KLF4基因沉默對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及機(jī)制研究

李濤　牛麗娟　劉文宣　楊磊　李曼　曹丹丹　彭亂順

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·論著·

KLF4基因沉默對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及機(jī)制研究

李濤牛麗娟劉文宣楊磊李曼曹丹丹彭亂順

目的探討大鼠KLF4基因沉默，對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及其機(jī)制。方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)大鼠KLF4基因的3個(gè)干擾質(zhì)粒(pGPU6-1，pGPU6-2，pGPU6-3)以及陰性對(duì)照。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT- PCR(Real-time RT- PCR )和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，篩選出沉默最好的干擾質(zhì)粒,將篩選出來(lái)的干擾質(zhì)粒pGPU6-3，轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h和48 h后分別采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA和蛋白的表達(dá)。Real-time RT-PCR法以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計(jì)算。western blot的方法以β-actin蛋白為內(nèi)參照，進(jìn)行分析。結(jié)果Real-time RT- PCR結(jié)果顯示，pGPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1相對(duì)于對(duì)照組的mRNA表達(dá)分別下降為0.358±0.038，0.298±0.041和0.478±0.048； 而MMP-13 mRNA的表達(dá)則上升為1.712±0.034。Western Blot檢測(cè)中，pGPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后，以β-actin為內(nèi)參照，Ⅰ型膠原蛋白，Ⅲ型膠原蛋白和TIMP-1蛋白的表達(dá)分別下降為0.326±0.051，0.283±0.074和0.331±0.039；而MMP-13蛋白的表達(dá)則上升為1.273±0.038。結(jié)論KLF4基因沉默可以顯著減少大鼠HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)，其機(jī)制與增加MMP-13表達(dá)，而抑制TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。

人肝星狀細(xì)胞；KLF4；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原；MMP-13

肝纖維化的本質(zhì)是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成與降解不平衡所導(dǎo)致ECM的過(guò)度沉積。正常肝臟中ECM的主要成份是Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ，Col Ⅲ)，其他膠原所占比例較少[1]。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells， HSCs) 是肝臟中的ECM的主要合成細(xì)胞，同時(shí)，HSCs還能分泌多種膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)以降解ECM，同時(shí)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)防止膠原過(guò)度降解，使肝臟ECM的合成和分解處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中[2]。KLF4是Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成員，具有調(diào)節(jié)某些細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[3]。那么，KLF4基因沉默是否會(huì)對(duì)HSCs的膠原的代謝產(chǎn)生影響？本研究將篩選出沉默效果最好的干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞，觀察KLF4沉默是否可以對(duì)HSCs的膠原代謝及其相關(guān)酶類(lèi)產(chǎn)生影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院細(xì)胞中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Liprofectamine 2000、Trizol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green Real-Time試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司；M-mlV Reverse Transcriptase試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 購(gòu)自北京天根公司；兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；兔抗大鼠MMP-13、兔抗大鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司、兔抗大鼠Ⅲ型膠原多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗大鼠KLF4、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG購(gòu)自美國(guó)Rockland公司。

