（+）γ-內酰胺酶菌株BH24發(fā)酵產酶條件優(yōu)化

張旭姣，遲乃玉，2，楊麗娜，王曉輝，張慶芳*

（1.大連大學生命科學與技術學院遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

（+）γ-內酰胺酶菌株BH24發(fā)酵產酶條件優(yōu)化

張旭姣1，遲乃玉1，2，楊麗娜1，王曉輝1，張慶芳1*

（1.大連大學生命科學與技術學院遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

基于單因素試驗，通過Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗設計、中心組合試驗設計和響應面分析，對（+）γ-內酰胺酶菌株BH24發(fā)酵產酶進行優(yōu)化。單因素試驗結果表明，在碳源為5.0 g/L葡萄糖、氮源為10.0 g/L蛋白胨、溫度26.0℃、pH 8.0、接種量4.0%、裝液量100 mL/500 mL、轉速150 r/min條件下，菌株BH24的生物量、（+）γ-內酰胺酶酶活力及產物e.e.值均有不同程度的提高。響應面優(yōu)化結果表明，當葡萄糖質量濃度為4.0 g/L，溫度為25.2℃，pH值為7.6時，（+）γ-內酰胺酶酶活可達114.5 U/L，比優(yōu)化前提高了50.7%。

（+）γ-內酰胺酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；響應面法

γ-內酰胺酶是催化酰胺類化合物γ-內酰胺酰胺鍵的一種新型酰胺酶［1］。光學純的（-）γ-內酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體［2］，是抗艾滋病藥物（-）阿巴卡韋和（-）卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料［3-4］。（+）γ-內酰胺酶能夠高效率動力學拆分外消旋體γ-內酰胺，獲得光學純的（-）γ-內酰胺［5］。運用生物酶法進行工業(yè)化生產（-）γ-內酰胺，具有反應條件溫和，產物光學純度高，環(huán)境友好等優(yōu)點［4］。此外，在酶催化的基礎研究方面，因此類酶的個體一般具有多重的酶催化活性［6-7］，這種多重活力對于研究相關酶的催化機理之間的聯(lián)系［8］以及這些酶之間的進化關系具有非常重要的科學意義。本研究從環(huán)境微生物中分離篩選出一株高產（+）γ-內酰胺酶菌株BH24，為了進一步研究其最優(yōu)發(fā)酵條件，在單因素試驗基礎上，使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，通過Plackett-Burman試驗設計，從8個過程變量中篩選出最重要的因素，通過Box-Behnken試驗設計對響應過程變量進行數(shù)學建模分析，進一步優(yōu)化響應因子，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件［9-10］，為該（+）γ-內酰胺酶進一步研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：篩選自大黑山土壤，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），命名為菌株BH24?，F(xiàn)由大連大學遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

異丙醇、乙腈、正丁醇均為色譜純，其他試劑為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司。

菌株初始發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO40.4 g/L，F(xiàn)eSO40.02 g/L，CaCl20.02 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，調節(jié)pH7.0。

1.2儀器與設備

LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquidchromatography，HPLC）：日本島津公司；CHIRALPAKAS-H（250 mm×4.6 mm）手性色譜柱：日本大賽璐公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件基礎上，通過對培養(yǎng)基的碳源、氮源及培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、通氣量、轉速進行考察，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

1.3.2PB試驗設計

在單因素搖瓶發(fā)酵試驗的基礎上，將篩選出的影響（+）γ-內酰胺酶菌株BH24發(fā)酵因素蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、吐溫-80、pH值、溫度，分別作為PB試驗的考察對象，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，選用Plackett-Burman設計，因素與水平見表1。

表1　Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.3最陡爬坡試驗設計

根據(jù)PB試驗得到3個最顯著因素，對這3個因素進行最陡爬坡試驗設計。由PB試驗設計的效應評價結果可知，其中兩個因素應按一定步長逐漸增大，另一個因素應按一定步長逐漸減小，以尋找最大響應區(qū)。

1.3.4中心組合試驗設計

將最陡爬坡試驗結果中酶活最高的一組作為中心組合試驗中心點，確定3因素3水平，運用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件進行Box-Behnken試驗設計。試驗因子和編碼水平見表2。每組試驗重復3次取平均值，運用上述軟件分析得到最優(yōu)結果，并對預測值進行驗證。

