接種不同根瘤菌對紫花苜蓿固氮效能及生物量的影響

韓志順,鄭敏娜,梁秀芝

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高寒區(qū)作物研究所,山西 大同　037008)

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接種不同根瘤菌對紫花苜蓿固氮效能及生物量的影響

韓志順,鄭敏娜,梁秀芝

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高寒區(qū)作物研究所,山西 大同037008)

為了在晉北生態(tài)區(qū)給主要推廣品種篩選適宜的高效根瘤菌,使紫花苜蓿-根瘤菌共生體充分發(fā)揮共生固氮作用,建立高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿生產(chǎn)體系。將中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心篩選出的9株紫花苜蓿根瘤菌作為試驗(yàn)材料,以山西大同地區(qū)的土壤為基質(zhì),結(jié)合溫室盆栽和田間試驗(yàn),比較供試材料的結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性、株高、生物量等指標(biāo)的變化情況。篩選出適合供試材料巨能耐鹽紫花苜蓿品種的4株高效根瘤菌CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198,并將這4株菌進(jìn)行田間接種效果驗(yàn)證。結(jié)果表明,接種 CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198后,全年干草產(chǎn)量分別比對照增加18.7%,15.8%,11.3%和13.3%,單位面積蛋白質(zhì)產(chǎn)量分別比對照增加10.9%,10.2%,9.7%和10.1%,其中,CCBAU30015表現(xiàn)最為突出,在各個(gè)指標(biāo)上與對照間差異均顯著(P<0.05)。說明通過土壤篩選的高效根瘤菌可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

根瘤菌;紫花苜蓿;篩選;干草產(chǎn)量

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是優(yōu)良的多年生豆科牧草,在悠久的栽培歷史中,以其獨(dú)特的作用和功能長期享有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。它不僅具有高蛋白質(zhì)、高產(chǎn)草量、強(qiáng)適應(yīng)性等特點(diǎn),而且還能利用其高效的固氮能力培肥地力,改善生態(tài)環(huán)境。近年來,隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展及產(chǎn)業(yè)的重新布局,紫花苜蓿在農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)中發(fā)揮的作用越來越大,是草牧業(yè)發(fā)展中首選的豆科牧草。因此,建立高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的紫花苜蓿生產(chǎn)體系,是促進(jìn)現(xiàn)代草牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。而建立高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)體系最重要的方法之一,是給紫花苜蓿接種高效根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)。國內(nèi)外眾多研究表明,苜蓿接種根瘤菌可以促進(jìn)苜蓿早結(jié)瘤、多結(jié)瘤和增加固氮量[2],增產(chǎn)效果非常顯著[3],該措施可以使根瘤菌-紫花苜蓿共生體從空氣中固氮的總量達(dá)到 200～400 kg/hm2[4],可為生長期的紫花苜蓿提供發(fā)育所需的46%～92%的氮素[5]。目前,在美國、澳大利亞和加拿大,紫花苜蓿接種根瘤菌技術(shù)已經(jīng)被普遍接受[6-7],其中,美國80%的紫花苜蓿在種植之前都會(huì)進(jìn)行根瘤菌接種。

根瘤菌-苜蓿的共生固氮作用是一個(gè)非常復(fù)雜的相互作用過程,根瘤菌的固氮效率受到多個(gè)因素的影響,例如,根瘤菌基因組、宿主基因組和土壤環(huán)境因子等[8]。陳丹明等[9]、陳文新[10]的研究結(jié)果表明,在相近的生態(tài)環(huán)境條件下,同一根瘤菌可以與不同植物共生固氮;在不同的生態(tài)環(huán)境中,不同根瘤菌可以與同一植物結(jié)瘤固氮。石茂玲等[11]研究指出,在相同的土壤條件下,接種同一根瘤菌株并不能使所有苜蓿品種獲得相同的接種效果,可能其中某一品種可以產(chǎn)生優(yōu)異表現(xiàn)的菌株,而對其他品種則無效。Tan 等[12]和陳丹明等[9]有相似的見解,研究發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮效率涉及到寄主植物、根瘤菌和環(huán)境三者之間的互作,進(jìn)行根瘤菌選種時(shí)不能只考慮與寄主的匹配性,必須要全面考慮到接種的根瘤菌與種植的生態(tài)環(huán)境及寄主植物的匹配程度。因此,為晉北生態(tài)區(qū)主要推廣品種篩選合適的高效根瘤菌,使紫花苜蓿-根瘤菌共生體充分發(fā)揮共生固氮作用,避免工業(yè)肥料的盲目施用,建立高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)體系具有重要意義。