1.2方法

1.2.1參考Genbank中的大鼠KLF4的基因序列，依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA序列，使用BLAST將選定的序列和相應(yīng)的大鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除與其他編碼序列同源的序列。同時(shí)，設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照dsRNA。利用含U6啟動(dòng)子的pGPU6/GFP/Neo表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建其RNA干擾重組體。交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。干擾質(zhì)粒pGPU6-1靶序列：GGACCTAGACTTTATCCTTTC；干擾質(zhì)粒pGPU6-2靶序列：GGTCATCAGTGTTAGCAAAGG；干擾質(zhì)粒pGPU6-3靶序列：GGAACTCTCTCACATGAAGCG；干擾質(zhì)粒pGPU6陰性對(duì)照靶序列: GTTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng):在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適匯合度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞:用天根公司質(zhì)粒抽提試劑盒將構(gòu)建好的干擾載體重組質(zhì)粒從保存菌DH5a中抽提出來(lái)，根據(jù)試劑說(shuō)明，轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種至6孔板，在轉(zhuǎn)染前6 h更換為無(wú)抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基，至70%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染。根據(jù)lipofectamine 2000的Protocol分別配置A, B液，溶液A:用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋干擾質(zhì)粒到總體積50 μl。溶液B:用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋4 μl脂質(zhì)體到總體積50 μl，室溫孵育5 min?；旌先芤篈和B，室溫孵育20 min，將100 μl脂質(zhì)體/DNA混合物加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱孵育6 h，然后更換為2 ml含10%小牛血清的新鮮DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染后24 h和48 h提取RNA和蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4Real time RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中KLF4、Col Ⅰ、Col Ⅲ、MMP-13、TIMP-1mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒24 h后用PBS清洗細(xì)胞，每孔加入1 ml Trizol，充分裂解，將裂解液轉(zhuǎn)至EP管中，加入200 μl氯仿；4℃，12 000 r/min離心15 min，把上層無(wú)色液相移入新的EP管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置30 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，洗滌沉淀；4℃，5 000 r/min離心3 min，倒出液體；室溫晾干，加入DEPC水20 μl溶解。將細(xì)胞總RNA 2 μg，采用M-mlV Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green Real-Time試劑盒，對(duì)反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA進(jìn)行Real time RT-PCR檢測(cè)，選取2 μl cDNA于20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在Rotor-GeneTM6000(Corbett)中進(jìn)行，循環(huán)條件為94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用Primer3.0軟件，設(shè)計(jì)所需片段的擴(kuò)增引物，由華大基因公司合成與純化，序列如下: 大鼠KLF4上游引物序列：5’-GAACTGACCAGGCACTACCG-3’下游引物序列：5’-CTTGCTGGGAACTTGACCAT-3’；大鼠Col Ⅰ上游引物序列：5’- ATCTTTCTCCACGTTCGCGT-3’下游引物序列：5’- GGAAGTCGCTTCATGTGGGA-3’；大鼠Col III上游引物序列：5’- TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’下游引物序列：5’- CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3’；大鼠MMP-13上游引物序列：5’-AGGAGCATGGCGACTTCTAC-3’下游引物序列：5’-AGACCTAAGGAGTGGCCGAA-3’；大鼠TIMP-1上游引物序列：5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’下游引物序列：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3’；大鼠GAPDH上游引物序列：5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’下游引物序列：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3’，每個(gè)樣本重復(fù)三次，取平均值為Ct值，用儀器自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，計(jì)算出△Ct值，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法比較目的基因mRNA的表達(dá)變化。

1.2.5Western blot法檢測(cè)HSC-T6中KLF4、Col Ⅰ、Col Ⅲ、MMP-13、TIMP-1及對(duì)照β-actin蛋白表達(dá):轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒 48 h后用PBS清洗細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞裂解物，移入EP管；離心，12 000 g,15 min，取上清液加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min，取上清待用。取細(xì)胞總蛋白80 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠120V電壓進(jìn)行電泳分離，之后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉(0.05%TBST配制)中封閉1 h，分別加入兔抗大鼠KLF4 (1∶500稀釋)，兔抗大鼠TIMP-1(1∶1 000稀釋)，兔抗大鼠MMP-13(1∶1 000稀釋)、兔抗大鼠Col Ⅰ(1∶1 500稀釋)、兔抗大鼠Col Ⅲ(1∶500稀釋)、兔抗大鼠β-actin(1∶3 000稀釋)孵育PVDF膜，4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。利用TBS配制的紅外染料標(biāo)記的二抗 IRDye800 Anti-Rabbit IgG (1∶15 000 稀釋)孵育PVDF膜，室溫1 h。TBS洗膜3次，每次10 min。利用Odyssey掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描顯影并保存圖像。

