地榆升白片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究△

胡佳，李莎，廣兵，王澤宇，邱玲，宋川霞*，鄧赟*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2.成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，四川 成都 610041)

地榆升白片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究△

胡佳1，李莎1，廣兵2，王澤宇1，邱玲1，宋川霞*1，鄧赟1*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2.成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，四川 成都 610041)

目的：建立和提升地榆升白片制劑鑒別和含量的測(cè)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TLC法對(duì)地榆升白片制劑中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC波長(zhǎng)切換法對(duì)制劑中的沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：TLC鑒別方法斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)單可行；HPLC法測(cè)定中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ分別在20.50～184.50、20.70～207.00 μg·mL-1與色譜峰峰面積呈良好線性響應(yīng)，平均回收率分別為100.03%、100.14%(n=6)，RSD分別為0.58%、1.18%。結(jié)論：該方法所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可用于地榆升白片的質(zhì)量控制。

地榆升白片；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；沒食子酸；地榆皂苷Ⅰ

地榆升白片制劑標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》[1]口腔腫瘤兒科分冊(cè)，是由地榆單味藥加工制成的片劑，具有升高白細(xì)胞數(shù)量的作用。臨床上常作為化療期間的輔助用藥，治療化療引起的白細(xì)胞減少癥[2-4]，也可用于治療精神病藥所致的白細(xì)胞減少癥[5]、干擾素治療乙型肝炎所致的白細(xì)胞減少癥[6-7]。在中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編鑒別項(xiàng)下僅對(duì)沒食子酸進(jìn)行了定性分析，含量測(cè)定項(xiàng)下僅測(cè)定了沒食子酸的含量，其鑒別和含量測(cè)定的指標(biāo)單一、專屬性差。

地榆皂苷Ⅰ是地榆藥材中的一個(gè)主要化學(xué)成分，現(xiàn)有資料表明，地榆皂苷Ⅰ具有一定的造血促進(jìn)作用，可明顯升高紅細(xì)胞和血紅蛋白，治療或預(yù)防各種貧血，尤其是骨髓造血功能低下或衰竭引起的貧血[8-10]，對(duì)治療白細(xì)胞減少癥具有一定的輔助效果。譚鵬等[11]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法單獨(dú)測(cè)定地榆升白片中地榆皂苷Ⅰ的含量，該文獻(xiàn)單一測(cè)定地榆皂苷Ⅰ成分,不能全面控制地榆升白片的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)首次建立了反向高效相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定地榆升白片中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量，同時(shí)首次建立了制劑中地榆皂苷Ⅰ薄層定性鑒別方法，并對(duì)制劑中沒食子酸薄層鑒別方法進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器與試藥

SSI series 1500高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，CSChrom Plus色譜工作站；色譜柱Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，40 KHz，600 W)；十萬分之一電子天平(瑞士奧豪斯DV-215-CD)；優(yōu)普UPT系列超純水器(成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司)；可調(diào)式移液器(美國(guó)Thermo，F(xiàn)innpipette系列，20～200 μL，100～1000 μL)。

地榆升白片(成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)見表1)；沒食子酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11083-201204)；地榆皂苷Ⅰ(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：D-022-150519)；碘(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；硅膠GF254高效薄層板、硅膠G高效薄層板(10×20 m，0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠分廠)；液相用甲醇為色譜級(jí)(美國(guó)J.T.Baker)；水為超純水；碘、其余試劑為分析級(jí)。

表1 地榆升白片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 沒食子酸的TLC鑒別 取本品10片，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理(150 W、40 kHz)30 min，靜置，用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液[12]。另取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[13]，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠GF254薄層板上，以水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中進(jìn)行碘顯色至斑點(diǎn)清晰，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1～2。

注：1.沒食子酸對(duì)照品；2～13.樣品。圖1 11批地榆升白片TLC鑒別圖譜(碘顯日光下)

注：1.沒食子酸對(duì)照品；2～13.樣品。圖2 11批地榆升白片TLC鑒別圖譜(碘顯254 nm下)

2.1.2 地榆皂苷Ⅰ的TLC鑒別 取本品10片，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理(150 W、40 kHz)30 min，靜置，用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液[12]。另取地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[13]，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3～4。

注：1.地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品；2～13.樣品。圖3 11批地榆升白片TLC鑒別圖譜(10%硫酸顯色后日光下)

注：1.地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品；2～13.樣品。圖4 11批地榆升白片TLC鑒別圖譜(10%硫酸乙醇溶液顯色后365 nm下)

2.2 HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定供試品中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量

2.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences Inc.)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脫(0～18 min，5%～14%；18～48 min，14%～48%；48～53 min，48%；53～60 min，48%～55%；60～62 min，55%～5%)；波長(zhǎng)切換(0～46 min，在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)沒食子酸；46～61 min，在210 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)地榆皂苷Ⅰ)；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ色譜峰的對(duì)稱因子均在0.95～1.05，理論塔板數(shù)均大于10 000，與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，見圖5。

注：A.沒食子酸和和地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品；B.地榆升白片制劑；1.沒食子酸；2.地榆皂苷Ⅰ。圖5 地榆升白片供試品和對(duì)照品液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品適量，置同一容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，質(zhì)量濃度分別為沒食子酸1.025 mg·mL-1、地榆皂苷Ⅰ1.035 mg·mL-1。

