繡球SSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化

賈新平,孫曉波,梁麗建,鄧衍明,蘇家樂,周建濤

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京　210014)

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繡球SSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化

賈新平,孫曉波,梁麗建,鄧衍明,蘇家樂,周建濤

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京210014)

為了建立適合繡球的SSR-PCR反應體系,采用正交設計L25(56)對影響SSR-PCR反應體系的5個主要因素(Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5個水平上進行優(yōu)化,篩選出每個因素的最佳水平,建立適合繡球的SSR-PCR反應體系。結果表明,20 μL的SSR-PCR反應體系中,DNA模板用量為60 ng,Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,Taq聚合酶用量為0.8 U。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃ 1 min,33個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。選用10個繡球品種對建立的SSR-PCR反應體系進行驗證,結果表明該體系具有較好的穩(wěn)定性和通用性。建立和優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應體系,為應用SSR分子標記技術開展繡球?qū)僦参镞z傳育種研究提供了理論依據(jù)和技術參考。

繡球;SSR-PCR;正交設計;反應體系

繡球(Hydrangeamacrophylla)又稱八仙花、紫陽花,是虎耳草科(Saxifragaceae)繡球?qū)?Hydrangea)植物,主要分布于亞洲東南部和南北美洲[1]。全世界繡球?qū)僦参锛s有73種,而我國是繡球?qū)僦参锏闹饕植贾行?現(xiàn)有47種和11個變種,約占世界資源的63%[2]。繡球的花序、花型、花色非常豐富,葉大而具有光澤,既可觀花又可觀葉,是世界園林中非常重要的觀賞植物。繡球在不良環(huán)境中表現(xiàn)出較強的適應能力,具有耐蔭、耐寒、抗病蟲害等優(yōu)良特性[3]。繡球不僅具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值,還具有一定的藥用價值[4]。因此,繡球作為一種觀賞兼藥用的優(yōu)良觀賞植物,在現(xiàn)代城市園林綠化中具有著廣闊的應用前景。

簡單重復序列(Simple sequence repeat,SSR)又稱為微衛(wèi)星DNA,該標記技術具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復性好、易檢測等優(yōu)點,廣泛應用于植物遺傳育種研究[5-9],但在繡球?qū)僦参镅芯恐袘孟鄬^少。SSR標記是一種基于PCR的分子標記技術,在檢測過程中易受PCR反應體系中多種因素的影響。目前,國內(nèi)還未見關于繡球?qū)僦参颯SR-PCR反應體系的研究報道,因此建立一套穩(wěn)定、高效的SSR-PCR反應體系對于開展繡球研究很重要。本研究利用正交設計對SSR-PCR反應體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶這5個主要因素進行優(yōu)化試驗,篩選出各個因素的最佳水平,建立適合繡球的SSR-PCR反應體系。建立和優(yōu)化的SSR-PCR反應體系,為利用SSR分子標記技術開展繡球?qū)僦参镞z傳育種研究提供理論依據(jù)和技術參考。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.2生物試劑

SSR-PCR反應體系中的10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、DNA Marker、Loading Buffer,購自南京鼎國生物技術有限公司。

1.3基因組DNA提取與檢測

利用CTAB法提取10個繡球品種的基因組DNA[10]。利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行檢測,然后用微量分光光度計(Nano DropTMSpectrophotometer)測定DNA的純度和濃度,根據(jù)A260/280比值判斷DNA純度。最后將DNA濃度稀釋至100 ng/μL,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試繡球材料

1.4SSR-PCR反應體系正交試驗設計

以大花繡球品種史歐尼的基因組DNA為模板,針對影響SSR-PCR反應的5個主要因素(Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量)進行優(yōu)化試驗。為明確這5個主要因素在SSR-PCR反應體系中的最佳水平,每個因素設置5個水平,每個因素的梯度設置見表2。采用正交設計L25(56)進行分析,實施方案見表3。PCR反應液中除表2中所列之外,還需加入10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.0 μL,剩余用ddH2O進行補充,擴增體系總體積為20 μL。

1.5PCR擴增與檢測

總而言之，情緒管理對于大班幼兒的心理健康成長有著極其重要的作用。文章先分析了大班幼兒的情緒特點，然后從營造良好情緒氛圍、教會情緒管理方法、加強家園合作力度方面提出了大班幼兒情緒管理能力培養(yǎng)對策，以供其他幼兒教師參考借鑒。

