富氧條件下活性氧和初始Fe2+濃度對難處理金精礦生物氧化過程的影響

王 紅, 王兆印, 張 旭, 朱明龍, 譚文松

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富氧條件下活性氧和初始Fe2+濃度對難處理金精礦生物氧化過程的影響

王 紅, 王兆印, 張 旭, 朱明龍, 譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室, 上海200237)

提高難處理金精礦生物氧化過程中的礦石氧化效率、縮短氧化周期是當(dāng)前亟待解決的問題。氧是生物氧化過程中的電子受體，Fe可為鐵氧化細菌提供能量，氧氣和Fe2+的充足供應(yīng)將有利于提高菌株的生物氧化活性，而富氧條件下(氧得到充足供應(yīng))冶金菌株對能源物質(zhì)Fe2+的需求尚未見公開報道。今在實驗室1.5 L通氣攪拌釜式反應(yīng)器中，利用以和為主的混合浸礦菌對黃鐵礦包裹的難處理金精礦進行生物氧化，深入研究溶氧水平(DO)和礦漿初始Fe2+濃度對生物氧化過程效率的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶解氧水平提高時，生物氧化效率會呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且隨DO水平提高，ROS含量明顯上升。富氧條件下(4.0 ppm)隨著初始Fe2+濃度的提高，冶金菌株氧化活性在過程初期受到抑制，后期得到增強，ROS含量隨初始Fe2+濃度的提高不斷增加，而菌體生長卻一直受到抑制，最終導(dǎo)致礦石氧化效率的降低。

難處理金精礦；生物氧化；溶氧；氧化自由基；Fe2+濃度

1 前 言

目前在工業(yè)應(yīng)用上取得了一定進展，但由于存在菌體增長速度緩慢，氧化周期較長等問題嚴(yán)重限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用[1]。浸礦菌氧化還原性硫和二價鐵獲得能量維持生長，將得到的電子通過電子傳遞鏈傳遞給氧氣，因此充足的氧供應(yīng)(即富氧條件)對微生物快速高效地進行氧化反應(yīng)至關(guān)重要，由于使用的礦石、菌種、反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和反應(yīng)條件不同，不同研究關(guān)于氧的供應(yīng)存在較大差異。de Cock等[2]用古菌浸礦時發(fā)現(xiàn)，DO高于1.5 ppm時就不會發(fā)生氧限制，也有報道[3]稱限制性DO濃度為0.1 ppm。然而，Gericke等[4]用極端嗜熱菌浸出黃銅礦精礦時總結(jié)出當(dāng)DO高于50%飽和溶氧時才不會發(fā)生氧限制。有研究表明，礦石的生物氧化速率和菌體的比生長速率隨著溶氧(DO)濃度提高而增大[5]，然而溶氧也不是可以無限增大，當(dāng)溶解氧處于較高水平時，進一步提高DO時，卻會導(dǎo)致生物氧化效率增長減慢。因此，對于特定的氧化系統(tǒng)仍需要實驗確定最佳的溶氧水平，本實驗所用富含黃鐵礦的金精礦在氧化過程中需要消耗較多的氧氣，常規(guī)空氣進氣不能滿足其氧化過程中對氧的需求，理論上，富氧條件下氧分壓增大，氧傳質(zhì)速率增加，對生物氧化效率的提高有明顯的促進作用，而現(xiàn)有報道對于其在富氧條件下的氧化情況研究較少，為此本論文對富氧條件下的礦石氧化、菌體生長和活性等方面進行了深入細致的研究。此外，F(xiàn)e2+是鐵氧化浸礦菌較易利用的能源物質(zhì)，溶液中Fe2+可為細菌提供能源物質(zhì)，加快浸礦菌的生長繁殖速度，進而對礦石的生物氧化產(chǎn)生影響[6]，另外初始添加Fe2+的量也影響到浸礦反應(yīng)后期鐵沉淀的生成量，沉淀量增多會覆蓋在礦石顆粒表面減慢反應(yīng)速率，所以研究初始Fe2+濃度對生物預(yù)處理難處理金精礦的影響具有非常重要的意義，特別是在富氧條件下，冶金菌株對能源物質(zhì)Fe2+的需求情況也會影響到后續(xù)改進策略的建立，關(guān)于這方面的研究尚未見公開報道。