2.2.3 供試品溶液的制備 取地榆升白片(三批混合取樣)20片，除去包衣，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加5%甲醇稀釋，分別配制成含沒食子酸對(duì)照品20.50、41.00、82.00、102.50、164.00、184.50 μg·mL-1，含地榆皂苷Ⅰ對(duì)照品20.70、41.40、103.50、165.60、186.30、207.00 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得混合對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和各對(duì)照品回歸方程。將對(duì)照品溶液用5%甲醇不斷進(jìn)行稀釋后分析，分別得到?jīng)]食子酸和地榆皂苷Ⅰ的檢測(cè)限LOD值(S/N≈3)和定量限LOQ值(S/N≈10)。地榆升白片中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限。見表2，結(jié)果表明,沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ在線性范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好，方法靈敏度高，測(cè)試樣品中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量遠(yuǎn)高于定量限。

表2 地榆升白片中沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的線性關(guān)系

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的峰面積RSD值分別為0.85%、0.92%，說明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48 h測(cè)定，計(jì)算峰面積，沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的RSD分別為1.55%、1.60%。結(jié)果表明,供試品溶液在48 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批地榆升白片(批號(hào)：141215)6份，按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示,沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的RSD分別為1.08%、0.77%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：141215)6份，各約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入沒食子酸溶液(質(zhì)量濃度為1.017 mg·mL-1)0.56 mL、地榆皂苷Ⅰ溶液(質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1)1.945 mL的對(duì)照品溶液，照2.2.3項(xiàng)下方法制備，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。沒食子酸平均回收率為100.03%，RSD為0.58%；地榆皂苷Ⅰ平均回收率為100.14%，RSD為1.18%。表明該方法的回收率良好。

表3 沒食子酸、地榆皂苷Ⅰ的加樣回收率(n=6)

3 含量測(cè)定

取12批地榆升白片制劑，分別按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 地榆升白片含量測(cè)定結(jié)果

4 分析與討論

在展開劑的考察中也分別考察了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)[1]、乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)[12]、水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)三種展開系統(tǒng)，最終沒食子酸在水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)中展開良好，地榆皂苷Ⅰ在乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)展開良好。在點(diǎn)樣量考察中，分別考察了2、5、10 μL的點(diǎn)樣量，在5 μL時(shí)斑點(diǎn)清晰，不拖尾，故確定點(diǎn)樣量為5 μL。

經(jīng)DAD全波長(zhǎng)(190～400 nm)掃描，沒食子酸除末端吸收外，在280 nm處有最大吸收；地榆皂苷Ⅰ在210 nm附近有較強(qiáng)的末端吸收。本實(shí)驗(yàn)對(duì)是否需要切換波長(zhǎng)進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，切換波長(zhǎng)后雜質(zhì)峰減少，基線穩(wěn)定。故采用切換波長(zhǎng)法，最終達(dá)到了檢測(cè)靈敏度高，干擾小的目的。本研究采用同一條件下不同波長(zhǎng)切換測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)儀器穩(wěn)定性進(jìn)行考察，其中Agilent 1260和1200系列保留時(shí)間基本一致，且目標(biāo)化合物達(dá)到基線分離。

本文優(yōu)化了地榆升白片中沒食子酸的TLC鑒別方法，并新建立了制劑中地榆皂苷Ⅰ的TLC鑒別方法，在該TLC鑒別方法下對(duì)照品和供試品斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便。建立了高效液相波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定沒食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。本文對(duì)地榆升白片的薄層鑒別和含量測(cè)定兩方面進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究，可更全面的對(duì)地榆升白片的制劑質(zhì)量進(jìn)行控制。

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ImprovementofDiyuShengbaiTabletQualityStandard

HU Jia1，LiSha1，GUANGBing2，WANGZeyu1，QIULing1，SONGChuanxia1*，DENGYun1*

(1.PharmacyCollege，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine；TheMinistryofEducationKeyLaboratoryofStandardizationofChineseHerbalMedicine；KeyLaboratoryofSystematicResearch，DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResourcesinSichuanProvince—KeyLaboratoryBreedingBaseofCo-foundedbySichuanProvinceandMOST，Chengdu611137，China；2.ChengduDi'aoPharmaceuticalGroupCo.Ltd.Chengdu610041，China)

Objective：To establish and improve the quality control standard of Diyu Shengbai tablet.Methods：TLC was used to identify the gallic acid and ziyuglycoside I，and HPLC wavelength switching method was used to simultaneously determine gallic acid sand ziyuglycoside I in Diyu Shengbai tablet.Results：The TLC spots were clear，and the method was simple with strong specificity.The calibration curves for gallic acid and ziyuglycoside were linear in the range of 20.50～184.50 μg·mL-1and 20.70～207.00 μg·mL-1，respectively.The average recovery of gallic acid and Ziyuglycoside were 100.03%(RSD 0.58%)and 100.14%(RSD 1.18%)，respectively.Conclusion：The quality standard established in this research was simple and stable，and can be used to control the quality of Diyu Shengbai tablet.

Diyu Shengbai tablet；TLC；HPLC；quality standard；gallic acid；ziyuglycoside I

2016-02-14)

國(guó)家科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)(2014ZX0920102-008)；國(guó)家自然基金國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(J13100340-12)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(2015TD0028，2016TD0006)

*

宋川霞，助教，研究方向：中藥有效成分分析，E-mail：2582345@qq.com； 鄧赟，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究,Tel：(028)6180023，E-mail：dengyun2000@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.024