基于ITS序列位點特異性PCR的酸棗仁及其混偽品的鑒別△

李桂林，宋雅迪，呂振暉，劉春暉，李佳，張夏楠

(首都醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，北京 100069)

基于ITS序列位點特異性PCR的酸棗仁及其混偽品的鑒別△

李桂林，宋雅迪，呂振暉，劉春暉，李佳，張夏楠*

(首都醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，北京 100069)

目的：基于ITS序列建立酸棗仁及其市場混偽品的分子鑒定方法。方法：收集酸棗仁及其常見混偽品理棗仁、枳椇子、紫荊子、兵豆，提取總DNA，基于ITS序列設計引物并進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序，用BioEdit分析軟件進行序列比對，針對變異位點用Primer Premier 5.0設計特異性鑒別引物，進行PCR反應并考察反應條件。結果：ITS序列可以用于酸棗仁及其易混淆品種的鑒別研究，在位點特異性PCR反應條件考察中，DNA模板用量范圍應為0.7～2.1 ng·μL-1，退火溫度在59 ℃時特異性最佳，實驗建立的方法對不同Taq酶和PCR儀具有普遍適應性。結論：研究設計的位點特異性引物在一定條件下的PCR反應中，酸棗仁能擴增出66 bp的條帶，而其他混偽品不能擴增出條帶，從而實現(xiàn)了酸棗仁與其混偽品的快速、準確鑒別。

酸棗仁；ITS；特異性PCR；分子鑒定

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。產(chǎn)自河北、陜西、遼寧、山東、河南、安徽等省。酸棗仁性平，味甘、酸，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津的功能，用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，本品具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛抗驚厥、降壓、降血脂、增強免疫功能、抗缺氧、抗心律失常、抗衰老、抗輻射及抗血小板聚集等作用[2]。由于酸棗仁野生資源減少，市場貨源供不應求，藥材市場上出現(xiàn)以同屬植物滇刺棗ZizyphusmauritianaLam.的種子理棗仁混作酸棗仁出售的情況，此外還有枳椇子Hoveniadulcis(又名拐棗仁)、兵豆Lensculinaris、紫荊子Cercischinensis等混偽品出現(xiàn)。目前對于酸棗仁的鑒別研究多采用藥材性狀[3]、顯微特征[4]、薄層色譜[5]、電泳[6-7]、紫外光譜[8-9]、掃描電鏡[10]等傳統(tǒng)鑒別方法，但由于該5個品種外觀性狀相近，顯微組織特征不明顯，化學成分復雜，以上這些方法專屬性不強，且容易受到外加因素的干擾[11]。本實驗即以ITS序列作為分子標記，應用位點特異性PCR技術篩選特異性鑒別引物，建立一種快速、穩(wěn)定的分子鑒別方法以區(qū)分酸棗仁及其混偽品藥材。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DYY-6D電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)，PCR儀(Life Technologies 公司，型號 Veriti；德國Eppendorf AG 22331 Hamburg；德國Eppendorf Mastercycler pro)，1-14臺式離心機(德國SiGMR公司)，Vilber Lourmat凝膠成像儀(法國)，Plant Genomic DNA kit 50 Preps植物基因組DNA提取試劑盒(TianGen)。

1.2 試劑

2x Easy Taq?PCR SuperMix，2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，Trans FastTaq DNA Polymerase(5U·μL-1)，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)，Trans2K?DNA Marker(北京全式金生物技術有限公司)，瓊脂糖Biowest?Regular Agarose G-10，Tiangen 10 000x GeneGreen Nucleic Acid Dye，10x Mops 電泳緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 藥材

收集安國、亳州藥材市場的20份材料，包括11份酸棗仁、5份理棗仁、2份枳椇子、1份紫荊子、1份兵豆，鑒定人為首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院李佳副教授。

2 方法

2.1 提取樣品總DNA

取適量樣品研磨成細粉，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ITS片段擴增與測序

各樣品采用ITS通用引物進行擴增[12]，ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系總體積為50 μL，包括25 μL 2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，正反引物各2.5 μL，DNA 5 μL，無菌水15 μL。反應條件為98 ℃ 30 s，35個循環(huán)(98 ℃ 7 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s)，72 ℃ 7 min。產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術有限公司測序，各樣品均采用正反雙向測序，以保證結果的準確性。

2.3 構建系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)測序結果利用CLUSTAL X軟件進行序列排序，使用MEGA6進行遺傳分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 設計位點特異性鑒別引物

