用刺葡萄及對(duì)照品種釀造單品種葡萄酒，檢測(cè)其葡萄酒中的花旗松素含量（以鮮質(zhì)量計(jì)算）變化，為中國(guó)野生刺葡萄的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及處理

刺葡萄黑色果實(shí)株系、白色果實(shí)株系及對(duì)照‘黑比諾’、‘白比諾’采于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所國(guó)家種質(zhì)葡萄資源圃。在供試材料轉(zhuǎn)色期10 d后，采摘葡萄果實(shí)用蒸餾水洗凈果實(shí)表面，將果皮、果肉及種子分離，分別用液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。平行設(shè)置3 次重復(fù)。

單品種葡萄酒均采用傳統(tǒng)釀造工藝，黑色葡萄破碎，白色葡萄壓榨取汁后接入釀酒酵母在28 ℃發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后皮渣分離，小容器放置于4 ℃穩(wěn)定澄清［17］。

1.1.2試劑

花旗松素及沒(méi)食子酸標(biāo)樣（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、甲酸、乙醇、乙腈、丙酮等為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備

6460B高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國(guó)安捷倫公司；5415D高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司；DS-8510DTH超聲波振蕩儀 上海生析公司；TU-1910紫外分光光度計(jì) 北京普析通用公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁公司。

1.2方法

1.2.1葡萄果實(shí)及葡萄酒中花旗松素提取液準(zhǔn)備

參考Liang Zhenchang等［18］的方法，略有改動(dòng)。將供試葡萄不同部位的材料用液氮研磨成粉后，取1.0 g于10 mL離心管中，加入不同提取液（水-甲酸-甲醇（或者乙醇、丙酮）（28∶2∶70，V/V））8 mL，錫箔紙包裹離心管，低溫振蕩10 min后13 000 r/min離心10 min，收集上清液低溫避光保存，沉淀中加入提取液重復(fù)上步2 次，將3 次重復(fù)的上清液于30 ℃避光旋蒸后用10 mL甲醇定容，過(guò)0.22 μm濾膜后檢測(cè)。葡萄酒樣過(guò)膜后用甲醇稀釋至合適倍數(shù)直接檢測(cè)。

1.2.2花旗松素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)在農(nóng)業(yè)部果品苗木質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（鄭州）完成。色譜條件為：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫條件為：0 min，90% A、10% B；2.0 min，50% A、50% B；3 min，10% A、90% B；5.0 min，90% A、10% B；6 min，A 90%、B 10%。柱溫：30 ℃。質(zhì)譜條件為：進(jìn)樣量5 μL，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速8 L/min，霧化氣壓力40 psi，鞘流氣溫度350 ℃，鞘流氣流速10 L/min。檢測(cè)方式采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式。定量檢測(cè)為多反應(yīng)檢測(cè)（multi reaction montior，MRM），數(shù)據(jù)收集為MassHunter工作平臺(tái)（Agilent，USA）。花旗松素標(biāo)樣高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)見(jiàn)圖2。

圖2　花旗松素標(biāo)樣高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.2　HPLC-MS/MS analysis of taxifolin standard

1.2.3供試葡萄果實(shí)及其葡萄酒中理化指標(biāo)測(cè)定

還原糖、總酸、pH值及糖酸比等參考王華等［19］方法；總酚采用福林肖卡比色法［20-21］。在10 mL容量瓶中分別加入0.1 mL提取液、0.5 mL福林試劑、1.5 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液后加蒸餾水定容。避光反應(yīng)120 min后在765 nm測(cè)定吸光度，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1供試葡萄樣品成熟期理化指標(biāo)分析

