三唑磷單克隆抗體制備以及酶聯(lián)免疫試劑盒的研究

馮才偉，何方洋*，黃健，賈芳芳，李行

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京102206；3.北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站，北京100101）

三唑磷單克隆抗體制備以及酶聯(lián)免疫試劑盒的研究

馮才偉1，2，何方洋1，2*，黃健3，賈芳芳1，2，李行1，2

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京102206；3.北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站，北京100101）

通過三唑磷與乙酰氯反應(yīng)，得到三唑磷半抗原，通過免疫動物得到抗三唑磷單克隆抗體，將其應(yīng)用于能夠檢測蔬菜中三唑磷殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，結(jié)果表明：該試劑盒對結(jié)球甘藍(lán)中三唑磷的檢測限為49.6 μg/kg，IC50為6.9 μg/L，加樣回收率為70.0%～93.5%，三唑磷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～81 μg/L，批內(nèi)、批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜10%，三唑磷單克隆抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應(yīng)率分別為2.3%，3.8%。4℃條件該試劑盒下能夠保存12個月，穩(wěn)定性較好。

三唑磷；單克隆抗體；ELISA試劑盒

三唑磷是一種中等毒性的廣譜有機(jī)磷殺蟲劑［1］，作為高效替代農(nóng)藥已經(jīng)大量使用多年。但是由于其半衰期較長、容易殘留，環(huán)境和食品中其殘留超標(biāo)的問題逐漸引起關(guān)注。因此，建立三唑磷殘留的快速檢測技術(shù)，對加強(qiáng)其殘留監(jiān)測，減少環(huán)境污染，保障人體健康具有重要意義［2］。歐盟規(guī)定三唑磷作為農(nóng)藥品種在蜂王漿、花粉等不得檢出（低于0.01 mg/kg），在水果、香菜、小豆蔻、黑胡椒、白胡椒等農(nóng)產(chǎn)品中限量僅為0.07 mg/kg［3］；我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了三唑磷的最大殘留限量為：蔬菜中結(jié)球甘藍(lán)、節(jié)瓜均為100 μg/kg［4］。

目前，檢測三唑磷的檢測方法有高效液相色譜法［5-6］、氣相色譜法［7-8］、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和壓電免疫傳感器等［9-11］。這些儀器方法的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高，缺點(diǎn)是費(fèi)用很高，操作也較為復(fù)雜，對企業(yè)質(zhì)量內(nèi)控以及現(xiàn)場監(jiān)管均具有一定的局限性。相較于其他方法，酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。基于上述原因，制備了抗三唑磷單克隆抗體，同時開發(fā)了檢測蔬菜中三唑磷殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測度（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，不僅方便基層檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行初篩檢查，而且利于生產(chǎn)廠家進(jìn)行較為高效、快速的自檢。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸鹽、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基聯(lián)苯胺、二氯甲烷、三唑磷、乙酰氯、硫酸鎂、羧甲基羥胺（以上均為分析純）：北京百欣試劑公司；蔬菜：市售；復(fù)溶工作液、細(xì)胞：北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

MR3酶標(biāo)儀：上海雷勃分析儀器有限公司；HFJ-10振蕩器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1制備抗原

（1）半抗原的制備

將10 mL二氯甲烷和0.5 g三唑磷加入100 mL三口燒瓶，冷藏降溫至-5℃，攪拌下加入1.01 mol/L的乙酰氯，控溫加入2 mol/L的三氯化鋁，控溫5℃反應(yīng)6 h后，加稀鹽酸和冰水，乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鎂干燥有機(jī)相，減壓蒸干溶劑，石油醚-乙酸乙酯體系重結(jié)晶得乙?；?。

將上步驟獲得的乙酰化物加入100 mL三口燒瓶，再加入10 mL吡啶進(jìn)行溶解，加入1.2 mol/L的羧甲基羥胺，65℃反應(yīng)5 h，乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鎂干燥有機(jī)相，減壓蒸餾，得到半抗原產(chǎn)物，三唑磷半抗原的合成路線見圖1。

圖1　三唑磷半抗原合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of triazophos hapten

（2）免疫原的制備

用1 mL二甲基甲酰胺（dimetbylformamide，DMF）溶解12 mg三唑磷半抗原，得到溶液A；用0.2 mL水充分溶解30 mg碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）后，加入溶液A中，室溫下攪拌24 h，即可得到反應(yīng)液B。稱取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH為7.2）中，將反應(yīng)液B逐滴緩慢滴加到該蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，然后在4℃條件下，用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天換3次透析液，保存于-20℃。

（3）包被原的制備

包被原制備方法即為：將（2）制備免疫原的牛血清白蛋白替換為卵清蛋白，其他步驟相同。

1.3.2制備酶標(biāo)記抗抗體

將1.3.1得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過間接競爭酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，進(jìn)行克隆化，獲得能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到三唑磷單克隆抗體［12］，用該抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體［13］，然后偶聯(lián)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）［14］，得到酶標(biāo)記抗體。