2　結(jié)果

2.1干擾質(zhì)粒對(duì)HSC-T6細(xì)胞KLF4的沉默效果3種干擾質(zhì)粒(pGPU6-1，pGPU6-2，pGPU6-3)以及陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞24 h后，應(yīng)用Real-time RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中KLF4的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用2-ΔΔCt法結(jié)果顯示，pGPU6-1組、pGPU6-2組和pGPU6-3組相對(duì)于對(duì)照組的KLF4 mRNA的表達(dá)分別是0.601±0.043，0.548±0.051和0.282±0.027(P<0.05)?？梢?jiàn)，pGPU6-3組對(duì)KLF4 mRNA的沉默效果最好。3種干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后48h，應(yīng)用western blot法檢測(cè)HSC-T6中KLF4的蛋白表達(dá)情況。與內(nèi)參蛋白β-actin相比， pGPU6-1組，pGPU6-2組和pGPU6-3組KLF4 蛋白表達(dá)分別是0.513±0.032，0.475±0.042和0.305±0.035(P<0.05)。與mRNA的結(jié)果類(lèi)似，pGPU6-3組對(duì)KLF4 蛋白的沉默效果最好。故后續(xù)試驗(yàn)均采用干擾質(zhì)粒pGPU6-3沉默KLF4的表達(dá)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2Real time RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中Col、Col Ⅲ、

組別KLF4mRNA(2-ΔΔCt)KLF4蛋白(protein/β-actin)對(duì)照組1.008±0.0220.901±0.028pGPU6-10.601±0.043*0.513±0.032*pGPU6-20.548±0.051*0.475±0.042*pGPU6-30.282±0.027*0.305±0.035*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染三種干擾質(zhì)粒 48 h后HSC-T6中KLF4的蛋白表達(dá)結(jié)果

mRNA以及western blot技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá) 干擾質(zhì)粒pGPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后24h，應(yīng)用Real time RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中Col Ⅰ、Col Ⅲ的mRNA表達(dá)情況。以Control組為對(duì)照組，Col Ⅰ、Col Ⅲ相對(duì)于Control組的mRNA的表達(dá)分別是0.358 ±0.038，0.298±0.041(P<0.05)。與mRNA的結(jié)果類(lèi)似，pGPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后48 h，應(yīng)用western blot法檢測(cè)HSC-T6中Col Ⅰ、Col Ⅲ的蛋白表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參照，Col Ⅰ，Col Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)分別下降為0.326±0.051和0.283±0.074(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

組別ColⅠmRNAlevel(2-ΔΔCt)ColⅠ蛋白(protein/β-actin)ColⅢmRNAlevel(2-ΔΔCt)ColⅢ蛋白(protein/β-actin)對(duì)照組1.007±0.0130.998±0.0121.003±0.0120.995±0.023pGPU6-30.358±0.038*0.326±0.051*0.298±0.041*0.283±0.074*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3Real time RT-PCR檢測(cè)HSCs中MMP-1、TIMP-1、MMP-13 mRNA以及Western blot技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。pGPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞后24h，應(yīng)用Real time RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中MMP-13、TIMP-1的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用2-ΔΔCt法結(jié)果顯示，以Control組為對(duì)照組，MMP-13、TIMP-1相對(duì)于Control組的mRNA的表達(dá)分別是1.712 ±0.034，0.478±0.048(P<0.05)見(jiàn)表3。與mRNA的結(jié)果類(lèi)似，pGPU6-3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后48 h，應(yīng)用western blot法檢測(cè)HSC-T6中MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參照，則MMP-1蛋白表達(dá)上升為1.273±0.038，而TIMP-1蛋白的表達(dá)下降為0.331±0.039(P<0.05)見(jiàn)表3，圖3。

圖2western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-3 48h后HSC-T6中ColI I、ColI III蛋白的表達(dá)結(jié)果

圖3western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-3 48h后HSC-T6中MMP-13、TIMP-1蛋白的表達(dá)

組別MMP-13mRNAlevel(2-ΔΔCt)MMP-13proteinlevel(protein/β-actin)TIMP-1mRNAlevel(2-ΔΔCt)TIMP-1proteinlevel(protein/β-actin)對(duì)照組0.991±0.0130.812±0.0411.005±0.0170.791±0.044pGPU6-31.712±0.034*1.273±0.038*0.478±0.048*0.331±0.039*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3　討論

