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    重組艾塞那RP—HPLC法肽圖分析

    2016-10-11 01:37:52吳宏斌邱文娜李磊熊吉濱
    中國醫(yī)藥科學 2016年7期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜方法研究質(zhì)量控制

    吳宏斌+邱文娜+李磊+熊吉濱

    [摘要]目的建立并驗證胰蛋白酶裂解-反向高效液相色譜法進行重組艾塞那肽肽圖分析研究。方法將重組艾塞那肽樣品用胰蛋白酶水解,酶解所得的肽段通過反相高效液相色譜法進行分析,采用cs色譜柱,以0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液為流動相A,以0.1%TFA的乙腈溶液為流動相B,梯度洗脫70min,得到重組艾塞那肽肽圖,以此進行方法的專屬性、重現(xiàn)性、定量限、批間同一性研究。結(jié)果本實驗室制備的重組艾塞那肽可以通過胰蛋白酶裂解RP—HPLC法進行肽圖分析,專屬性、重現(xiàn)性均滿足要求,定量限為0.125mg/mL,三個批次間的肽圖譜也完全一致。結(jié)論表明此方法簡便可靠、準確度高、重復(fù)性好,驗證研究可行,可用于重組艾塞那肽的質(zhì)量控制。

    [關(guān)鍵詞]重組艾塞那肽;肽圖;胰蛋白酶裂解;高效液相色譜;方法研究;質(zhì)量控制

    艾塞那肽(Exendin-4)是毒蜥唾液腺中分泌的一種胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物,為含有39個氨基酸的多肽。該產(chǎn)品首次由美國Amylin制藥公司開發(fā)合成,目前國內(nèi)市場由瑞典阿斯利康公司進口銷售,在臨床中已大量應(yīng)用,降低餐后血糖效果好見效快,主要用于控制血糖,減輕體重,改善胰島素抵抗。目前該藥品無其他公司生產(chǎn),且無藥典收藏質(zhì)量標準。本實驗室通過前期的研發(fā),自主構(gòu)建載體,利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌體內(nèi)重組表達艾塞那肽,經(jīng)過純化、濃縮、凍干等工藝,得到重組艾塞那肽。

    目前,控制基因工程藥物一致性的一個重要手段就是肽圖分析(peptide mapping analysis),肽圖分析技術(shù)靈敏高效的特點使其成為對基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進行驗證的首選方法。該技術(shù)不但可以比較重組與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差別,還可幫助判別樣品在生產(chǎn)過程中是否發(fā)生了變化,以驗證生產(chǎn)工藝和樣品的穩(wěn)定性,所以肽圖分析也是考察供試品與對照品之間以及不同批次產(chǎn)品之間同一性的重要手段。本研究采用胰蛋白酶對重組艾塞那肽進行酶解,以RP-HPLC法對酶解的肽段進行分析,與合成艾塞那肽進行一致性比對,并對3批重組艾塞那肽進行了肽圖分析,建立重組艾塞那肽的質(zhì)量控制方法以及驗證研究,得到較好的結(jié)果。

    1儀器與試劑

    1.1儀器

    高效液相色譜儀(Agilent 1260);電子天平(Sartorius BSA224S-CW);超純水儀(MilliporeMilli-Q);超聲儀(舒美KQ-300VDV);真空泵(天津GM-0.50);水浴鍋(Fisher215)。

    1.2試劑材料

    乙腈(色譜醇,F(xiàn)isher公司,LOTl36911);三氟乙酸(分析純,sigma,BCBJ6836V);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸氫銨、醋酸等(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);胰蛋白酶(Sigma,LOT#SLBFl700V);艾塞那肽合成品(上海吉爾生化有限公司,批號P140218);重組艾塞那肽(自制,批號Exl50108、Exl50322、Exl50603);其他試劑均為分析純。

    2方法與結(jié)果

    2.1色譜條件

    經(jīng)反復(fù)實驗后,確定重組艾塞那肽純度測定的實驗色譜條件:色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C。(4.6x250mm,粒徑5μm);以0.1%三氟乙酸的水溶液為流動相A液,以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液為流動相B液,梯度洗脫70min(A液從100%~30%,B液從0~70%);流速110mL/min;柱溫30℃;檢測波長為214nm;進樣量100μL;系統(tǒng)適用性要求滿足。

    2.2樣品處理

    取樣品使用磷酸鹽緩沖液進行溶解,使?jié)舛燃s為1mg/mL,使用1%碳酸氫銨溶液進行透析,取2mL透析液,加入400μL經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過的胰蛋白酶溶液(0.1 mg/mL,溶劑為1%碳酸氫銨溶液),37℃水浴保溫20h后,加入240μL50%醋酸溶液,混勻后用0.45μm濾膜濾過,取濾過液進樣。

    2.3專屬性研究

    取重組艾塞那肽、合成艾塞那肽以及空白溶液按照上法同步操作,液相色譜儀上樣,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1,空白溶液中(A)只有溶劑峰,重組艾塞那肽(C)與合成艾塞那肽(B)酶解后的肽段峰一致。結(jié)果表明使用HPLC法對艾塞那肽進行肽圖分析的專屬性研究滿足要求,使用基因工程技術(shù)表達出的重組樣品具有與合成樣品一致的一級結(jié)構(gòu)。