PCR反應在Biometra T-Professional Thermocycler 儀上進行。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃延伸1 min,總共33個循環(huán);72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。反應結束后,擴增產(chǎn)物中加入2 μL Loading Buffer混勻,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。每個組合設有3個重復,均在相同條件下進行PCR擴增和電泳檢測。

表2　繡球SSR-PCR反應體系的因素與水平

表3　繡球SSR-PCR反應體系的正交試驗設計L25(56)

1.6統(tǒng)計與數(shù)據(jù)分析

參照何正文等[11]的方法對PCR擴增的電泳結果進行統(tǒng)計,根據(jù)主帶數(shù)量、非特異性帶數(shù)量、清晰度和彌散程度4個因素,依次對每個處理組合進行評分。主條帶擴增數(shù)越多、非特異性條帶數(shù)越少、條帶清晰度越強、彌散程度越小的評分值越高,反之評分值就越低;最高記為25分,最低記為1分。將試驗結果輸入SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反應體系的驗證

利用優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應體系,選取30對SSR引物對10個繡球試材進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,驗證該反應體系的穩(wěn)定性和通用性。

2　結果與分析

2.1DNA提取及質(zhì)量檢測

利用CTAB法提取10份繡球試材的基因組DNA呈白色絮狀、溶解后為透明狀。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA條帶清晰且無降解現(xiàn)象,說明DNA的完整性好(圖1)。經(jīng)微量分光光度計檢測,DNA濃度為130～560 ng/μL,A260/280比值為1.8～2.0,說明DNA的純度高,可滿足SSR-PCR反應要求。

圖1　CTAB法提取繡球基因組DNA的電泳結果

2.2繡球SSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化

2.2.1SSR-PCR反應正交設計方差分析根據(jù)正交設計L25(56)進行PCR反應,采用直觀分析法對25個組合的擴增結果進行評分。根據(jù)每個組合3次重復的擴增結果進行獨立評分,得分依次為:1、6、8、7、6、12、9、7、5、8、19、24、11、12、10、13、15、12、16、11、9、20、17、13、3;1、7、9、6、5、10、8、7、4、8、22、24、13、11、9、12、13、11、15、12、8、18、14、11、2;1、5、8、7、5、11、10、8、4、7、20、25、14、12、11、13、15、13、16、10、9、19、15、12、3。將3次重復的評分值取平均數(shù),根據(jù)平均得分結果進行方差分析。

利用SPSS 17.0軟件對直觀分析的評分結果進行方差分析,結果表明,Mg2+對反應體系的影響最大,而引物對反應體系的影響最小,5個因素水平的變化對繡球SSR-PCR反應體系的影響從大到小依次為:Mg2+>Taq聚合酶>dNTPs>DNA模板>引物(表4)。不同重復之間的差異不顯著,證明3個重復的評分結果有較強的一致性。

表4　繡球SSR-PCR反應體系正交設計方差分析

注:**.在0.01水平上差異顯著。

Note:**.Significant difference at the 0.01 level.

2.2.2DNA模板用量對SSR-PCR反應體系的影響本試驗對DNA模板用量設置了5個梯度水平(20,40,60,80,100 ng),結果表明，結果均值隨著DNA模板用量的增加呈先升高后下降的趨勢(圖2)。當DNA模板用量為20 ng時,擴增條帶較弱;DNA模板用量增至60～100 ng時,擴增條帶亮度增強且數(shù)量相對增加。從節(jié)省模板用量方面考慮,選擇60 ng作為DNA模板的適宜用量。

圖2　DNA模板濃度與結果均值的關系

2.2.3Mg2+濃度對SSR-PCR反應體系的影響Mg2+是Taq聚合酶的激活劑,濃度過低會降低酶活性,而濃度過高會擴增出非特異性產(chǎn)物。從圖3可以看出,隨著Mg2+濃度的增加結果均值呈先升高后下降的趨勢,并且各個濃度之間均達到差異明顯水平。當Mg2+濃度為0.5 mmol/L時,擴增條帶很弱;Mg2+濃度增加至1.5 mmol/L,擴增條帶清晰且無非特異性條帶;當Mg2+濃度大于1.5 mmol/L,擴增條帶亮度無明顯變化,但出現(xiàn)非特異性條帶。因此,本研究選擇1.5 mmol/L為繡球SSR-PCR反應體系中Mg2+濃度的最佳反應水平。