1.3.3優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標(biāo)板

在測定波長為450 nm，抗原稀釋倍數(shù)依次為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000；單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為：1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶標(biāo)記抗抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1 000時，分別測定0以及0.05 μg/L質(zhì)量濃度的三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，并計(jì)算百分吸光度值，計(jì)算公式如下：

將100 μL抗原包被液包被于酶標(biāo)板中，37℃孵育2h，然后清洗酶標(biāo)板，加入150 μL封閉液（封閉液為0.05%牛血清白蛋白（BSA））溶解于0.02 mol/L PBS中，37℃孵育2 h［15］，即制備完成酶標(biāo)板。

1.3.4蔬菜樣本的前處理方法

稱取2.0 g均質(zhì)蔬菜樣本至10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入2 mL 0.1mol/L NaOH溶液和10 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，混勻；室溫離心5 min，轉(zhuǎn)速≥3 000 r/min；移取1 mL上層有機(jī)相至玻璃試管中；于50～60℃水浴流下氮?dú)獯蹈桑患尤? mL復(fù)溶工作液，渦動1 min。取200 mL加入1 800 mL復(fù)溶工作液中，混勻；取50 mL用于分析。

1.3.5酶標(biāo)板檢測

向1.3制備完成的酶標(biāo)板中依次加入質(zhì)量濃度為0、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以及1.3.6前處理完成的蔬菜樣本溶液，每孔均為50 mL，再加入抗體液每孔50 mL，室溫避光反應(yīng)30 min。清洗酶標(biāo)板，然后每孔加入制備的酶標(biāo)記抗抗體100 μL，室溫避光反應(yīng)30 min。清洗酶標(biāo)板，然后每孔加入50 μL H2O2，再加入每孔50 μL四甲基聯(lián)苯胺，室溫避光反應(yīng)15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，測定酶標(biāo)板孔的OD450nm值。

1.3.6計(jì)算蔬菜樣本中三唑磷含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg/L）的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值，然后將蔬菜樣本的OD450nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的質(zhì)量濃度，該質(zhì)量濃度乘以稀釋倍數(shù)即為蔬菜樣本中三唑磷殘留量。

1.3.7檢測性能

（1）計(jì)算檢出限

分別檢測20份蔬菜空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD），即檢測方法可檢測出的最低被測物濃度［16］。

（2）精密度和準(zhǔn)確度

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了結(jié)球甘藍(lán)、節(jié)瓜中三唑磷的最大殘留限量均為100 μg/kg。《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：當(dāng)ELISA試劑盒檢測有最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）的藥物時，測定回收率的添加質(zhì)量濃度為0.5× MRL、1×MRL和2×MRL（或1.5×MRL）。因此，本實(shí)驗(yàn)按照上述要求，分別對結(jié)球甘藍(lán)樣本添加三唑磷，使其質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，測定加標(biāo)回收率，以此評價該試劑盒的準(zhǔn)確度。同時，每個樣本做4個平行，按照上述1.3.3制備3批酶標(biāo)板，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD），以此評價該試劑盒的精密度。

（3）測定穩(wěn)定性

通過測定試劑盒的保存條件，評價該試劑盒的穩(wěn)定性。將試劑盒保存于4℃，每個月計(jì)算一次0.05 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品在波長450 nm條件下的百分吸光度值（即最大百分吸光度值）、半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以及結(jié)球甘藍(lán)樣本的回收率，連續(xù)測定12個月，記錄最大百分吸光度值。

（4）測定抗體特異性

毒死蜱、對硫磷與三唑磷的結(jié)構(gòu)類似［17］，測定這三種藥物的IC50，根據(jù)下式計(jì)算該試劑盒對于毒死蜱、對硫磷的交叉反應(yīng)率：

2　結(jié)果與分析

2.1鑒定半抗原

利用核磁共振氫譜法測定1.2.1制備的半抗原，如圖2所示，11.0 ppm的羧基信號峰、2.85 ppm甲基信號峰的出現(xiàn)，說明半抗原合成成功［18-19］。

圖2　三唑磷半抗原核磁共振氫譜Fig.2 H1NMR of triazophos hapten

2.2優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測定不同單克隆抗體稀釋倍數(shù)以及抗原稀釋倍數(shù)條件下，質(zhì)量濃度為0和0.05 μg/L的三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值，結(jié)果見表1。

表1　抗原、抗體的濃度優(yōu)選結(jié)果Table 1 Concentration detection results of antigen and antibody

通過我公司多年實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)OD450nm（0.05 μg/L）/ OD450nm（0）的抑制率在70%～85%時，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)［20］，由表1可見，本研究優(yōu)選抗原稀釋倍數(shù)為2 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為80 000。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

以三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450nm（0.05 μg/L）/OD450nm（0）的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3　三唑磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of triazophos