為此本研究重點考察富氧條件下DO對生物氧化過程效率、活性氧含量的影響，并研究了富氧條件下Fe2+初始濃度對生物氧化過程效率的影響。希望深入探究氣體及能源物質(zhì)供應(yīng)對生物氧化過程的影響機制，為生物冶金的進一步發(fā)展提供技術(shù)支持和科學(xué)指導(dǎo)。

2 實驗材料和方法

2.1 菌種和培養(yǎng)基

本實驗所用菌種由新疆某金礦提供，采用高通量測序的方法對菌種16S rDNA V4區(qū)進行測序分析，混合菌群中細菌所在的屬主要為(78%)和(13%)。使用時將冰箱中凍存的原始菌種加入到10 %(wt)濃度的礦漿中，使初始pH為1.40，溫度41℃，200 r×min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后作為種子進行接種。

實驗所用培養(yǎng)基為9K培養(yǎng)基[7]，組成為(g×L-1)：(NH4)2SO43.0，KCl 0.1，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，Ca (NO3)20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 44.2，濃硫酸調(diào)節(jié)pH至1.40。

2.2 實驗礦樣

實驗所用礦樣由新疆某金礦提供，其中Au含量為(45±1)g×t-1，Ag含量為(60±2) g×t-1，其他元素含量分別為Fe (28±1)%，S (28±2)%，As含量在3%~4%，基本不含C、Cu、Pb、Zn。礦石的XRD分析結(jié)果顯示，礦物主要成分為黃鐵礦和石英石。礦樣經(jīng)磨細后篩分，用于實驗的礦石粒徑在63 ~90 μm。

2.3 實驗方法

2.3.1 DO對難處理金精礦生物氧化的影響

在1.5 L實驗室中加入900 mL無鐵9K培養(yǎng)基和100 g難處理金精礦，100 mL種子液，設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速為300 r×min-1，初始pH為1.40，溫度41℃。本實驗為考察提高DO對生物氧化過程的影響，控制DO分別為2.51 ppm，3.75 ppm，5.01 ppm，7.51 ppm(對應(yīng)40%，60%，80%，120%)。四組實驗中空氣流量始終相同，通過控制通入純O2量以實現(xiàn)不同溶氧濃度。每天定時取樣，離心后測定上清的pH、Eh、Fe2+濃度、Fe3+濃度、菌體量，并測定OUR(攝氧率)的變化。取對數(shù)生長期菌體測定菌體內(nèi)活性氧含量。

2.3.2 Fe濃度對難處理金精礦生物氧化的影響

為考察富氧條件下初始Fe2+濃度對難處理金精礦生物氧化效率的影響關(guān)系，本研究在三個反應(yīng)器的培養(yǎng)基中分別加入1)0 g×L-1的Fe2+；2)1 g×L-1的Fe2+；3)6 g×L-1的Fe2+，控制初始Fe2+濃度分別為：0.14，1.11，5.99 g×L-1Fe2+，為保證富氧條件，實驗過程中通過富氧空氣將DO控制在4.0 ppm，其余條件分別為：礦漿濃度10%(wt)，攪拌轉(zhuǎn)速300 r×min-1，初始pH 1.40，溫度41℃，接種量10%(v/v)。每天定時取樣，離心后測定溶液的pH、Eh、Fe2+濃度、Fe3+濃度和菌體量。并跟蹤測定過程中OUR的變化。