成熟度是葡萄生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)非常重要的指標(biāo)，不但影響著葡萄的產(chǎn)量，對(duì)葡萄及葡萄酒的品質(zhì)也起著決定性作用。生產(chǎn)上判斷葡萄成熟期主要是根據(jù)可溶性固形物含量變化，而實(shí)際上葡萄漿果的成熟度與糖、酸及酚類(lèi)物質(zhì)的含量都有顯著的相關(guān)性［22］。葡萄從轉(zhuǎn)色期開(kāi)始進(jìn)入成熟期，成熟期的長(zhǎng)短在不同種及品種之間差異很大。田間觀察發(fā)現(xiàn)，刺葡萄成熟期長(zhǎng)達(dá)40 d，而‘黑比諾’及‘白比諾’等歐亞種不超過(guò)20 d。為保持實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)生長(zhǎng)曲線記錄，選擇轉(zhuǎn)色后10 d作為成熟期采樣，測(cè)定了供試葡萄漿果基本理化指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種及不同果皮顏色之間，成熟期的糖、酸及pH值等指標(biāo)并無(wú)顯著差異（表1），總酚含量卻是有色果實(shí)顯著高于白色果實(shí)。這是因?yàn)楣な菦Q定漿果顏色的主要部位，酚類(lèi)物質(zhì)含量很高，而且有色果實(shí)中酚類(lèi)明顯高于白色果實(shí)［23-24］。然而，一般所說(shuō)酚類(lèi)物質(zhì)都是針對(duì)總酚而言，單個(gè)酚類(lèi)物質(zhì)往往有其特殊的表現(xiàn)?；ㄆ焖伤刈鳛橐环N特殊的酚類(lèi)物質(zhì)，是否也符合這個(gè)規(guī)律，葡萄果實(shí)中果皮、果肉及種子中花旗松素含量又是如何變化的，尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1　供試葡萄樣品果實(shí)成熟期理化指標(biāo)（±s，n=3）Table1　Physicochemical properties of mature grape berries，n=3）

表1　供試葡萄樣品果實(shí)成熟期理化指標(biāo)（±s，n=3）Table1　Physicochemical properties of mature grape berries，n=3）

注：統(tǒng)計(jì)分析在所有供試樣品之間相同部位進(jìn)行，同列相同字母表示差異不顯著，不同字母之間表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

果實(shí)理化指標(biāo)還原糖含量/（mg/kg）葡萄樣品年份總酸含量/（mg/kg）總酚含量/（mg/kg）pH黑刺葡萄2013197.36±8.6a9.27±0.54a2 601.43±112a3.23±0.15a2014201.47±8.1a8.79±0.48a2 458.28±101a3.18±0.14a白刺葡萄2013188.43±9.2a9.18±0.51a294.39±16b3.02±0.11a2014173.21±8.4a8.53±0.53a281.58±15b3.24±0.12a‘黑比諾’2013202.72±9.4a7.11±0.35a221.32±12b3.09±0.12a2014211.29±9.5a7.46±0.39a244.36±14b3.06±0.13a2013193.38±8.2a7.32±0.43a2 845.58±125a3.32±0.15a2014201.65±9.1a6.75±0.37a2 581.27±116a3.37±0.16a‘白比諾’

2.2不同提取試劑對(duì)花旗松素提取影響

花旗松素屬于黃酮類(lèi)化合物，易溶于極性溶劑，目前常用甲醇、乙醇及丙酮等作為花旗松素的提取劑［25-26］。本實(shí)驗(yàn)以葡萄果皮為材料，分別驗(yàn)證了以甲醇、乙醇及丙酮作為提取劑對(duì)花旗松素含量測(cè)定的影響。結(jié)果表明，不同提取劑條件下花旗松素的含量有明顯的差異（圖3）。甲醇和丙酮作為提取劑對(duì)花旗松素的含量影響不明顯，但顯著高于乙醇作為提取劑時(shí)的含量。乙醇作為提取劑，盡管提取量只有甲醇和丙酮的70%～80%，但提取純度仍然能滿(mǎn)足質(zhì)譜測(cè)定要求（圖4）。因此，在對(duì)花旗松素進(jìn)行分離提取時(shí)，用甲醇和丙酮的產(chǎn)量要高于乙醇，但考慮到甲醇和丙酮的安全性問(wèn)題，建議小量提取用于科學(xué)研究時(shí)，選擇用甲醇作為提取劑，用于大量生產(chǎn)，則選擇用乙醇作為提取劑。本研究為確保葡萄果實(shí)中不同部位花旗松素含量的精度，選擇用甲醇作為提取劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3　不同提取劑對(duì)葡萄果皮中花旗松素提取效果的影響Fig.3　Effect of extraction agents on taxifolin content in grape berry skin