圖3　Mg2+濃度與結果均值的關系

2.2.4dNTPs濃度對SSR-PCR反應體系的影響dNTPs是SSR-PCR反應體系的重要底物,其濃度的大小直接影響PCR擴增的效率。結果表明,結果均值隨著dNTPs濃度的增加逐漸升高,在0.3 mmol/L時達到最大值,然后隨著dNTPs濃度繼續(xù)增加結果均值開始降低(圖4)。因此,選擇0.3mmol/L為SSR-PCR反應體系的最佳反應水平。

圖4　dNTPs濃度與結果均值的關系

2.2.5引物濃度對SSR-PCR反應體系的影響引物濃度對SSR-PCR反應體系的影響如圖5所示,結果均值隨著引物濃度的增加呈升高的趨勢。引物濃度為0.1～0.5 μmol/L時,均有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。當引物濃度為0.1 μmol/L時,由于引物濃度過低擴增條帶較弱;隨著引物濃度的增加,擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量也逐漸增加?？紤]到引物濃度過高,有可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物,確定0.4 μmol/L作為引物的最佳濃度,其擴增產(chǎn)物質(zhì)量最好。

圖5　引物濃度與結果均值的關系

2.2.6Taq聚合酶用量對SSR-PCR反應體系的影響Taq聚合酶是SSR-PCR反應體系中的重要因素之一。從圖6可以看出,Taq聚合酶用量對SSR-PCR反應體系的影響僅次于Mg2+濃度,結果均值隨著Taq聚合酶用量的增加呈先升高后降低的趨勢,在0.8 U時達到最大值。當Taq聚合酶用量超過0.8 U時,結果均值呈逐漸降低的趨勢,擴增條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象,且非特異性擴增條帶增多(圖6)。從擴增效率和節(jié)約經(jīng)濟方面綜合考慮,確定0.8 U為Taq聚合酶最適用量。

圖6　Taq聚合酶用量與結果均值的關系

2.3最佳SSR-PCR反應體系的驗證

綜合上述分析,優(yōu)化后的繡球SSR-PCR反應體系如下:20 μL反應體系中Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,DNA模板量為60 ng,Taq聚合酶量為0.8 U。反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃ 1 min,33個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

以大花繡球品種史歐尼基因組DNA為模板,采用上述正交設計試驗優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應體系對30對SSR引物進行篩選,從中篩選出了擴增條帶清晰、穩(wěn)定性好的16對引物。利用這16對引物對10個繡球品種基因組DNA進行PCR擴增,進一步驗證上述反應體系的擴增效果。其中,引物HM-3、HM-7和HM-12的擴增結果電泳圖譜中可檢測到清晰明亮且具有多態(tài)性的條帶(圖7)。

圖7　引物HM-3、HM-7和HM-12對10個繡球品種擴增的結果

3　討論

近年來,在許多植物中關于SSR-PCR反應體系優(yōu)化的研究已有很多,但在繡球中還未見相關報道。建立SSR-PCR反應體系是應用SSR標記技術的前提,但是不同植物的最佳反應體系會有所不同,建立適合繡球的SSR-PCR反應體系非常重要。目前,PCR反應體系進行優(yōu)化主要采用單因素梯度試驗法和正交設計試驗。采用單因素梯度試驗法優(yōu)化PCR反應體系,需要進行多次梯度試驗,這樣不僅時間消耗長、試驗成本高,而且不能準確地反映出各因素間的交互關系[12]。本試驗采用的正交試驗設計是一種快速、經(jīng)濟、高效的試驗設計方法,利用規(guī)格化的正交表將各個試驗因素、水平之間的組合進行均勻搭配,選擇具有代表性的水平組合進行試驗,得到最佳的水平組合,充分考慮了各試驗因素的平均分配和交互作用[13]。

