抗人白介素- 17RA單克隆抗體的制備及活性檢測

徐真真，孫春昀，謝良志

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　細(xì)胞工程中心，北京 1000052神州細(xì)胞工程有限公司新藥研發(fā)部，北京 100176

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·論著·

抗人白介素- 17RA單克隆抗體的制備及活性檢測

徐真真1，孫春昀2，謝良志1

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞工程中心，北京 1000052神州細(xì)胞工程有限公司新藥研發(fā)部，北京 100176

目的制備具有中和人白介素- 17RA(hIL- 17RA)免疫活性的單克隆抗體，并探討其生物學(xué)活性。方法通過基因工程技術(shù)制備抗hIL- 17RA的單克隆抗體。采用OctetRED系統(tǒng)檢測其親和力，ELISA、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析抗體的結(jié)合作用和種屬交叉反應(yīng)，人包皮成纖維細(xì)胞- 1上細(xì)胞因子分泌實驗檢測抗體的中和活性。結(jié)果抗hIL- 17RA單克隆抗體親和力常數(shù)KD<1.0×10-12mol/L，并與其他物種有一定的交叉結(jié)合反應(yīng)，它能結(jié)合白介素(IL)- 17RA并有效阻斷其與配體的結(jié)合，抑制下游相關(guān)細(xì)胞因子IL- 6、IL- 8和人CXC趨化因子配體1的分泌。結(jié)論成功制備1株抗hIL- 17RA的中和抗體，為IL- 17RA相關(guān)疾病通路的研究提供了工具，也為IL- 17RA靶點藥物的開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

白介素- 17RA；白介素- 17A；白介素- 17F；抗體；人包皮成纖維細(xì)胞- 1

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：428-433

目前，白介素(interleukin，IL)- 17超家族包括6個配體(IL- 17A～I(xiàn)L- 17F)和5個受體(IL- 17RA～I(xiàn)L17 RE)。IL- 17A最早在1993年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時命名為CTLA8。其受體IL- 17RA于兩年后確認(rèn)，且與以往發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子受體家族無同源性[1]。IL- 17受體家族成員都是一型單次跨膜蛋白，具有保守結(jié)構(gòu)基序，包括胞外的類纖維結(jié)合素Ⅲ結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)的SEF/IL- 17R (SEFIR)結(jié)構(gòu)域。IL- 17A主要由CD4+T細(xì)胞分化的一種新的T輔助細(xì)胞亞群TH17產(chǎn)生[2]。人類的IL- 17A與IL- 17F可以借助二硫鍵形成同源或異源二聚體，與表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等表面的IL- 17RA～I(xiàn)L- 17RC受體復(fù)合物結(jié)合[3]，通過IL- 17RA胞內(nèi)區(qū)段SEFIR募集銜接蛋白ACT1[4]，形成IL- 17RA-Actl-TRAF6信號復(fù)合物，激活下游通路，誘導(dǎo)炎性因子IL- 6、IL- 8、CXCL1等的表達(dá)分泌，并募集動員中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致各種炎癥疾病的發(fā)生[5- 6]。大多自身免疫病和炎癥相關(guān)性疾病如銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、多發(fā)性硬化、呼吸道疾病及炎性腸病等都與IL- 17通路密切相關(guān)，阻斷IL- 17通路是治療此類疾病的一種新途徑，相關(guān)研究已成為醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)研究的熱點，特別是針對IL- 17A靶點的抗體已經(jīng)在很多疾病上呈現(xiàn)出顯著的療效。但有的疾病如腸炎性疾病僅阻斷IL- 17A通路不能達(dá)到理想的效果，需要聯(lián)合阻斷IL- 17A和IL- 17F。IL- 17RA作為目前已知4種配體(IL- 17A、IL- 17F、IL- 17C、IL- 17E)的受體，涉及更為廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物功能。本研究擬制備具有中和活性的抗人IL- 17RA單克隆抗體，用以IL- 17相關(guān)生物學(xué)功能研究的工具試劑，并為IL- 17RA靶點抗體藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

