響應(yīng)面法優(yōu)化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽工藝

曾健輝，朱寶君，王 娟，孔繁茂，馬廣智，3*，黃儒強(qiáng)*

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510600；3.廣東科學(xué)技術(shù)職業(yè)學(xué)院，廣東珠海 519090)

接下表

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響應(yīng)面法優(yōu)化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽工藝

曾健輝1，朱寶君1，王 娟2，孔繁茂1，馬廣智1，3*，黃儒強(qiáng)1*

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510600；3.廣東科學(xué)技術(shù)職業(yè)學(xué)院，廣東珠海 519090)

[目的]優(yōu)化堿性蛋白酶制備海洋低值魚抗氧化肽的工藝。[方法]以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，在酶解溫度、pH、加酶量、底物濃度等條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解低值魚肉制備抗氧化肽的工藝條件。[結(jié)果]在溫度54 ℃、pH 8.8、底物濃度200 g/L、加酶量2 500 U/g的條件下酶解3 h，得到抗氧化肽的DPPH自由基清除率理論值為62.66%，實(shí)際值為61.87%，相對(duì)誤差為1.26%。[結(jié)論]該研究為低值魚抗氧化肽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

響應(yīng)面法；酶解；低值魚；抗氧化肽

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)與科技的快速發(fā)展，水產(chǎn)品的產(chǎn)量及加工能力不斷提高，我國(guó)魚類加工業(yè)較20年前已取得了很大進(jìn)步，但與發(fā)達(dá)國(guó)家水產(chǎn)品加工業(yè)相比，仍存在基礎(chǔ)研究薄弱、加工與綜合利用率低、附加值低等問(wèn)題[1-3]。低值魚占海洋漁獲物的60%～70%，具有體型小、營(yíng)養(yǎng)豐富、種類繁多及產(chǎn)量巨大的優(yōu)點(diǎn)，但由于其極易腐爛、價(jià)格較低使得捕撈與存儲(chǔ)較為困難，再加上無(wú)有效的加工方法，造成生物資源的極大浪費(fèi)[4-5]。提高低值魚的精深加工與綜合利用水平，對(duì)于我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展都有重要意義。

生物活性肽是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物[6]。研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽比氨基酸更易吸收，具有抗高血壓[7]、抗氧化[8]等作用。人類健康在內(nèi)生或者外生自由基和氧化應(yīng)激作用下穩(wěn)態(tài)會(huì)失調(diào)，使細(xì)胞、組織和DNA受到損傷[9]，同時(shí)自由基過(guò)多也會(huì)導(dǎo)致許多疾病如心血管疾病、癌癥等的發(fā)生[10]。目前許多合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)等已廣泛應(yīng)用于食品保存或者抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[11]，但合成抗氧化劑也有一定的危害[12]。來(lái)源于天然食品的抗氧化肽逐漸被廣泛關(guān)注，目前研究者已從多種天然食品如鴨皮[13]、豆類[14]、扇貝[15]等中分離得到了抗氧化肽。筆者以海洋低值魚為原料，通過(guò)堿性蛋白酶解魚肉蛋白制備抗氧化肽，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化低值魚蛋白的酶解工藝條件，探索低值魚的深加工途徑，提高資源利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為低值魚抗氧化肽的開發(fā)利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑海洋低值魚購(gòu)自于市場(chǎng)，堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)購(gòu)自于江蘇瑞陽(yáng)生物有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋：HWS12，上海一恒儀器公司；pH計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)：VirTis，美國(guó)SP公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：CT15RT，天美科學(xué)儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器：85-2，上海思樂(lè)儀器廠；分析天平：BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-5100B，上海元析儀器有限公司；粉碎機(jī)：DT-10A，廣州市綠向生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程。其工藝流程：低值雜魚→清洗→取肉→勻漿→酶解→離心→上清液→冷凍干燥→成品分析。操作要求：①清洗勻漿。將新鮮的雜魚去掉頭、尾和內(nèi)臟，清洗干凈，然后取肉絞碎成魚糜，按比例加入一定量的水，將魚糜打成漿狀。②酶解。將勻漿后的魚肉在漩渦振蕩器中混勻后置于恒溫水浴鍋中保溫15 min，調(diào)節(jié)pH，加入適量酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后立即在沸水浴中加熱10 min滅酶，離心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，上清液冷凍干燥備用。