肝纖維化過(guò)程中，一個(gè)重要的特征就是新合成的ECM增加速度超過(guò)了ECM的降解速度。實(shí)際上，肝纖維化的本質(zhì)就是由于 ECM合成與降解不平衡所導(dǎo)致ECM的過(guò)度沉積[1]。正常肝臟中ECM的主要成份是Col Ⅰ和Col Ⅲ，且以Col I的增加為主，Col Ⅰ的含量可以達(dá)到60%～70%，其他膠原所占比例較少。另外也包含一些非膠原成分，例如纖連蛋白，層連蛋白等成分[4]。這些ECM不斷地被基質(zhì)降解蛋白酶類(lèi)分解，維持動(dòng)態(tài)的平衡。肝星狀細(xì)胞HSCs是正常及纖維化肝臟中的ECM的主要合成細(xì)胞，其合成量是肝細(xì)胞的10倍、內(nèi)皮細(xì)胞的20倍以上[5]。同時(shí)，HSCs還能夠分泌多種酶類(lèi)來(lái)調(diào)節(jié)ECM的代謝。這些蛋白酶中最重要的是MMP。MMP能夠降解除多糖外的所有ECM。按其結(jié)構(gòu)和功能的差異，MMP共可分為四類(lèi)[6]：第一類(lèi)是間質(zhì)膠原酶(MMP-1，MMP-13等)，主要水解Col Ⅰ和Col Ⅲ等纖維類(lèi)膠原，在維持ECM的平衡中起著關(guān)鍵作用；第二類(lèi)是明膠酶(MMP-2，MMP-9)，主要水解明膠蛋白和變性膠原蛋白；第三類(lèi)是基質(zhì)水解酶(MMP-3，MMP-10等)，主要水解糖蛋白和Col IV等。第四類(lèi)是基膜型酶(MMP-7，MMP-12，MMP-12等)，具有激活其他MMP的作用。MMP的活性受三個(gè)水平的調(diào)節(jié)，即轉(zhuǎn)錄水平、膠原激活以及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的調(diào)節(jié)。TIMP家族共有四個(gè)成員TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，而肝臟中只有TIMP-1和TIMP-2，且TIMP-1 活力最強(qiáng)。TIMPs以1∶1的比例與MMPs形成高親和力復(fù)合物，抑制MMPs的活性,從而增加ECM的沉積[7]。研究表明，在大鼠肝纖維化自發(fā)恢復(fù)的模型中，MMP-13的表達(dá)水平是升高的，而TIMP-1的表達(dá)水平是逐漸下降的。相反，研究發(fā)現(xiàn)如果提高TIMP-1的表達(dá)，減少M(fèi)MP-13的表達(dá)，可以使大鼠的纖維化程度加深[8]。所以，如何在纖維化的肝臟中增加MMP-1以及大鼠中的MMP-13的表達(dá)，或者減少TIMP-1的表達(dá)，來(lái)減少肝纖維化中膠原的產(chǎn)生，減輕肝纖維化，已經(jīng)成為肝纖維化研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。例如，Hu等采用腺病毒載體將針對(duì)纖溶酶原激活物抑制劑-1基因的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入纖維化大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，肝纖維化程度明顯減輕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)MMP-13水平，而下調(diào)TIMP-1水平[9]。Ozaki等將肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子加入人HSC-LI90細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ColI表達(dá)量明顯減少，其機(jī)制可能是由于MMP-1表達(dá)量增加，促進(jìn)了膠原的降解[10]。

與上述研究類(lèi)似，因?yàn)镵LF4是Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成員，具有調(diào)節(jié)某些細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[3]，故本研究設(shè)計(jì)合成了針對(duì)大鼠靶向KLF4的RNA干擾質(zhì)粒載體，并篩選出沉默效果最好的干擾質(zhì)粒載體，通過(guò)沉默KLF4表達(dá)，使大鼠HSC-T6細(xì)胞的Col I和ColIII的表達(dá)明顯下降，同時(shí)MMP-13的表達(dá)增高以及TIMP-1的表達(dá)下調(diào)。綜上所述，KLF4是通過(guò)上調(diào)MMP-13以及下調(diào)TIMP-1的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)HSC-T6的膠原合成與代謝，降低了肝纖維化的程度，為肝纖維化的防治提供了新的研究方向。

1Lade A, Noon LA, Friedman SL. Contributions of metabolic dysregulation and inflammation to nonalcoholic steatohepatitis, hepatic fibrosis, and cancer.Curr Opin Oncol,2014,26:100-107.

2Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Hepatic Stellate Cells and Liver Fibrosis.Compr Physiol,2013,3:1473-1492.