材料人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblast cells，HFF)- 1(ATCC)；IL- 6 ELISA定量檢測試劑盒、HEK- 293E細(xì)胞系、IL- 17A、IL- 17A/F、IL- 17F、人白介素(human interleukin，hIL)- 17RA、鼠白介素(mouse interleukin，mIL)- 17RA、猴白介素(cynomolgus interleukin，cynoIL)- 17RA (北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，Sino Biological)；IL- 8 ELISA定量檢測試劑盒(北京欣博盛生物技術(shù)有限公司)；CXCL1 ELISA定量檢測試劑盒(美國R&D)；TRIzol試劑 (美國Invitrogen)；鏈霉親和素探針，OctetRED生物分子相互作用系統(tǒng)(美國Pall Corporation)；凝膠圖象分析系統(tǒng)ChampGel- 1000(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；FACSCalibur(美國BD)；酶標(biāo)儀Multiskan MK3(美國Thermo)；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR)。

hIL- 17RA抗體的制備用獲得的hIL- 17RA重組蛋白抗原與佐劑按照1∶1的比例充分混合乳化后，對兔子皮下分點注射進(jìn)行免疫。取4次免疫的血清抗體滴度合格的兔子脾臟和骨髓構(gòu)建免疫抗體文庫。用TRIzol法提取脾臟骨髓中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，然后用兔抗體引物對組合擴增獲得抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，之后將重輕鏈可變區(qū)連接起來并插入到pComb3噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因Ⅲ上，構(gòu)建成噬菌體載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)擴增獲得噬菌體抗體庫。采用hIL- 17RA重組蛋白淘洗篩選得到特異性結(jié)合的陽性克隆，獲得陽性克隆基因序列，構(gòu)建完整兔抗體表達(dá)質(zhì)粒。將抗體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的HEK- 293E細(xì)胞，培養(yǎng)表達(dá)數(shù)天后，離心取上清過濾純化。將通過蛋白A柱純化捕獲得到的抗體進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。

hIL- 17RA抗體的親和力分析先將標(biāo)記生物素的hIL- 17RA稀釋到終濃度為4 μg/ml的溶液，再將待檢的hIL- 17RA抗體梯度稀釋為4、2、1 μg/ml。將PBS緩沖液、生物素標(biāo)記的hIL- 17RA、PBS緩沖液、hIL- 17RA待檢抗體、PBS稀釋緩沖液按照OCTET儀器預(yù)設(shè)的程序250 μl/孔依次點樣后上機檢測。

hIL- 17RA抗體競爭活性分析分別以1 μg/ml的hIL- 17A，10 μg/ml的hIL- 17A/F和hIL- 17F包被酶標(biāo)板，100 μl/孔，4℃過夜。次日將hIL- 17RA特異性抗體梯度稀釋后加樣。同時將生物素標(biāo)記的hIL- 17RA以0.5、0.5、5 μg/ml分別加入到對應(yīng)的包被hIL- 17A、hIL- 17A/F和hIL- 17F的孔中，100 μl/孔，室溫孵育2 h。最后加入1 μg/ml的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，100 μl/孔，室溫作用1 h后顯色，450 nm處讀取光密度(optical density，OD)值。

hIL- 17RA抗體對抗原結(jié)合的流式分析通過流式分析研究hIL- 17RA抗體對細(xì)胞膜上天然蛋白hIL- 17RA的結(jié)合作用。將HFF- 1細(xì)胞消化離心后分別與濃度為1和0.333 μg/ml的hIL- 17RA抗體孵育20 min后，用1 ml洗液(含1%牛血清白蛋白的pH7.4的PBS緩沖液)洗兩遍，再加入生物素標(biāo)記的hIL- 17A孵育45 min后用1 ml洗液洗兩遍。最后加入熒光二抗 (Alexa Fluor?488標(biāo)記的鏈霉親和素，美國Life Technologies公司)，4℃孵育30 min后離心棄上清，洗液重懸，400目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞樣品到流式管中上機檢測(實驗中設(shè)置陽性對照和陰性對照：陰性對照中細(xì)胞只與二抗孵育；陽性對照中細(xì)胞與生物素標(biāo)記的hIL- 17A蛋白孵育后再與二抗孵育；實驗組中細(xì)胞先與待檢抗體孵育，再加入生物素標(biāo)記的hIL- 17A蛋白孵育，最后加入二抗孵育)。

hIL- 17RA抗體的交叉結(jié)合反應(yīng)通過Western blot和ELISA分別從線性表位和構(gòu)象表位上鑒定hIL- 17RA抗體與不同物種IL- 17RA的交叉結(jié)合。3種重組蛋白分別為hIL- 17RA、cyno IL- 17RA和mIL- 17RA。