2.4 測定和分析方法

使用 pH/Eh 計測量礦漿的pH 和 Eh (Mettler model FE20)，DO采用溶氧電極 (OXYFERM 225, Hamilton)測量。礦石溶解情況通過礦漿溶液中鐵離子濃度測定，F(xiàn)e3+濃度采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)溶液絡(luò)合滴定法[8]進行測定，F(xiàn)e2+濃度通過重鉻酸鉀滴定的方式[9]進行測定，總鐵濃度為Fe3+濃度和Fe2+濃度之和。OUR可以采用動態(tài)法[10]測定。由于本實驗所用浸礦菌絕大多數(shù)吸附在礦石上，顯微鏡觀察液相中游離細菌數(shù)極少，且細菌與礦石吸附緊密不易獲得，故菌體量的測定采用Bradford法[11]，即考馬斯亮藍(CBB)測定礦石上吸附菌菌體蛋白量的方法來估測細菌數(shù)量，取0.2 g 烘干的礦樣，加入3 mL 濃度為0.2 mol×L-1的NaOH 溶液，沸水浴15 min 后，定容至5 mL，取1 mL 稀釋一定倍數(shù)的消化液，加入4 mL考馬斯亮藍染色液，5 min后測定595 nm 波長處的吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比即知蛋白量?；钚匝鯔z測取對數(shù)生長中后期菌體，采用DCFH法[12]進行。

礦石的氧化率 () 和氧化速率 () 通過以下方法計算[13]：

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 DO對礦石生物氧化的影響

DO對礦石生物氧化過程的影響如圖1所示。如圖1 A和1 D，F(xiàn)e3+濃度和礦石氧化率隨著生物氧化過程進行而增大，且隨DO濃度升高，二者均先增加后降低。3.75 ppm DO時，F(xiàn)e3+濃度最高，F(xiàn)e2+濃度最低，表明此時礦石氧化效果最好。值得注意的是，DO高于5.01 ppm時，礦石氧化受到抑制，此時的礦石氧化速率和氧化率均低于3.75 ppm DO。可見，DO為3.75 ppm已經(jīng)足夠維持高的礦石氧化速率，繼續(xù)升高DO對氧化不利且會造成資源浪費。De kock[2]等提出，4.1 ppm及以上溶氧濃度為抑制性溶氧濃度，這與本研究的結(jié)果非常接近。

從圖 1 C 可以看出，隨溶氧濃度增大，氧化速率先增加后下降，3.75 ppm DO時生物氧化速率達到最大。氧作為電子傳遞鏈的最終電子受體 ，當(dāng)DO低于3.75 ppm時會因氧供應(yīng)不足限制生物氧化的進行，然而，繼續(xù)增加DO也會導(dǎo)致氧化效率降低，這可能是高溶氧對微生物的毒害作用[14]。

浸礦菌生活在低pH、高可溶性金屬濃度和高氧消耗的環(huán)境中，極易產(chǎn)生活性氧[15]，同時，溶氧濃度增加會導(dǎo)致產(chǎn)生更多的活性氧[16]，這些活性氧可能是高溶氧條件下生物氧化效率下降的重要原因[17]。Imlay[18]發(fā)現(xiàn)，細胞外的H2O2可以持續(xù)通過細胞膜擴散進入細胞質(zhì)，在那里與不穩(wěn)定的鐵離子形成 ?OH。有證據(jù)表明，一定條件下黃鐵礦表面可以持續(xù)產(chǎn)生活性氧，尤其在pH低于3的時候，即活性氧的產(chǎn)生并不局限于與溶液接觸的初始階段[19,20]，因此活性氧對微生物氧化具有很大的影響。胞內(nèi)活性氧含量是否會隨著環(huán)境DO水平的變化而變化呢？是否與礦石氧化效率之間存在某種對應(yīng)關(guān)系呢？為此，本研究對不同DO條件下菌體內(nèi)ROS含量進行了考察。