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-1.682x+1.516，R2為0.996 2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1～81 μg/L，IC50（半抑制濃度）為6.9 μg/L。

2.4計(jì)算檢測限

20個結(jié)球甘藍(lán)空白樣本中三唑磷的檢測結(jié)果見表2。檢測限以測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

表2　結(jié)球甘藍(lán)空白樣本檢測限測定結(jié)果Table 2 Detection limit results of cabbage blank sample μg/kg

由表2可知，20個結(jié)球甘藍(lán)樣本中三唑磷的測定結(jié)果平均值為18.5 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為10.4%，最低檢測限為49.6 μg/kg。

2.5精密度和準(zhǔn)確度

測定添加不同質(zhì)量濃度三唑磷的結(jié)球甘藍(lán)樣本的精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，回收率范圍是70.0%～93.5%，可見當(dāng)添加質(zhì)量濃度為50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg時，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是6.9%～9.7%；批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是7.6%～9.6%?？梢?，批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.9%～9.7%、7.6%～9.6%，均＜10%，說明試劑盒精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3　精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and accuracy tests

2.6穩(wěn)定性

將試劑盒保存在4℃條件下，每月測定最大百分吸光度值、IC50以及回收率，穩(wěn)定性結(jié)果見表4。由表4可知，測定的無添加三唑磷試劑盒的最大百分吸光度值范圍是1.70～1.91，半數(shù)抑制濃度范圍是5.1～7.9 μg/L，三唑磷添加回收率范圍是70.9%～92.5%，由此可見，各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)。該試劑盒在4℃至少能夠保存12個月。

表4　試劑盒在4℃保存的穩(wěn)定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

2.7抗體特異性的測定

三唑磷抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應(yīng)率見表5。

由表5可知，三唑磷抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應(yīng)率分別為2.3%、3.8%，交叉反應(yīng)率低，由此可見，三唑磷抗體特異性良好。

表5　交叉反應(yīng)率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of cross reaction rate test

2.8討論

梁赤周等［17］利用酶聯(lián)免疫吸附測度法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒檢測土豆、洋蔥、茄子等樣本中的三唑磷殘留情況，該試劑盒對樣本的添加回收率為65%～125%，變異系數(shù)＜15%，在4℃或-20℃的保質(zhì)期僅為6個月，本研究的樣本回收率為70.0%～93.5%，批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，試劑盒在4℃下能夠保存12個月。黃魁英等［21］采用活潑酯法偶聯(lián)三唑磷半抗原和蛋白，進(jìn)而免疫小鼠得到三唑磷多克隆抗體，通過建立ELISA方法，該抗體的IC50為10 μg/L，本研究制備的單克隆抗體IC50為6.9 μg/L。韋林洪等［1］利用免疫親和色譜-高效液相色譜分析稻米中的三唑磷殘留量，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為4.44%，但是總體的操作時間超過24 h，無法作為快速檢測方法用于基層單位。

3　結(jié)論

本研究制備了抗三唑磷單克隆抗體，并研發(fā)出相應(yīng)的ELISA試劑盒，優(yōu)選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍1～81 μg/L，對結(jié)球甘藍(lán)的檢測限為49.6 μg/kg，回收率為70.0%～93.5%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是6.9%～9.7%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是7.6%～9.6%。三唑磷單克隆抗體的特異性較好，與毒死蜱、對硫磷的交叉反應(yīng)率分別為2.3%，3.8%。ELISA試劑盒能夠在4℃下保存12個月，主要指標(biāo)在正常范圍內(nèi)，可見穩(wěn)定性較好［22］。

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FENG Caiwei1，2，HE Fangyang1，2*，HUANG Jian3，JIA Fangfang1，2，LI Hang1，2
（1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company，Beijing 102206，China；2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection，Beijing 102206，China；3.Beijing Agricultural Products Quality Service Station，Beijing 100101，China）

The synthesized triazophos hapten was prepared from a sequence of reactions of triazophos and acetyl chloride.Triazophos monoclonal antibodies werepreparedfromimmuneanimal，andcouldbeusedinELISAkitthatpreparedfortriazophosresiduecontentdetectioninvegetable.The results showedthatthelimitofdetectionoftriazophosELISAkitwas49.6 μg/kg，withIC50valueof6.9μg/L.Theaddingrecoverieswere70.0%-93.5%，and the linear range of triazopos standard curve ranged from 1-81 μg/L，and intra-assay and relative standard deviation was less than 10%.The cross reaction rate with chlorpyrifos，parathion was 2.3%and 3.8%respectively.The stability tests results revealed that the kit could be kept at 4℃for 12 months.

triazophos；monoclonal antibodies；enzyme linked immunosorbent assay kit

TS207.3

0254-5071（2016）06-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.035

2015-12-16

貴州省重大科技專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字［2013］6024號）

馮才偉（1978-），男，高級獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)研究。

何方洋（1969-），男，高級研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)研究。