PCR反應是一個多因素控制的綜合反應體系,容易受到DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶等因素的影響,其中每個因素都有可能會影響到擴增的效率、特異性及產(chǎn)量[14]。本研究首次利用正交設計對影響繡球PCR反應體系的5個主要因素進行優(yōu)化試驗,建立適合于繡球的SSR-PCR反應體系(20 μL):Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,DNA模板量為60 ng,Taq聚合酶量為0.8 U,ddH2O補至20 μL。Mg2+濃度直接影響擴增的效率和特異性,適宜的Mg2+濃度對PCR反應非常重要[15]。本研究發(fā)現(xiàn),Mg2+濃度對繡球PCR反應體系的影響最大,這一結果與向日葵[15]、梨[16]、紫葉酢漿草[17]等植物的研究結果相似。在本研究中,Taq聚合酶量對繡球PCR反應體系的影響僅次于Mg2+濃度,當用量高時會有非特異性擴增條帶產(chǎn)生,并且增加試驗成本。這一結果與藥用菊花[18]、苦參[19]等植物的研究結果不同,認為Taq聚合酶對PCR反應的影響最大,分析這種差異可能與研究物種和不同因素水平設計有關。dNTPs濃度對繡球PCR反應也會有一定的影響,濃度低時會影響擴增的效率,而濃度高時會與Taq聚合酶競爭結合Mg2+進而降低酶活性。在本試驗中,當dNTPs濃度為0.3 mmol/L時擴增結果最好,這與任鵬鴻等[20]對菊芋SSR-PCR反應體系優(yōu)化的結果一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)引物濃度對繡球SSR-PCR反應的影響最小,在0.1～0.5 μmol/L的濃度內(nèi)均有擴增產(chǎn)物出現(xiàn),但引物濃度過高會產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

本試驗利用建立的繡球SSR-PCR反應體系進行SSR引物篩選,從30對引物中篩選出了擴增條帶清晰、重復性好的16對SSR引物,表明該體系具有較好的穩(wěn)定性和重復性。利用這些引物對10個繡球品種的基因組DNA進行PCR擴增,其中3對引物的擴增條帶清晰且具有多態(tài)性,進一步驗證了該反應體系具有較好的通用性。因此,本研究建立和優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應體系,為SSR分子標記技術應用于繡球植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、標記輔助育種等研究提供了理論依據(jù)和技術支持。

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Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System inHydrangeamacrophylla

JIA Xinping,SUN Xiaobo,LIANG Lijian,DENG Yanming,SU Jiale,ZHOU Jiantao

(Institute of Horticulture,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Nanjing210014,China)

In order to establish and optimize the SSR-PCR reaction system ofHydrangeamacrophylla,and the orthogonal design L25(56)was applied to optimize the five main factors(Mg2+,dNTPs,primers,DNA template,andTaqenzyme)at five levels of SSR-PCR reaction system.The PCR result was analyzed to select the best levels of five factors and established the suitable SSR reaction system forHydrangeamacrophylla.The results showed that the optimal SSR-PCR system of 20 μL volumes consists of 60 ng DNA template,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L primer,and 0.8 UTaqpolymerase.PCR amplification procedures were pre-denaturation for 5 min at 94 ℃;followed by 33 cycles of denaturation for 1 min at 94 ℃,annealing at a suitable for primers for 40 s,extension for 1 min at 72 ℃;and a final extension for 10 min at 72 ℃,then stored at 4 ℃.The optimal SSR-PCR reaction system was used to verify by 10 cultivars ofHydrangeamacrophylla,and the results showed that it was excellent stability and repeatability for the optimal reaction system.The establishment of this reaction system provides a theoretical basis and technical references for further research on the genusHydrangeaby SSR markers.

Hydrangeamacrophylla;SSR-PCR;Orthogonal design;Reaction system

2016-06-13

江蘇省科技支撐計劃項目(BE2014408)；江蘇省農(nóng)科院成果轉(zhuǎn)化與推廣項目(KF15(5005))

賈新平(1983-),男,山西晉城人,助理研究員,博士,主要從事觀賞植物分子生物學研究。

周建濤(1965-),男,江蘇武進人,研究員,博士,主要從事園藝及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究。

S68.03

A

1000-7091(2016)04-0068-06

10.7668/hbnxb.2016.04.012