本實驗采用DCFH法對各溶氧水平下菌體內(nèi)活性氧含量進行了檢測，測定結(jié)果如圖2。可以看到，隨溶氧水平提高菌體內(nèi)活性氧含量呈上升趨勢。Cárdenas等人[14]發(fā)現(xiàn)浸礦微生物缺乏消除活性氧的酶，僅靠大分子修復(fù)系統(tǒng)對受損的DNA、蛋白質(zhì)等進行修復(fù)，因此更易受到活性氧的毒害，高溶氧水平下活性氧的大量產(chǎn)生會對菌體活性產(chǎn)生更多的不利影響[17]，降低礦石氧化速率[16]，這或許能夠解釋為什么為浸礦微生物提供更多的溶氧反而使生物氧化效率下降。

圖3 A顯示了不同DO水平下浸出液的pH值，在整個生物氧化過程中，pH值先略有上升后隨時間下降。因為生物氧化初期，菌體濃度低活性差，礦石氧化主要是通過化學(xué)氧化[21]：

該反應(yīng)是耗酸過程，因此浸礦初期pH值上升。隨浸礦過程進行，浸礦菌不斷氧化黃鐵礦生成H2SO4，浸出液pH也不斷下降。相同浸礦時間3.75 ppm DO時pH值最低，表明此溶氧水平時礦石氧化生成H2SO4的速率最大。

觀察圖3B，生物氧化開始后，四個DO水平下浸出液的Eh值均先下降后上升。因為接種后菌體氧化活性低，導(dǎo)致浸出液中Fe3+化學(xué)氧化產(chǎn)生的Fe2+不能快速被細菌氧化，由方程：

可知，Eh與溶液中[Fe3+]/[Fe2+]呈正相關(guān)，因此隨菌體數(shù)量增加和氧化活性增強，對Fe2+氧化加快，F(xiàn)e2+迅速被氧化成Fe3+，導(dǎo)致Eh值出現(xiàn)上升。由于3.75 ppm DO時Fe2+氧化的速度更快，導(dǎo)致同時間3.75 ppm DO時的Eh值高于其他溶氧水平。

OUR是發(fā)酵過程中一個非常重要的參數(shù)，它反映了整個菌群的代謝活性。如圖4，氧化過程中OUR大小依次是：OUR(3.75 ppm)＞OUR(5.01 ppm)＞OUR(2.51 ppm)＞OUR(7.51 ppm)，反映出了菌群代謝活性在3.75 ppm DO時最高，溶氧低于3.75 ppm時，供氧不足導(dǎo)致OUR較低，溶氧高于3.75 ppm DO時，如前所述，由于高溶氧水平下會產(chǎn)生更多的活性氧，其對菌體產(chǎn)生的毒害可能是OUR下降的重要原因。

圖4 B為不同溶氧條件下，生物氧化過程中菌體的生長情況，由蛋白含量表示。由實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，菌體量隨氧化過程進行而增多，隨生長進入穩(wěn)定期而維持平穩(wěn)水平，各溶氧水平下菌體量差別不大。根據(jù)前面的分析，溶氧水平高于和低于3.75 ppm時，礦石氧化率和氧化速率均下降，但從菌體量的變化來看菌體量并未發(fā)生明顯下降，因此溶氧主要是通過影響菌體活性而非菌體量的方式影響了生物氧化效率。

3.2 初始Fe2+濃度對礦石生物氧化的影響

圖5顯示了初始Fe2+濃度對礦石生物氧化的影響。圖5 A可見，第1天時5.99 g×L-1初始Fe2+濃度的實驗組礦漿中Fe3+濃度突然升高并在之后維持較高水平，是因為開始時加入了較多的Fe2+，而Fe2+是細菌較易利用的能源物質(zhì)，第1 天時就被大量氧化成為Fe3+，故維持了較高的Fe3+濃度。

圖5 B是Fe2+濃度的變化圖，除了對照組Fe2+濃度在第1天稍有升高之后不斷下降外，另兩組浸出液中Fe2+濃度第1天開始就大幅下降，可見相比于礦石中的二價鐵，礦漿中的Fe2+更易被浸礦菌所利用。