根據(jù)2.2測序結果將酸棗仁、理棗仁、兵豆、枳椇子、紫荊子的ITS序列用CONTIG軟件同源對齊并輔以人工校對，多重序列比對進行差異變異位點分析，根據(jù)變異位點采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性鑒別引物。引物序列由北京睿博興科生物技術有限公司合成。引物序列為ZmITS3F：5′-CAACCAGCGAACCCGTGAA-3′；ZmITS3R：5′-CCAAGGAAGGCTCCGTGACA3′。

2.5 PCR擴增條件的確定

用設計的特異性鑒別引物進行PCR反應，反應體系為25 μL，包括12.5 μL 2x Easy Taq?PCR SuperMix緩沖液，正反引物各0.5 μL，DNA 35 ng·μL-1共1.5 μL，無菌水10 μL。PCR反應條件為94 ℃ 5 min，35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min。反應結束后取反應產(chǎn)物5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。為使PCR鑒別反應準確高效，考察了DNA模板量(0.4～2.6 ng·μL-1)、退火溫度(53、55、56、57、59、61、63 ℃)、Taq酶種類(2x EasyTaq?PCR SuperMix、Trans FastTaq DNA Polymerase)以及不同PCR儀(Life Technologies 公司，型號 Veriti；德國Eppendorf AG 22331 Hamburg；德國Eppendorf Mastercycler pro)對PCR鑒別反應的影響。

3 結果與分析

3.1 酸棗仁及其混偽品的ITS分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

采用Mega 6分析軟件進行酸棗仁及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，采集NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1，采用Kimura2-parameter 距離，系統(tǒng)樹各分支的置信度用bootstrap method檢驗，共進行1000次循環(huán)。從圖1可知，酸棗仁與理棗仁的親緣關系最近，其次為枳椇子，與紫荊子和兵豆的關系較遠，都可以區(qū)分開，可信度在98%以上，符合植物分類結果。證明ITS序列可以用于鑒別酸棗仁及其混偽品。

圖1 基于ITS序列構建酸棗仁及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 PCR反應條件考察

為建立準確、簡便的酸棗仁及其混偽品分子鑒別方法，本文對設計的鑒別引物在PCR反應中的應用進行了全面考察。

3.2.1 DNA模板量的考察 對25 μL PCR 反應體系中的模板DNA用量進行了考察，分別設置為0.42、0.70、0.98、1.26、1.54、1.82、2.10、2.38、2.66 ng·μL-1，反應體系為：12.5 μL 2x Easy Taq?PCR SuperMix 緩沖液，正反向引物各0.5 μL，無菌水補齊。圖2結果顯示，模板濃度為0.42 ng·μL-1時正偽品均未出現(xiàn)條帶，而提高到2.10 ng·μL-1及以上則全部出現(xiàn)條帶，其余模板量均能區(qū)分開酸棗仁及其混偽品，因此確定本方法DNA模板濃度范圍應為0.70～2.10 ng·μL-1。實驗采用0.70 ng·μL-1DNA模板濃度繼續(xù)進行其他條件的考察。

注：(1)M.2 000 bp DNA Marker，3、7、8.正品酸棗仁，1、5.理棗仁，13、14.枳椇子，15.紫荊子，16.兵豆；(2)從上至下DNA模板濃度分別為0.42、0.70、0.98、1.26、1.54、1.82、2.10、2.38、2.66 ng·μL-1。圖2 不同DNA模板濃度PCR反應結果

3.2.2 退火溫度的考察 設置退火溫度分別為53、55、56、57、59、61、63 ℃進行考察，結果見圖3。退火溫度為53、55、56、57 ℃時偽品依稀可見假陽性條帶，退火溫度提高至59 ℃時偽品無條帶，而正品酸棗仁有清晰的特異性擴增條帶，退火溫度為61、63 ℃時，偽品無條帶，而正品條帶也不易擴增出來。因此，為保證PCR反應具有良好的可重復性及區(qū)分度，采用59 ℃作為此方法的退火溫度。

3.2.3 兩種DNA聚合酶的考察 除上述方法中使用的聚合酶2x EasyTaq?PCR SuperMix，本研究還考察了另一種常用聚合酶Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)的反應效果。PCR反應體系為25 μL，其中Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.2 μL，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each 2 μL，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)2.5 μL，正反引物各 1 μL，DNA模板 1.40 ng·μL-1(1 μL)，無菌水17.3 μL。PCR反應條件為94 ℃ 5 min，35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，結果見圖4。采用兩種聚合酶的PCR反應條件下，偽品無條帶，而正品均有66 bp特異性擴增條帶，說明特異性引物可用多種酶進行實驗，無單一局限性。