本試驗(yàn)以山西大同地區(qū)的鹽堿土壤為基質(zhì),在溫室條件下對山西省北部生態(tài)區(qū)最近推廣種植的紫花苜蓿品種巨能耐鹽進(jìn)行高效根瘤菌篩選,旨在篩選出對巨能耐鹽紫花苜蓿具有最佳共生效能的根瘤菌菌株,并將篩選出的高效根瘤菌菌株進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,以檢驗(yàn)所篩選菌株的接種效果,為建立紫花苜蓿高效生產(chǎn)體系提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1　材料和方法

1.1供試材料

1.1.1供試品種根據(jù)近年來在華北地區(qū)的品種推廣及其應(yīng)用現(xiàn)狀,選擇巨能耐鹽紫花苜蓿品種,該品種由北京克勞沃草業(yè)有限公司提供。

1.1.2供試菌株選擇9個(gè)根瘤菌菌株進(jìn)行篩選試驗(yàn),所有菌系的寄主植物均為紫花苜蓿,具體菌株編號及來源如表1所示。

表1　供試根瘤菌菌株編號及來源

1.2盆栽及試驗(yàn)地概況

1.2.1盆栽土壤來源及概況溫室盆栽土壤采自山西省大同市東王莊山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所試驗(yàn)站,選擇3～30 cm的耕層土壤,在取樣地隨機(jī)選取 5個(gè)樣點(diǎn),混合后采用四分法,稱取2.5 kg的土壤移入花盆中。土壤類型為鹽堿土,有機(jī)質(zhì)14.68 g/kg,pH 值8.42,全氮0.831 g/kg,速效鉀59 mg/kg,有效磷5.46 mg/kg。

1.2.2試驗(yàn)地概況試驗(yàn)地位于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所試驗(yàn)站,東經(jīng)112°34′～114°34′,北緯39°03′～40°44′,年平均降雨量為400 mm左右。試驗(yàn)區(qū)域土壤類型為輕壤偏沙,0～20 cm耕層土壤中含鹽量為3～5 g/kg,容重為1.53 g/cm3,其余理化指標(biāo)為:土壤有機(jī)質(zhì)14.83 g/kg,pH值8.46,全氮0.88 g/kg,有效磷5.64 mg/kg，速效鉀61 mg/kg。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌株的培養(yǎng)將菌株接種于YMA培養(yǎng)基培養(yǎng)[13],平板劃線純化,鏡檢純度合格后,挑單菌落接種于YEM培養(yǎng)基,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h備用。

1.3.2種子處理及接種選擇均勻飽滿的苜蓿種子,先用95%乙醇和0.1%升汞各處理5 min,后用無菌水沖洗8次,再將種子置于內(nèi)含無菌紗布和少量無菌水的滅菌培養(yǎng)皿中,在28 ℃條件下催芽36 h,待長出1 cm左右的幼根時(shí)即可種植。在無菌條件下,將種苗放入培養(yǎng)皿中用菌液浸泡 15 min,然后移栽于已澆透水的花盆中,每個(gè)花盆栽植25株,并將多余的菌液倒入花盆中。根據(jù)測定菌液的OD值(λ=600 nm),保證接種時(shí)每株種苗接菌量達(dá)到1.0×109個(gè)以上,以不接菌者為空白對照,每處理重復(fù)3次。

1.3.3盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用9株根瘤菌菌株,以花盆為種植單位,每個(gè)處理重復(fù) 3 次。培養(yǎng)箱溫度為25 ℃、光強(qiáng) 7 000～8 000 lx、光照時(shí)間 14 h,根據(jù)花盆中失水狀況定期補(bǔ)充澆水。

1.3.4田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)于2015年 4-9月進(jìn)行,采用完全隨機(jī)試驗(yàn)區(qū)組設(shè)計(jì),小區(qū)面積 3 m×3 m,重復(fù)3次。采用條播,播深1.0～2.5 cm,行距25 cm。開溝播種后,將通過篩選后所得的液體菌劑施于種子周圍,并覆土、鎮(zhèn)壓。