從圖5 C和5 D可以看到富氧條件下添加Fe2+在浸礦前期降低了礦石的氧化速率和氧化率，但隨著浸礦過程進行，氧化速率會逐漸增大，氧化率也會逐漸接近對照組。

雖然很多研究均表明，初始Fe2+濃度存在一個最佳值，隨Fe2+濃度的升高細菌對礦石的氧化速率先增大后降低，但本研究結(jié)果顯示，升高初始Fe2+濃度對浸礦并沒有促進作用。Jones等[22]在研究黃鐵礦細顆粒對活性氧(ROS)產(chǎn)生及浸礦的影響時發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生隨著黃鐵礦表面積負荷和溶液中Fe2+濃度的升高而增多，而ROS會顯著降低細菌生長和Fe2+氧化速率，本實驗在富氧條件下進行，較常規(guī)溶氧水平產(chǎn)生了更多的ROS，此時再提高Fe2+濃度，礦漿中ROS含量進一步提升，對細菌產(chǎn)生了強烈的抑制作用，故初始Fe2+濃度提高未對礦石氧化產(chǎn)生積極作用，而是降低了氧化速率和氧化率。為考察不同F(xiàn)e2+濃度下活性氧含量，本研究對菌體內(nèi)ROS含量進行了檢測，結(jié)果如圖6，從圖中可以看出，隨Fe2+濃度升高，菌體內(nèi)ROS含量顯著升高，與Jones等人的研究結(jié)果一致[22]。

觀察圖7 A，隨著初始Fe2+濃度增大，相同浸礦時間pH值出現(xiàn)上升，礦石氧化生成H2SO4的速率降低。4天后，5.99 g×L-1初始Fe2+濃度的實驗組pH開始低于1.11 g×L-1初始Fe2+濃度的實驗組，表明其菌體氧化礦石生成H2SO4的能力不斷增強。

圖7 B顯示了初始Fe2+濃度對難處理金精礦氧化過程中Eh的影響，生物氧化過程中三組實驗的Eh值總體均呈上升趨勢，生物氧化開始后，除了對照組浸出液的Eh值先下降后上升，其他兩組實驗的Eh均不斷上升，由Nernst方程可知，Eh與溶液中CFe3+/CFe2+呈正相關(guān)，由于Fe2+極易被浸礦菌氧化產(chǎn)生Fe3+，在補加了Fe2+的實驗組中CFe3+/CFe2+的值迅速增大，故Eh值迅速上升，并且隨著氧化活性的不斷增強Fe2+越來越少，F(xiàn)e3+不斷增加，Eh值不斷增大。

OUR反映了整個菌群的代謝活性，觀察圖8 A，三組實驗中OUR在整個氧化過程中均呈不斷上升趨勢，表明菌群代謝活性不斷增強。初始Fe2+濃度為1.11 g×L-1時OUR在第1天低于對照組，第2天開始高于對照組，表明菌體活性在初始階段受到了抑制，而初始Fe2+濃度為5.99 g×L-1時在前2天 OUR均低于不添加Fe2+的組，說明其受抑制的程度高于1.11 g×L-1的初始Fe2+濃度，可見高Fe2+濃度會抑制菌體活性，且抑制作用隨Fe2+濃度增高而加強。隨著反應(yīng)進行，添加Fe2+的實驗組菌體活性逐漸增強，且在第5天對照組OUR開始出現(xiàn)下降時實驗組OUR仍在增大，這可能是由于隨Fe2+消耗，ROS產(chǎn)生量減少，抑制作用減弱，菌群的OUR開始不斷升高。