    2.4重現(xiàn)性研究

    員工A取重組艾塞那肽按照上法操作,液相色譜儀上樣,重復(fù)實驗3次(每樣進2針);員工B于另一天同法操作,重復(fù)實驗3次(每樣進2針)。記錄色譜圖,選取色譜圖中5個主峰,計算峰面積及相對保留時間進行比對,結(jié)果見表1。從表中數(shù)據(jù)可知,各峰面積及相對保留時間CV值均≤2.0%,表明本實驗室樣品重組艾塞那肽適用胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法進行肽圖分析,并且結(jié)果準確度高、重復(fù)性好。

    2.5定量限

    取重組艾塞那肽樣品,按照上法操作,濾過液使用1%碳酸氫銨溶液倍比稀釋,分別稀釋為原濃度的1/2、1/4、1/8、1/16,取稀釋液分別進樣,記錄色譜圖,取5個主峰為研究對象。通過圖譜分析,1/8濃度稀釋液中,5個主峰中最小峰信噪比為11,滿足藥典方法驗證“信噪比≥10:1”的要求,因此本實驗室重組艾塞那肽進行肽圖檢查的定量限設(shè)為0.125mg/mL。

    2.6批間同一性研究

    按上述方法對連續(xù)3批重組艾塞那肽(批號為Exl50108、Exl50322、Exl50603)進行肽圖分析,各批樣品圖譜一致,分析結(jié)果見圖2。表明本實驗室通過大腸桿菌重組的艾塞那肽表達穩(wěn)定,多肽結(jié)構(gòu)具有一致性,胰蛋白酶裂解RP-HPLC法可用于重組艾塞那肽的鑒別分析和質(zhì)量控制。

    3討論

    按生物仿制藥上市要求,我國企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量標準應(yīng)不低于國外原研產(chǎn)品,其藥物分子結(jié)構(gòu)應(yīng)與原研產(chǎn)品一致,通過肽圖分析嚴格保證每一批次終產(chǎn)物的一致性和安全性,從而有效地控制基因工程藥物的產(chǎn)品質(zhì)量。目前上市艾塞那肽產(chǎn)品是通過合成的方式獲得,本實驗室通過基因工程方式制備生物仿制藥,一方面為了摸索重組艾塞那肽的可行性降低成本,另一方面為研究長效重組GLP-1藥物打下基礎(chǔ)。

    3.1方法學驗證

    目前藥典法定方法有胰蛋白酶裂解一反向高效液相色譜法和溴化氰裂解法,前者具有更高分辨率及檢測靈敏度,在蛋白質(zhì)及多肽分離分析中得到廣泛應(yīng)用,因此重組艾塞那肽的肽圖分析采用胰蛋白酶裂解一反向高效液相色譜法。經(jīng)查肽圖檢查作為一項重要的定性分析,很少有關(guān)于其方法學驗證的文章,本實驗在重現(xiàn)性研究中選取了5個代表性主要峰的出峰時間和峰面積,計算變異系數(shù)CV,由于是不同實驗人員之間結(jié)果比較,因此未使用RSD表示。定量限研究中也是取的5個主峰中最小峰信噪比,峰數(shù)的選擇應(yīng)當視肽圖圖譜而定,一般肽圖峰數(shù)少的情況下可以少取,但不應(yīng)少于3個特征主峰。

    3.2實驗條件摸索

    為確保重組艾塞那肽在預(yù)處理過程中的穩(wěn)定性,本實驗將樣品在4℃環(huán)境中進行透析,透析后的樣品澄清,未見任何混濁和沉淀現(xiàn)象。在色譜條件摸索過程中,使用色譜柱cx和clx對樣品進行肽圖分析,圖譜效果相當,Cx的分離度更好。通過紫外可見分光光度計全波長掃描,裂解液在214nm波長下有最大吸收峰,與理論值一致。由于七氟丁酸較為昂貴,本試驗選用了三氟乙酸-乙睛-水體系,通過梯度洗脫可以達到滿意的分離效果。另外柱溫和流速的改變對該樣品肽圖的測定影響不大,因此采用了藥典指導值。

    3.3結(jié)果分析

    RP-HPLC色譜圖比對結(jié)果表明,本實驗室通過重組表達的艾塞那肽肽圖與合成的對照品一致,不同批次間的肽圖譜也完全一致。該研究表明本實驗室制備的重組艾塞那肽可以通過胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法進行肽圖鑒別,對產(chǎn)品進行質(zhì)量控制,并且方法簡便可靠、準確度高、重復(fù)性好,方法驗證研究可行,為該藥物的研發(fā)生產(chǎn)及申報提供良好的支持和質(zhì)控標準。

    在專屬性研究中,重組艾塞那肽比起合成艾塞那肽,在相對保留時間28min和32min左右有兩個小峰。經(jīng)研究重組艾塞那肽的純度在95.4%,低于合成的98.8%,兩峰初步考慮為表達純化過程中未能有效去除的雜質(zhì)峰。實驗室下一步將改良純化工藝提高樣品純度,同時對相關(guān)雜質(zhì)進行分析研究。

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