圖4　乙醇提取黑刺葡萄果皮花旗松素高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4　HPLC-MS/MS analysis of taxifolin extracted with ethanol from grape skin

2.3刺葡萄果實(shí)不同組織花旗松素的含量

將刺葡萄及對(duì)照的果皮、果肉及種子分別用甲醇提取后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)花旗松素的含量。表2表明，刺葡萄及對(duì)照品種不論有色無(wú)色，都是果皮中花旗松素含量最高，種子次之，果肉中的花旗松素含量最低，僅有果皮的15%～25%。在不同種（品種）之間，種子和果肉中的花旗松素含量并沒(méi)有明顯區(qū)別，而果皮中的花旗松素含量卻表現(xiàn)出了顯著差異。刺葡萄黑色果實(shí)果皮中的花旗松素含量與白色果實(shí)之間并無(wú)明顯不同，但對(duì)照品種歐亞種‘黑比諾’果皮中花旗松素含量卻顯著高于‘白比諾’，而的黑刺葡萄和‘黑比諾’果皮中花旗松素的含量也沒(méi)有差異。

目前已知葡萄果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量因品種、產(chǎn)地等不同差異非常大，而且有色葡萄果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量顯著高于白色果實(shí)［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，花旗松素在不同果實(shí)顏色中的花旗松素雖然有差異，但并不是所有的白色果實(shí)都明顯低于黑色果實(shí)，也就是說(shuō)，酚類(lèi)物質(zhì)與果實(shí)顏色并無(wú)直接關(guān)系，另外，這也說(shuō)明在中國(guó)野生刺葡萄白色果實(shí)中花旗松素合成途徑中存在著某些特殊之處。

表2　刺葡萄果實(shí)不同部位花旗松素的含量變化（，n=3）Table2　Taxifolin contents in different tissues of grape berriess，n= 3）

表2　刺葡萄果實(shí)不同部位花旗松素的含量變化（，n=3）Table2　Taxifolin contents in different tissues of grape berriess，n= 3）

葡萄樣品年份花旗松素含量/（mg/kg）果皮果肉種子黑刺葡萄20132.23±0.16a0.32±0.02a1.53±0.13a20142.65±0.18a0.39±0.02a1.78±0.14a均值2.44±0.180.36±0.021.66±0.13白刺葡萄20131.98±0.13a0.22±0.02a1.32±0.11a20142.07±0.14a0.29±0.02a1.44±0.12a均值2.03±0.140.25±0.181.38±0.12‘黑比諾’20132.13±0.16a0.45±0.03a1.42±0.15a20142.35±0.17a0.53±0.04a1.57±0.16a均值2.24±0.160.49±0.031.49±0.16‘白比諾’20131.12±0.14b0.27±0.02a1.19±0.12a20141.23±0.15b0.36±0.03a1.36±0.14a均值1.18±0.140.32±0.021.27±0.13

2.4葡萄酒中花旗松素含量

盡管有報(bào)道指出紅酒中含有花旗松素，但并未對(duì)含量做過(guò)準(zhǔn)確測(cè)定。本研究用傳統(tǒng)釀造方法，對(duì)中國(guó)野生刺葡萄及對(duì)照品種進(jìn)行單品種釀造后，檢測(cè)其花旗松素、總酚、pH值及酒度等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5A表明，在單品種酒中，紅葡萄酒中花旗松素含量均顯著高于白葡萄酒，白葡萄酒中花旗松素含量只有紅葡萄酒的15%～20%，總酚含量也是如此（圖5B）。然而，由表2可知，刺葡萄黑色果實(shí)和白色果實(shí)在果皮中花旗松素含量并無(wú)明顯差異，然而白葡萄酒中含量卻很低，這主要是因?yàn)榘灼咸丫频奶厥忉勗旃に囉绊?，白葡萄酒在釀造時(shí)不帶葡萄皮和種子，這樣果皮和種子中的花旗松素等酚類(lèi)就不能被進(jìn)入葡萄酒中。此外，葡萄酒中的花旗松素含量略低于果實(shí)是因?yàn)樘崛」麑?shí)中花旗松素的溶劑是甲醇，而葡萄酒中只是水和乙醇的自然浸漬。在果實(shí)充分成熟后，紅葡萄酒和白葡萄酒在pH值及酒度等指標(biāo)并無(wú)顯著差異（圖5C、D），這也充分說(shuō)明了果皮和種子是葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)最主要的來(lái)源。白葡萄酒的釀造，如果能改變工藝，將果皮與種子充分利用，也可以獲得和紅葡萄酒相似的功能性成分。