從圖8 B初始Fe2+濃度對菌體生長的影響可以看出，初始Fe2+濃度對菌體生長影響顯著，1.11 g×L-1初始Fe2+濃度與對照組相比菌體生長狀況相似，而當(dāng)初始Fe2+濃度達到5.99 g×L-1時，菌體量較另外兩組顯著減少，這也與溶液中Fe2+濃度升高ROS增多，抑制細菌生長有關(guān)，另外亞鐵離子濃度增加導(dǎo)致的滲透壓改變也可能是抑制菌體生長的原因。

4 結(jié) 論

(1) 試驗范圍內(nèi)，礦漿體系中3.75 ppm的溶氧水平足以滿足礦石生物氧化過程所需，單純再提高溶氧不能提高礦石氧化率，過高溶氧會產(chǎn)生大量的ROS反而對細菌有害，對氧化效果不利。采用Hansford邏輯方程對不同溶氧水平下的礦石氧化過程進行擬合發(fā)現(xiàn)最大速率常數(shù)m在DO 3.75 ppm時最大，隨DO繼續(xù)上升而減?。淮藭r，礦石最大氧化率m達到最大值76.82%。實驗發(fā)現(xiàn)礦漿中的活性氧含量隨溶解氧水平的增加而增多。

(2) 不同溶解氧水平下菌體攝氧率OUR大小依次是：OUR(3.75 ppm)＞OUR(5.01 ppm)＞OUR(2.51 ppm)＞OUR(7.51 ppm)，表明DO在3.75 ppm時菌群代謝活性最高。

(3) 試驗范圍內(nèi)，富氧條件下(4.0 ppm)初始Fe2+濃度的提高會降低礦石的氧化率、抑制菌體的生長。而菌群氧化活性在氧化初期受到抑制，后期得到加強。富氧條件下(3.75 ppm)隨Fe2+濃度升高，菌體內(nèi)ROS含量顯著升高，抑制礦石氧化。

符號說明：

[Fe]p? 氧化前礦石內(nèi)含有的鐵若全部浸出礦漿中的ti? 任意i時刻，h 總鐵濃度，g×L-1tj? 任意j時刻，h [Fe]ti? 任意i時刻時礦漿中的總鐵濃度，g×L-1t0? 初始時刻，h [Fe]tj? 任意j時刻時礦漿中的總鐵濃度，g×L-1λ? 礦石的氧化率，% [Fe]t0? 初始時刻的[Fe]t0總鐵濃度，g×L-1υ? 礦石氧化速率，g×L-1h-1

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Effects of Reactive Oxygen and Fe2+Concentration on Biooxidation of Refractory Gold Concentrates under Oxygen-Rich Conditions

WANG Hong, WANG Zhao-yin, ZHANG Xu, ZHU Ming-long, TAN Wen-song

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Adequate supply of oxygen as a final electron acceptor was essential for biological oxidation processes, and Fe2+in pulp can provide energy for iron oxidizing bacteria and help to improve their biooxidation activity. However, the demand for Fe2+of biooxidation strain under oxygen-rich conditions has not been reported publicly. In this study, a mixed bioleaching bacteria strain (and)was used to pretreat refractory gold concentrates in a 1.5L laboratory stirred tank reactor. The effects of dissolved oxygen (DO) and Fe2+concentration on the biooxidation process were investigated. The results show that biooxidation efficiency increases at first and then decreases as the DO level elevated. In addition, the ROS content within the bacterial cells significantly increases as the DO level increased.initial Fe2+concentration under oxygen-rich conditions, the oxidative activity of theis inhibited in the beginning and enhancedand the content of ROS increases, but the cell growth is inhibited throughout the whole process, which leads to the decrease of biooxidation efficiency.

refractory gold concentrates; biooxidation; dissolved oxygen; reactive oxygen species (ROS); Fe2+concentration

1003-9015(2016)01-0104-08

TF18

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.01.016

2014-09-24；

2014-12-16

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2007AA060904，2012AA061503)。

王紅(1988-)，女，山東煙臺人，華東理工大學(xué)碩士生。通訊聯(lián)系人：張旭，E-mail：zhangxu@ecust.edu.cn