表2　Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.5測定方法

酶活測定方法：取發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，得到的濕菌體經0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗滌3次，將菌體均勻懸浮于等體積（±）γ-內酰胺質量濃度為10 g/L的緩沖液中（0.05 mol/L，pH 7.0），28℃、150 r/min條件下反應8 h。10 000 r/min離心，取上清液。上清液經正丁醇萃取后，再經有機濾膜過濾制成上樣樣品，每組試驗平行3次。手性HPLC分析上樣樣品中（±）γ-內酰胺的濃度，并計算發(fā)酵液的酶活（U/L）。

酶活定義：在28℃條件下，每分鐘水解1 μmol（+）γ-內酰胺所需要的酶量為一個酶活單位（U）。相對酶活力以每組實驗中所產酶活力最高為100%。

產物對映體過量（enantiomeric excess，e.e.）值的計算：

式中：C-為（-）γ-內酰胺濃度，mmol/mL；C+為（+）γ-內酰胺

濃度，mmol/mL。

菌體干質量測定方法：取發(fā)酵液8000r/min離心15min，離心獲得的濕菌經0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）洗滌3次，65.0℃烘干至質量恒定，計算菌體干質量（g/L），每組試驗平行3次。

2　結果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基對BH24生長和產酶的影響

2.1.1碳源對菌株BH24生長和產酶的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別添加質量濃度為5.0 g/L的可溶性淀粉、檸檬酸、蔗糖、乳糖、麥芽糖替換菌株BH24發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，與添加質量濃度為5.0 g/L葡萄糖為碳源進行比較，結果如圖1所示。

圖1　碳源對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖1可知，不同碳源對菌株BH24的生長和酶活有較大的影響。以葡萄糖或麥芽糖為唯一碳源時，菌體干質量、酶活和產物e.e.值均較高，其中葡萄糖在酶活上略有優(yōu)勢。綜合考慮菌體干質量、e.e.值和酶活3個指標，選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.1.2葡萄糖添加量對菌株BH24生長和產酶的影響

改變培養(yǎng)基中葡萄糖的質量濃度，其他成分和含量不變，培養(yǎng)獲得的菌體進行（±）γ-內酰胺的轉化，結果如圖2所示。

圖2　葡萄糖質量濃度對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.2 Effect of glucose content on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖2可知，當葡萄糖質量濃度為1.25～5.0g/L時，菌體干質量與酶活均逐漸增大；當質量濃度為5.0g/L時，菌體干質量、酶活和產物e.e.值均達到最大值；當質量濃度＞5.0g/L后，菌體干質量與酶活迅速下降。綜合考慮以上因素，故選擇葡萄糖質量濃度為5.0 g/L。

2.1.3氮源對菌株BH24生長和產酶的影響

在以葡萄糖為培養(yǎng)基碳源基礎上，分別添加質量濃度為5 g/L的蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二銨、氯化銨、尿素替換菌株BH24發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，與添加質量濃度為5 g/L酵母膏為氮源進行比較。結果如圖3所示。

圖3　氮源對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖3可知，菌株BH24在以3種無機氮源為氮源的培養(yǎng)基中生長情況很差。以牛肉膏或蛋白胨為唯一氮源時，菌體干質量和酶活較高，但對于產物e.e.值，添加牛肉膏為氮源略低于添加蛋白胨；酵母膏為氮源時，菌體生長狀況良好，但產物的e.e.值較低。綜合考慮以上因素，選擇蛋白胨作為氮源，以促進菌體生長產，保證產酶的活性。

2.1.4蛋白胨添加量對菌株BH24生長和產酶的影響

改變培養(yǎng)基中蛋白胨的質量濃度，將培養(yǎng)獲得的菌體進行（±）γ-內酰胺的轉化，結果如圖4所示。

圖4　蛋白胨質量濃度對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.4 Effect of peptone content on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖4可知，當?shù)鞍纂速|量濃度為5.0～10.0 g/L時，菌體干質量與酶活均逐漸增大；當質量濃度為10.0 g/L時，菌體干質量、酶活和產物e.e.值均達到最大值；當質量濃度＞10.0 g/L后，菌體干質量與酶活開始下降。綜合考慮以上因素，故選擇蛋白胨質量濃度為10.0 g/L。