1.4觀測內(nèi)容及方法

1.4.1室內(nèi)篩選測定指標(biāo)及項(xiàng)目幼苗培養(yǎng)至45 d左右時(shí),觀測幼苗的結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性(采用乙炔還原法測定)、株高(測定從子葉葉痕處至最高生長點(diǎn)的距離),并測定地上部分干質(zhì)量(以第1片子葉葉痕處作為刈割點(diǎn),取樣后,先將樣品在烘箱中 120 ℃殺青 40 min,后于 60 ℃烘干至恒重),莖、根的含氮量(采用凱氏定氮法測定)。

1.4.2田間測定指標(biāo)及項(xiàng)目收獲前,每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取15株植株挖根,挖土深度為30 cm,用水充分沖洗后計(jì)算根瘤數(shù);在初花期時(shí),選取生長均勻一致的1 m2樣方收獲測產(chǎn),每個(gè)小區(qū)重復(fù)3次;每次收獲后,取一部分樣品烘干后進(jìn)行粉碎,利用凱氏定氮法測定不同收獲茬次的粗蛋白含量,并計(jì)算理論粗蛋白含量及產(chǎn)量,每個(gè)小區(qū)重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件Excel和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1溫室盆栽紫花苜蓿品種高效根瘤菌篩選

2.1.1接種不同根瘤菌菌株后植株含氮量、總含氮量和固氮酶活性的變化由表2可知,在9個(gè)供試菌株中,與對照相比,除CCBAUG275和ACCC17544外,莖含氮量均高于對照,表現(xiàn)較好的是HBU07004、CCBAU30015和CCBAU30198;除菌株CCBAU45236外，其余各供試菌株對根含氮量與對照間差異顯著(P<0.05),在總含氮量方面,所有供試菌株均高于對照處理,表現(xiàn)較好的依次是CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1,均與對照間差異顯著(P<0.05);對固氮酶活性影響較顯著的菌株依次是CCBAU NMC024-1、CCBAU30015和CCBAU30198,與對照間差異顯著(P<0.05)。綜合4個(gè)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)盆栽條件下,CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1這4個(gè)供試菌株的表現(xiàn)最好。

表2　接種不同根瘤菌后莖含氮量、根含氮量、總含氮量和固氮酶活性的變化

注:同列不同字母表示相互間差異顯著 (P<0.05) 。表3-6同。

Note:In the same column,different letters mean significant difference by fisher,LSD 0.05.The same as Tab.3-6.

2.1.2接種不同根瘤菌菌株后結(jié)瘤率、地上部分株高及干物質(zhì)量的變化由表3可知,在9個(gè)供試菌株中,結(jié)瘤較好的菌株依次是CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、CCBAU30198和HBU07004,分別為96.333%,91.000%,90.333%和84.667%,與對照間差異顯著(P<0.05);地上部分株高表現(xiàn)最好的是CCBAU30015,達(dá)到23.366cm,較對照高出71.4%,其余表現(xiàn)最好的幾個(gè)菌株依次為CCBAU30198(20.789 cm)>HBU07004(19.621 cm)>CCBAU NMC024-1(16.898 cm);在地上干物質(zhì)量方面,僅HBU07004與對照有顯著差異(P<0.05),比對照增產(chǎn)42.5%,其余表現(xiàn)較好的菌株依次是CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、CCBAU45236和CCBAU30198,分別較對照增產(chǎn)21.9%,20.0%,16.4%和13.9%,但差異均不顯著。

綜合表2,3的各項(xiàng)指標(biāo)得出,盆栽條件最適合大同土壤的根瘤菌有CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1。

表3　接種不同根瘤菌結(jié)瘤率、地上部分株高和干物質(zhì)量

2.2間接種根瘤菌對根瘤數(shù)的影響

從表4可以看出,接種根瘤菌后紫花苜蓿的結(jié)瘤數(shù)目均多于對照,其中,接種根瘤菌CCBAU30015的紫花苜蓿結(jié)瘤性最好,在第1茬、第2茬、第3茬與對照間均差異達(dá)顯著水平(P<0.05),而接種根瘤菌CCBAU30198的紫花苜蓿結(jié)瘤個(gè)數(shù)最少,在3茬中與對照間差異不顯著;從3個(gè)不同收獲期的單株結(jié)瘤數(shù)對比可知,第3茬根瘤菌的數(shù)量最多,第1茬根瘤菌的數(shù)量次之,第2茬根瘤菌的數(shù)量最少。