圖5　刺葡萄及對(duì)照樣單品種葡萄酒花旗松素含量及基本理化指標(biāo)Fig.5　Taxifolin contents and physiochemical properties of grape berries and wines from V. davidii and V. vinifera

3　結(jié) 論

用具有白色和黑色果實(shí)的中國(guó)野生刺葡萄果實(shí)及歐亞種‘黑比諾’和其果皮顏色變異品種‘白比諾’作為材料，測(cè)定的結(jié)果不受其他因素干擾，能真實(shí)表現(xiàn)因果皮顏色不同而造成花旗松素含量的差異。本研究結(jié)果表明，中國(guó)野生刺葡萄果實(shí)花旗松素含豐富，一般是果皮含量最高，其次是種子，果肉的花旗松素含量最少，因此白葡萄酒中花旗松素含量顯著低于紅葡萄酒，只有紅葡萄酒的15%～20%。結(jié)合對(duì)照品種，花旗松素在葡萄中的含量主要集中在果皮和種子，不同顏色的葡萄果皮中花旗松素含量會(huì)有差異，但中國(guó)野生刺葡萄白色果實(shí)中花旗松素含量和有色果實(shí)含量無(wú)明顯差異，但顯著高于歐亞種白色果實(shí)中的含量。

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Taxifolin Contents in Grape Berries and Wines from Different Vatieties of Vitis davidii Foex

NIU Shengyang1，2，3， MO Haizhen2， JIANG Jianfu3， LI Hua1， WANG Hua1，*， FAN Xiucai3， ZHANG Ying3， LIU Chonghuai3
（1. College of Enology， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. College of Food Sciences， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China；3. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， China）

The taxifolin contents of grape skins， seeds and pulps from Vitis davidii， a wild grape species originating in China，and wines from individual varieties of V. davidii and Vitis vinifera were determined using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Taxifolin content was the highest in the grape skin of V. davidii， which was （2.44 ± 0.18） and （2.03 ± 0.14） mg/kg fresh weight （FW） in two varieties with colored and white skin， respectively. The taxifolin contents of the seeds of these two varieties were （1.66 ± 0.13） and （1.38 ± 0.12） mg/kg，respectively. Taxifolin content was the lowest in pulps for both varieties， which was （0.36 ± 0.02） and （0.25 ± 0.02） mg/kg，respectively. No significant differences in taxifolin content were found for different parts of grape berries between the two varieties of V. davidii. However， Taxifolin content in the skin of V. vinifera L. cv. Pinot Noir was significantly higher than in the skin of V. vinifera L. cv. Pinot Blanc， suggesting that the taxifolin content is not correlated with the skin color of grape berries. Since a different vinification was used for the white grape variety， which kept the taxifolin in skins and seeds from entering the wine， the taxifolin content of wines from the white variety was only 20% as compared to that of wines from the colored variety for both V. davidii and V. vinifera. Taxifolin content in wine was somewhat lower than in grape berry skin， due to the greater extraction ability of methanol for taxifolin in the skin， as compared to that of ethanol produced in wine.

Vitis davidii； taxifolin； HPLC-MS/MS； wine

10.7506/spkx1002-6630-201618018

TS255.1

A

1002-6630（2016）18-0107-06

牛生洋， 莫海珍， 姜建福， 等. 中國(guó)野生刺葡萄（Vitis davidii Foex）及其單品種葡萄酒中花旗松素含量分析［J］. 食品科學(xué)，2016， 37（18）: 107-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618018. http://www.spkx.net.cn

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2015-12-22

國(guó)家林業(yè)科技推廣項(xiàng)目（2014-45）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372024）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-12-0694）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14A550015）

牛生洋（1976—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒學(xué)。E-mail：niushegnyang@163.com

王華（1959—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒學(xué)。E-mail：wanghua@nwsuaf.edu.cn