2.1.5發(fā)酵溫度對菌株BH24生長和產酶的影響

在微生物生長過程中，溫度是影響其代謝過程的重要因素，結果如圖5所示。

圖5　發(fā)酵溫度對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖5可知，當溫度低于26℃時，菌體干質量和酶活均隨溫度的升高而增加，產物的e.e.值隨沒有明顯的變化；當溫度為28℃時，菌體干質量達到最大值，但其余指標均大幅下降，32℃時菌體幾乎停止生長。由于在26℃時e.e.值和產酶量均達到最大值，綜合考慮各因素，確定26℃為最適發(fā)酵溫度。

2.1.6培養(yǎng)基初始pH值對菌株BH24生長和產酶的影響

在微生物生長過程中，pH是影響其代謝過程的又一重要因素，不僅影響菌體的生長，而且對其代謝中各種酶的活性具有調節(jié)作用。在前期試驗基礎上，改變培養(yǎng)基初始pH值，以pH 8.0時酶活為100%，結果如圖6所示。

由圖6可知，（+）γ-內酰胺酶酶活和菌體干質量在pH 5.0～8.0范圍內逐漸升高，在pH 8.0時達到最高，pH＞8.0后均逐漸降低。綜合以上因素，最終確定菌體的最適生長和產酶的初始pH值為8.0。

圖6　培養(yǎng)基初始pH對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on cell growth and enzyme production of strain BH24

2.1.7接種量對菌株BH24生長和產酶的影響

相關研究表明，接種量太小，菌體生長量不足，會導致微生物產酶量下降；接種量太大，會導致發(fā)酵初期營養(yǎng)消耗過快和缺乏氧氣，影響酶產量，接種量對菌株BH24生長和產酶的影響結果如圖7所示。

圖7　接種量對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖7可知，在接種量為4%時，產物e.e.值和（+）γ-內酰胺酶活達到最大；接種量為6%時雖然菌體干質量達到最大，但其余指標下降較多。綜合以上因素，選擇最適接種量為4%。

2.1.8裝液量對菌株BH24生長和產酶的影響

圖8　裝液量對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.8 Effect of liquid volume on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖8可知，裝液量對（+）γ-內酰胺酶的發(fā)酵具有重要的影響。當裝液量為100 mL/500 mL時，生物量和（+）γ-內酰胺酶的活力達到最大，此后隨著裝液量的增多，酶活與e.e.值逐漸降低。該結果說明（+）γ-內酰胺酶發(fā)酵的適宜裝液量為100 mL/500 mL。

2.1.9轉速對菌株BH24生長和產酶的影響

圖9　轉速對菌株BH24菌體生長和發(fā)酵產酶的影響Fig.9 Effect of rotating speed on cell growth and enzyme production of strain BH24

由圖9可知，轉速為150 r/min時，e.e.值、菌體干質量和（+）γ-內酰胺酶酶活均達到最大值。隨著轉速的增大，e.e.值變化不明顯。該結果說明（+）γ-內酰胺酶發(fā)酵的適宜轉速為150 r/min。

2.2Plackett-Burman試驗設計及重要因素

PB試驗設計及結果見表3，根據(jù)表3結果對各因素水平進行效應評價，結果見表4。由表4可知，根據(jù)PB試驗結果，得到3個對酶活影響最顯著因素：葡萄糖添加量、pH值、溫度。

表3　Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4　Plackett-Burman試驗顯著因子分析Table 4 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

2.3最陡爬坡試驗研究最大響應區(qū)域

在PB試驗基礎上，將葡萄糖和溫度的值按照步長依次減小，pH按照步長逐步增大進行最都爬坡試驗設計［11］，試驗設計和結果見表5。由表5可知，其中的第2組試驗，當葡萄糖質量濃度為4.0 g/L，pH值為8.0，溫度為26℃時，酶活最大。所以選擇以第2組試驗作為中心組合試驗的中心點，進行中心組合試驗設計。

表5　最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4Box-Behnken中心組合試驗設計結果

2.4.1中心組合設計及結果

運用Design-Expert.V8.6.0.1軟件，以酶活（Y）為響應值，對葡萄糖、pH和溫度這3個最顯著因素進行3因素3水平的中心組合試驗設計，設計結果與響應值見表6。

表6　Box-Benhnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of of Box-Benhnken experiments