3Wang C,Han M,Zhao XM, et al. Krüppel-like factor 4 is required for the expression of vascular smooth muscle cell differentiation marker genes induced by all-trans retinoic acid. J Biochem,2008,144: 313-321.

4Bittnerová1 L, Jiroutová1 A, Rudolf E, et al. Effect of collagen I gel on apoptosis of rat hepatic stellate cells. Acta Medica,2013,56: 73-79.

5Kordes C, Sawitza I, G?tze S, et al. Hepatic stellate cells contribute to progenitor cells and liver regeneration. J Clin Invest,2014,124:5503-5515.

6Murphy FR, Issa R, Zhou X, et al. Inhibition of apoptosis activated hep atic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition: implications for reversibility of liver fibrosis.J Biol Chem,2002,277:11069-11076.

7Hasegawa-Baba Y, Doi K. Changes in TIMP-1 and -2 expression in the early stage of porcine sennn-indncedliver fibrosis in rats.Exp Toxicol Patbol,2011,63 :357-361.

8Yoshiji H， Kuriyanta S， Miyamoto Y，et al.Tissuc inhibitor mctalloprotcinasc-1 promotes liver fibrosis development a transonic mouse model.Hepatology 2000,32:1248-1254.

9Hu PF, Chen H, Zhong W, et al. Adenovirus-mediated Transfer of siRNA against PAI-1 mRNA ameliorates hepatie fibrosis in rats. Journal of Hepatology,2009，51:102-113.

10Ozaki I, Zhao G, Mizuta T, et al. Hepatocyte growth factor induces collagenase (matrix metalloproteinase-1) via the transcription factor Ets-1 in human hepatic stellate cell line.Journal of Hepatology,2002,36:169-178.

Effects and action mechanism of KLF4 gene silence on collagen metabolism in hepatic stellate cells of rats

LITao*,NIULijuan,LIUWenxuan*,etal.

*DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealth,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

ObjectiveTo investigate the effects of silencing KLF4 expressions on collagen metabolism in hepatic stellate cells-T6 (HSC-T6) of rats.MethodsThe three interference plasmids (pGPU6-1,pGPU6-2,pGPU6-3) targeting at KLF4 gene of rats and negative control plasmid were designed and established.The expression levels of KLF4 mRNA and protein were detected by real time fluorescent quantitation RT- PCR (Real-time RT- PCR) and Western Blot to select out the interference plasmid that had the best silencing effects. Then the interference plasmid (pGPU6-3) was transfected into HSC-T6 cells of rats.On 24h and 48h after transfection, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen,matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) mRNA and protein were detected by Real-time RT- PCR and Western Blot,respectively. Real-time RT-PCR data were analyzed and calculated by 2-ΔΔCtmethod by taking GAPDH as an internal reference,however, Western Blot examination results were analyzed by using β-actin as internal reference protein.ResultsThe examination results by Real-time RT- PCR showed that after HSC-T6 cells of rats were transfected by pGPU6-3, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen and TIMP-1 were decreased by 0.358±0.038,0.298±0.041, 0.478±0.048, respectively, however, the expression levels of MMP-13 mRNA were increased by 1.712±0.034. The Western Blot showed that after HSC-T6 cells of rats were transfected by pGPU6-3, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen and TIMP-1 were decreased by 0.326±0.051,0.283±0.074,0.331±0.039,respectively,however, the expression levels of MMP-13 were increased by 1.273±0.038.ConclusionThe KLF4 gene silencing can significantly decrease the expression levels of typeⅠcollagen and type Ⅲ collagen in HSC-T6 cells of rats,and its action mechanism may be correlated to increasing the expressions of MMP-13 and inhibiting the expressions of TIMP-1.

rat hepatic stellate cells; KLF4;typeⅠcollagen；type Ⅲ collagen；MMP-13

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.009

050017石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室(李濤、劉文宣、楊磊、李曼、曹丹丹)；河北省石家莊市第三醫(yī)院腫瘤科(牛麗娟)；河北省石家莊市第三醫(yī)院老年病科(彭亂順)

彭亂順，050011河北省石家莊市第三醫(yī)院老年病科；

E-mail：litao771018@163.com

R 575.2

A

1002-7386(2016)20-3080-05

2016-03-29)

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào)：20150627)