表4　紫花苜蓿各處理不同收獲時(shí)期的單株根瘤數(shù)

2.3田間接種根瘤菌對生物量的影響

2.3.1接種根瘤菌對株高、干草產(chǎn)量的影響由表5可知,接種根瘤菌后紫花苜蓿干草產(chǎn)量均明顯提高,但不同茬次間提高幅度不同,表現(xiàn)最好的是CCBAU30015,在3茬中株高和干草產(chǎn)量均與對照間差異顯著(P<0.05),與對照相比,第 1茬、第 2茬和第 3茬干草產(chǎn)量分別增加19.7%,17.7 %,19.1%;接種CCBAU NMC024-1后,第 1茬、第 2茬和第 3茬干草產(chǎn)量分別較對照增加16.6%,15.0%和15.9%;而接種HBU07004和CCBAU30198菌后,第1茬增產(chǎn)的比例低于10%,第2茬和第3茬的增產(chǎn)比例均在10%以上。從全年干草產(chǎn)量情況分析,4個(gè)菌株增產(chǎn)的比例分別為18.7%，15.8%，11.3%，13.3%。

4個(gè)菌株接種后,株高的變化情況與干草產(chǎn)量變化類似,表現(xiàn)最好的菌種是CCBAU30015和CCBAU NMC024-1,第1茬和第2茬的增長比例均在19%以上;而接種HBU07004 和CCBAU30198后,株高僅在第2茬時(shí)增高明顯,增長率分別為13.0%和13.4%。

2.3.2接種根瘤菌對蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響從表6可以看出,與對照相比,接種CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198等4個(gè)菌株后,全年蛋白質(zhì)總產(chǎn)量分別增加10.9%,10.2%,9.7%和10.1%,說明接種根瘤菌能明顯提高紫花苜蓿單位面積蛋白質(zhì)產(chǎn)量。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，認(rèn)為CCBAU30015表現(xiàn)最為突出，在各個(gè)指標(biāo)上與對照均差異顯著(P<0.05)。

表5　接種根瘤菌對株高、干草產(chǎn)量的影響

表6　接種根瘤菌對蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響

3　討論

在自然界中,根瘤菌與豆科植物結(jié)瘤形成的共生體是最為高效的固氮體系[8]。國內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明,豆科牧草(尤其是紫花苜蓿)接種根瘤菌,不但可以促進(jìn)早結(jié)瘤、增加空氣中氮素固定量,提高豆科牧草的產(chǎn)量和品質(zhì),而且還能改善和提高土壤肥力[2,14-16]。鐘文文等[17]在四川雅安等地采集野生根瘤菌對盛世苜蓿品種進(jìn)行接種,試驗(yàn)結(jié)果表明,Y6-1-1、BB 2-2-1-1、WZ-6-2-2 與對照相比,在占瘤率、瘤質(zhì)量、總瘤數(shù)差異顯著,占瘤率都在 72%以上,顯著提高了植株的干質(zhì)量、葉綠素含量、全氮量和產(chǎn)量,其中,WZ-6-2-2 的有效性最高、競爭性最強(qiáng),與對照相比,鮮草產(chǎn)量增加了95.5%,可以用于苜蓿盛世品種的接種。馬霞等[8]研究結(jié)果表明，接種根瘤菌能增加苜蓿的根瘤數(shù)量和根瘤重量苜蓿固氮率固氮量均達(dá)到了最高分別為77.8%和452.51 kg/hm2，接種根瘤菌有效促進(jìn)了苜蓿的生長提高了地上部干物質(zhì)積累增加了有效分枝數(shù)莢果數(shù)及種子產(chǎn)量種子。此外，王平等[18]在半干旱地區(qū)禾豆混播草地生物固氮作用研究中指出，紫花苜蓿接種后固氮率可增長35.5%以上。