2.4.2回歸模型建立與方差分析

運用Design-Expert.V8.6.0.1軟件對中心組合試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析、顯著性檢驗和方差分析，結果見表7和表8。得到回歸方程：Y=2 109.725X1+10.248 75X2+239.023 75X3-6.6X1X2-43.4X1X3+4.607 5X2X3-1 211.625X12-8.123 75X22-5.08875X32-3358.565。由表7知其自變量X2，X3，X1X3，X2X3，X12，X22，X32顯著（P＜0.05）。失擬項表示所用模型與試驗的擬合程度，該設計失擬項P值為0.215 7＞0.05，因而無失擬因素存在?；貧w方程的相關系數(shù)R2為0.986 7，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9628＞0.80，模型變異程度僅為3.72%。說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結果進行初步分析和預測［12］。

表7　回歸系數(shù)的顯著性檢驗Table 7 Significance testing of regression coefficient

表8　回歸方程的方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

2.4.3響應面分析結果

根據(jù)響應面法分析繪制出響應曲面圖及其等高線圖（見圖10）。二者直觀反映出了葡萄糖質量濃度、溫度和pH三者的交互作用對酶活的影響。圖10中橢圓形或馬鞍形等高線表示參數(shù)之間交互作用顯著，圓形等高線表示參數(shù)之間交互作用不顯著［13］。由圖10可知：溫度和pH水平固定，葡萄糖質量濃度為3.0～4.0 g/L時，（+）γ-內酰胺酶酶活呈增大趨勢；葡萄糖質量濃度和溫度水平固定，pH在7.0～7.6時，（+）γ-內酰胺酶酶活呈增大趨勢；葡萄糖質量濃度和pH水平固定，溫度為24～25.2℃時，（+）γ-內酰胺酶酶活呈增大趨勢。因此選擇葡萄糖質量濃度為4.0 g/L、pH值為7.6、溫度為25.2℃進行（+）γ-內酰胺酶菌株的發(fā)酵，以提高發(fā)酵效率。

圖10　葡萄糖濃度、pH值和溫度交互作用對酶活影響的響應面和等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between of glucose content，pH and temperature on the yield of CoQ10

2.4.4最優(yōu)條件的確定與驗證

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件：葡萄糖質量濃度為4.0g/L、溫度為25.2℃和pH為7.63，預測（+）γ-內酰胺酶最大酶活為116.9 U/L。根據(jù)實際情況，最優(yōu)發(fā)酵條件數(shù)值調整為葡萄糖質量濃度4.0 g/L、溫度25℃和pH 7.6。在此條件下進行驗證試驗得到（+）γ-內酰胺酶酶活平均值為114.5 U/L，相對偏差為2.1%。因此采用響應面法對（+）γ-內酰胺酶菌株培養(yǎng)條件進行優(yōu)化準確可靠［14］。

3　結論

單因素試驗結果顯示，應選擇質量濃度為5.0 g/L的葡萄糖為碳源，質量濃度為10.0g/L的蛋白胨為氮源，溫度26℃，pH8.0，接種量4%，裝液量100 mL/500 mL，轉速150 r/min。在此基礎上進行響應面優(yōu)化，最優(yōu)的發(fā)酵條件為：葡萄糖質量濃度4.0 g/L、溫度25℃和pH 7.6。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，（+）γ-內酰胺酶酶活由優(yōu)化前的約76.0 U/L提高至114.5 U/L，比優(yōu)化前提高了約50.7%［15］。

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ZHANG Xujiao1，CHI Naiyu1，2，YANG Lina1，WANG Xiaohui1，ZHANG Qingfang1*
（1.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Based on single factor experiments，the fermentation conditions of（+）γ-lactamases-producting strain BH24 were optimized by Plackett Burman design，the steepest ascent experiments design，central composite design，and response surface analysis.The results of single factor experiments showed that in the conditions of 5.0 g/L glucose as carbon source，10.0 g/L peptone as the nitrogen source，temperature 26.0℃，pH 8.0，inoculum 4.0%，liquid volume 100 ml/500 ml，rotating speed 150 r/min，the biomass，（+）γ-lactamases activity and e.e.value all were increased in different degrees.The results of response surface optimization showed that the（+）γ-lactamases activity was up to 114.5 U/L in the conditions of glucose content 4.0 g/L，temperature 25.2℃and pH 7.6，which was 50.7%higher than that before optimization

（+）γ-lactamases；fermentation conditions optimization；response surface methodology

Q936

0254-5071（2016）06-0070-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.015

2016-03-07

國家高技術研究發(fā)展計劃‘863’計劃項目（No.2007AA021306）

張旭姣（1988-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。

張慶芳（1965-），女，教授，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。