3.2.4 PCR儀對實驗結果重復性的影響 選用3臺不同PCR儀器及同一儀器多次實驗，結果均能區(qū)分開酸棗仁及其混偽品。

注：(1)M.2 000 bp DNA Marker；(2)從上到下依次為退火溫度53、55、56、57、59、61、63 ℃；(3)3、4、7、8、9、10、11、12、17、18、19.正品酸棗仁，1、2、5、6、20.理棗仁，13、14.枳椇子，15.紫荊子，16.兵豆。圖3 不同退火溫度下PCR反應結果圖

注：(1)M.2000 bp DNA Marker,3、4、7、8、9、10、11、12、17、18、19.正品酸棗仁；1、2、5、6、20.理棗仁；13、14.枳椇子；15.紫荊子；16為兵豆；(2)上為酶Trans FastTaq DNA Polymerase(5U·μL-1)，下為酶2x Easy Taq?PCR SuperMix。圖4 兩種酶進行PCR實驗的結果

4 討論

ITS序列是位于高等植物核糖體rRNA基因上高度重復的串聯(lián)序列單位，被廣泛用于被子植物系統(tǒng)學的研究，尤其是近源屬間和屬內(nèi)系統(tǒng)學的研究。目前ITS序列作為植物分子鑒定的特異性片段在澤瀉[13]、紅景天[14]、肉蓯蓉[15]等多種藥用植物中得到探討和應用，陳士林等[16]以ITS2序列為主體推出了植物類中藥材DNA條形碼鑒定的通用引物，并已得到了廣泛應用。本實驗即選用DNA條形碼中的ITS序列作為分子標記，使用現(xiàn)有文獻記錄的ITS序列通用引物對收集的樣品進行測序，構建系統(tǒng)發(fā)育樹的結果也證實了ITS序列可以作為分子標記來區(qū)分酸棗仁及其混偽品，這與任莉等的研究結果相一致[17]。實驗收集的樣品是當前藥材市場較為常見的混偽品，其中理棗仁與酸棗仁為同屬來源，形態(tài)相近最不容易區(qū)分。本實驗基于ITS序列設計篩選鑒別酸棗仁及其混偽品的位點特異性引物，建立了位點特異性PCR方法，并對其反應條件進行了一系列考察，力求得到穩(wěn)定、可重復的鑒別體系，可以準確鑒別出酸棗仁及其混偽品。

位點特異性引物PCR具有操作簡單、成本低、重復性好、鑒定條帶單一、樣品用量少等優(yōu)點，此外可以極大降低PCR的假陽性率，保證鑒定結果的準確性[18]。本實驗建立的分子鑒別方法，將為應用DNA條形碼鑒別中藥材提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)酸棗仁快速鑒別試劑盒打下理論基礎。

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IdentificationofZizyphusjujubawiththeCounterfeitProductsbyAllele-specificPCRBasedonITSGenesSequence

LI Guilin，SONGYadi，LYUZhenhui，LIUChunhui，LIJia，ZHANGXianan*

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective：To establish molecular identification method forZizyphusjujubaand its counterfeit species based on ITS genes sequence.Methods：Total DNAs ofZ.jujuba，Z.mauritiana，Hoveniadulcis，LensculinarisandCercischinensiswere extracted，and the internal transcribed spacer(ITS)regions were amplified by PCR and the products were sequenced.BioEdit analysis software was used for sequence comparison.Primer Premier 5.0 was applied to design specific primers according to the mutation sites，the PCR reactions were performed and the conditions were examined.Results：ITS sequences were used in identification research ofZ.jujubaand its counterfeit species.To investigate the specific PCR reaction conditions，the scope of DNA template should variate from 0.7-2.1 ng·μL-1，the annealing temperature was proper at 59 ℃，different Taq enzymes and PCR instruments were available for this PCR process.Conclusion：In the same PCR reaction，66 bp DNA band could be amplified fromZ.jujubawhile nothing from the counterfeit species.It is a fast and accurate method to identifyZ.jujubafrom the counterfeit products using specific PCR primer.

Zizyphusjujuba；ITS；specific PCR；molecular identification

2016-01-18)

國家自然科學基金(81303166)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專項(201407003)

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張夏楠，講師，研究方向：分子生藥學；Tel：(010)83911633，E-mail：xnzhang@ccmu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.007