在土壤中接種高效根瘤菌株,建立起有效的根瘤菌-苜蓿共生體系是充分發(fā)揮根瘤菌固氮潛能的前提條件。陳文新[10]研究指出,在一個(gè)地區(qū),如果從未種植過或5年以上沒有種過某種豆科植物,則土壤中很難有與該種豆科植物相匹配的根瘤菌,因此,只有篩選與品種相匹配的高效菌株進(jìn)行人工接種,才能達(dá)到增產(chǎn)的目的。目前,在山西中北部推廣種植紫花苜蓿的生產(chǎn)區(qū)多屬?zèng)]有種植過紫花苜蓿的土壤,本試驗(yàn)選擇具有區(qū)域代表性的土壤作為紫花苜蓿共生高效根瘤菌篩選的土壤基質(zhì),旨在以自然土壤條件為篩選基質(zhì),得到能夠快速應(yīng)用當(dāng)?shù)赝寥赖母咝Ц鼍?所以在本試驗(yàn)中未對土壤進(jìn)行滅菌處理。以往,在進(jìn)行大田試驗(yàn)前,對試驗(yàn)用土壤提前滅菌,這使得實(shí)驗(yàn)室篩選的根瘤菌生長環(huán)境與自然土壤條件差異太大,以至于存在篩選的菌株競爭結(jié)瘤能力低于土著根瘤菌,使研究與生產(chǎn)脫節(jié)[13,19]。此外,考慮到苜蓿根瘤菌具有很強(qiáng)的寄主專一性[13,20],在本試驗(yàn)中接種的9株菌株均分離自紫花苜蓿根瘤菌。

在試驗(yàn)過程中,盡可能使田間土壤環(huán)境處于低氮水平,但試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照出現(xiàn)了結(jié)瘤現(xiàn)象,說明可能在試驗(yàn)土壤中存在一定數(shù)量的土著根瘤菌。對比整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果可知,接種篩選高效根瘤CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198后的紫花苜蓿干草產(chǎn)量均比對照增產(chǎn)11.3%～18.7%,蛋白質(zhì)產(chǎn)量比對照增加9.7%～10.9%,尤其是CCBAU30015表現(xiàn)最為突出,在各個(gè)指標(biāo)上均與對照差異顯著(P<0.05),且干草產(chǎn)量增加了18.7%。說明所篩選的根瘤菌競爭能力比較強(qiáng),固氮效率較高,在生產(chǎn)中進(jìn)一步確定其占瘤率后,可以考慮推廣到實(shí)際生產(chǎn)中去。

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Effect of Rhizobium Inoculation on Nitrogen Fixation Activity and Biomass ofMedicagosativaL.

HAN Zhishun,ZHENG Minna,LIANG Xiuzhi

(Institute of the Crops in High Latitude and Cold Climate Area,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Datong037008,China)

To select the suitable high efficient nodule bacteria in the ecological region of Shanxi to the main popularized varieties,make full use of the symbiotic nitrogen fixation of alfalfa,and to establish a high efficient,high yield,high quality alfalfa production system,nine strains were screened from the center of Microbial Resource and Application of CAAS.Soil from Datong of Shanxi Province to screen highly-effective strains for Magnum-salt (a cultivar ofMedicagosativa) in pot in greenhouse was used in this study.The number of nodules,activity of nitrogen fixing enzyme,plant height and biomass were used as test indexes.Strains of CCBAU30015,CCBAU NMC024-1,HBU07004 and CCBAU30198 were selected by this way.Experiments were conducted in field to test their inoculating responses.The results showed that compared with the uninoculated,the hay yield ofM.sativawas increased 18.7%,15.8%,11.3% and 13.3% after inoculating with the strains of CCBAU30015,CCBAU NMC024-1,HBU07004 and CCBAU30198 respectively.And the yield of crude protein (CP) was increased 10.9%,10.2%,9.7% and 10.1%,accordingly.Among the most prominent performance of CCBAU30015,the differences were significant (P<0.05).These results indicated that highly-effectiveSinorhizobiummelilotiscreened from soil andM.sativacultivar could be applied in production.

Rhizobium;MedicagosativaL.;Screening;Hay yield

2016-06-08

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311013-1);山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2013-135);山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種基礎(chǔ)項(xiàng)目(Yyzjc1403);山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種工程項(xiàng)目(16yzgc100);山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所科研項(xiàng)目(ghs2015003)

韓志順(1975-),女,山西大同人,助理研究員,碩士，主要從事牧草栽培及根瘤菌研究。

梁秀芝(1965-),女,山西大同人,研究員,主要從事牧草栽培及根瘤菌研究。

S551;Q939

A

1000-7091(2016)04-0214-06

10.7668/hbnxb.2016.04.033