1.3.2DPPH清除率測(cè)定[16]。以95%乙醇溶液溶解DPPH，配成一定濃度溶液。吸取2 mL的酶解液，加入2 mL DPPH溶液，搖勻后，在室溫下放置30 min，以95%乙醇溶液調(diào)零，測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)1，同時(shí)測(cè)定2 mL酶解液與2 mL 95%乙醇混合溶液在517 nm處的吸光值A(chǔ)2，再測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水在517 nm處的吸光值A(chǔ)0，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3單因素試驗(yàn)。在前期研究基礎(chǔ)上，選用堿性蛋白酶對(duì)低值魚肉進(jìn)行酶解，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)研究加酶量(U/g)、酶解時(shí)間(h)、pH、酶解溫度(℃)和底物濃度(g/L)5個(gè)單因素對(duì)酶解的影響。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在一定酶解時(shí)間(3 h)下，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以加酶量(A)、pH(B)、溫度(C)和底物濃度(D)4個(gè)因素為自變量，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，確定各因素對(duì)酶解物DPPH自由基清除率影響的顯著性和各條件的最佳組合。編碼水平見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1時(shí)間對(duì)酶解的影響。由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解物的DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)3 h后DPPH自由基清除率逐漸下降，反應(yīng)初期酶和底物濃度較大，反應(yīng)速度快，當(dāng)超過(guò)3 h后,由于底物被消耗，同時(shí)酶解產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)有一定的影響，DPPH自由基清除率上升緩慢，因此，選擇酶解時(shí)間為3 h。

圖1　時(shí)間對(duì)酶解的影響Fig.1　The influence of time to enzymatic hydrolysis

2.1.2底物濃度對(duì)酶解的影響。由圖2可知，隨著底物濃度的增大，酶解物的DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在底物濃度為100～200 g/L時(shí)，酶解物的DPPH自由基清除率隨底物濃度的增大而增大，底物濃度為200 g/L時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大時(shí)，反應(yīng)速率變化較小，因此，選擇底物濃度為200 g/L。

圖2　底物濃度對(duì)酶解的影響Fig.2　The influence of substrate concentration to enzymatic hydrolysis

2.1.3溫度對(duì)酶解的影響。由圖3可知，酶解物的DPPH自由基清除率隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在40～55 ℃，DPPH自由基清除率隨著溫度的升高而增大，55 ℃時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率開始下降，這是因?yàn)槊赣羞m宜的溫度范圍，溫度過(guò)高會(huì)影響酶的活性，因此，選擇酶解溫度55 ℃。

圖3　溫度對(duì)酶解的影響Fig.3　The influence of temperature to enzymatic hydrolysis

圖4　pH對(duì)酶解的影響Fig.4　The influence of pH to enzymatic hydrolysis

2.1.4pH對(duì)酶解的影響。由圖4可知，酶解物的DPPH自由基清除率隨pH的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。在pH 7～9時(shí)，DPPH自由基清除率隨pH增大而增大。當(dāng)pH為9時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大。當(dāng)pH超過(guò)9時(shí)，DPPH自由基清除率開始下降，酶解pH會(huì)影響酶的活性，過(guò)酸或者過(guò)堿都不利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此，選擇pH為9。

2.1.5加酶量對(duì)酶解的影響。由圖5可知，隨著加酶量的增大，酶解物的DPPH清除率呈先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。在加酶量1 500～2 500 U/g時(shí)，DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)加酶量大于2 500 U/g時(shí)，DPPH自由基清除率基本保持不變，為了節(jié)約成本選擇加酶量2 500 U/g。

圖5　加酶量對(duì)酶解的影響Fig.5　The influence of enzyme dose to enzymatic hydrolysis

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽的工藝

2.2.1二次響應(yīng)面回歸模型的建立。選用中心復(fù)合模型，設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

接下表

續(xù)表2

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到相應(yīng)回歸方程：DPPH自由基清除率 =62.55+0.088A-0.66B-0.76C+0.041D-0.53AB+0.057AC-1.27AD+4.16BC+0.22BD+0.26CD-8.17A2-4.07B2-4.46C2-7.61×D2，用 Design Expert8.0.5b軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程擬合檢測(cè)P<0.000 1，差異極顯著，同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.652 2>0.05，差異不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾很小，模型擬合度較好，同時(shí)回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.994 2，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有99.42%來(lái)源于所選變量。這說(shuō)明試驗(yàn)方法可靠，能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響程度由大到小依次為C(溫度)、B(pH)、A(加酶量)、D(底物濃度)，方差分析結(jié)果表明，AD、BC之間交互作用極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均極顯著(P<0.001)，表明各考察因素對(duì)酶解工藝參數(shù)的影響具有交互作用，而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.2各因子交互作用的影響。圖6是根據(jù)回歸方程所繪制的響應(yīng)面圖，其中，各圖表示A、B、C、D中任意2個(gè)變量取零水平時(shí)，其余2個(gè)變量對(duì)DPPH自由基清除率的交互影響，它們能直觀地描述2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的交互影響。由圖6可知，響應(yīng)值隨著加酶量、底物濃度、溫度和pH的增大呈先增后降的趨勢(shì)，說(shuō)明這4個(gè)因素在所選范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值。

圖6　各因子交互作用對(duì)抗氧化肽DPPH清除率的響應(yīng)曲面Fig.6　The response surface of the influence of each factor interaction to DPPH scavenging rate

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)。響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化條件：加酶量2 505.13 U/g，溫度54.19 ℃，底物濃度199.8 g/L，pH 8.84，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整參數(shù)為加酶量2 500 U/g，溫度54 ℃，底物濃度200 g/L，pH 8.8進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次得到DPPH的自由基清除率為61.87%，相對(duì)誤差為1.26%。

3　結(jié)論

該試驗(yàn)以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法得到了加酶量、溫度、底物濃度和pH對(duì)DPPH自由基清除率的影響。各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響由大到小依次為溫度、pH、加酶量、底物濃度，通過(guò)響應(yīng)面分析得到低值魚制備抗氧化肽的酶解條件：加酶量2 500 U/g，溫度54 ℃，底物濃度200 g/L，pH 8.8，在此條件下，DPPH的自由基清除率為61.87%。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Antioxidant Peptides from Low Value Fish by Response Surface Methodology

ZENG Jian-hui1, ZHU Bao-jun1, WANG Juan2, MA Guang-zhi1,3*, HUANG Ru-qiang1*et al

(1. School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631; 2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou, Guangdong 510600; 3.Guangdong Institute of Science and Technology, Zhuhai, Guangdong 519090)

[Objective] Optimization of antioxidant peptides from marine low value fish by alkaline protease was studied. [Method] The enzymatic hydrolysis conditions for the preparation of antioxidant peptides were optimized using the response surface methodology based on single factor experiments, including hydrolysis temperature, hydrolysis pH, enzyme dose and substrate concentration. [Result] The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: substrate concentration 200 g/L, enzyme dose 2 500 U/g, pH 8.8, hydrolysis temperature 54 ℃ for 3 h, under these conditions the theoretical value of DPPH free radical scavenging rate was 62.66%, the actual value was 61.87%, the relative error was 1.26%. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of antioxidant peptide of low value fish.

Response surface methodology; Enzymatic hydrolysis; Low value fish; Antioxidant peptides

廣東省產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(2013B090600153)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020312004)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)科技攻關(guān)項(xiàng)目(A201301C10)。

曾健輝(1989- )，女，山西大同人，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取與分離。*通訊作者，馬廣智，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事水生動(dòng)物毒理學(xué)方面的研究。*通訊作者，黃儒強(qiáng)，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物分離方面的研究。

2016-06-17

S 985.1

A

0517-6611(2016)22-080-04