Western blot：將20 ng/ml的hIL- 17RA、20 ng/ml的cynoIL- 17RA、200 ng/ml的mIL- 17RA和陰性對照分別進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后加入抗hIL- 17RA單抗孵育。最后加入山羊抗兔二抗[DyLight800標(biāo)記的抗兔 IgG (H+L)抗體，美國KPL公司]掃描成像。

ELISA：分別將3種蛋白稀釋至0.05 μg/ml，100 μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜。次日，加入2 μg/ml的待檢hIL- 17RA抗體孵育1 h，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG/Fc特異性的山羊抗兔二抗(美國Jackson公司)，室溫孵育1 h后顯色，OD 450 nm處讀值。

hIL- 17RA抗體中和活性的細(xì)胞實驗將處于生長對數(shù)期的HFF- 1細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。次日，10 μl/孔加入梯度稀釋的不同濃度的hIL- 17RA抗體后，分別加入終濃度為50 ng/ml的hIL- 17A、1 μg/ml的hIL- 17A/F、1 μg/ml的hIL- 17F配體刺激，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后雙抗夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌量。ELISA檢測方法按照定量酶聯(lián)檢測試劑盒中的說明書進(jìn)行。中和率(%)=[1-(不同抗體濃度時的因子分泌量-陰性對照)/(陽性對照-陰性對照)]×100%。

結(jié)　　果

hIL- 17RA抗體電泳分析結(jié)果純化獲得的抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，非還原電泳中出現(xiàn)的條帶與單克隆抗體的相對分子質(zhì)量相符；還原電泳中可見兩條清晰條帶，分別是二硫鍵打開后的重鏈和輕鏈所對應(yīng)的相對分子質(zhì)量(圖1)。

hIL- 17RA抗體的親和活性通過OCTET生物分子相互作用儀對抗hIL- 17RA單克隆抗體與抗原h(huán)IL- 17RA的親和力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示抗hIL- 17RA單克隆抗體的結(jié)合速率Kon(1/Ms)為3.73×105，解離速率Kdis(1/s)<1.0×10-7，在不同濃度條件下，親和力常數(shù)KD值都<1.0×10-12mol/L (檢測最小限)，抗hIL- 17RA單克隆抗體具有較強的親和活性(圖2)。

hIL- 17RA抗體競爭結(jié)合活性通過ELISA實驗分析hIL- 17RA抗體與hIL- 17RA配體競爭結(jié)合hIL- 17RA的活性，結(jié)果顯示不同濃度的hIL- 17RA抗體可以與hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F競爭結(jié)合hIL- 17RA，抗體的百分競爭率隨著抗體濃度的升高而升高(圖3)。

hIL- 17RA抗體對天然蛋白的結(jié)合作用流式分析hIL- 17RA抗體對細(xì)胞膜上天然蛋白hIL- 17RA的結(jié)合作用，結(jié)果顯示實驗組中加入hIL- 17RA抗體孵育后(黑色線條)的熒光強度比陽性對照組(黑色陰影)的熒光強度減弱，左移偏向陰性對照組(灰色線條)(圖4)。

IL- 17RA：白介素- 17受體A；SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；Mr：相對分子質(zhì)量；1、4：IL- 17RA抗體；2、3：marker

IL- 17RA：interleukin- 17 receptor A；SDS-PAGE：sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；Mr： relative molecular mass；1,4：IL- 17RA antibody；2，3：marker

A.非還原電泳；B.還原電脈

A.non-reducing SDS-PAGE;B.reducing SDS-PAGE

圖 1IL- 17RA抗體的SDS-PAGE分析

Fig 1SDS-PAGE analysis of IL- 17RA antibody

hIL- 17RA抗體的交叉結(jié)合反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示，在hIL- 17RA、cynoIL- 17RA處出現(xiàn)明顯結(jié)合條帶，在陰性對照和mIL- 17RA處無條帶(圖5)。ELISA實驗數(shù)據(jù)顯示，空白組OD平均值為0.050，3個物種重組蛋白與抗體的結(jié)合OD平均值分別為2.640、2.199、2.383(圖6)。OD值高低與結(jié)合強弱呈正相關(guān)。

hIL- 17RA抗體在細(xì)胞上的中和活性ELISA檢測分泌的蛋白水平對hIL- 17RA抗體的中和活性顯示，在不加入配體刺激時(基準(zhǔn)值，陰性對照)，細(xì)胞的炎性因子IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌量很低；加入配體hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F刺激后(陽性對照，抗體濃度為0時)，3種炎性因子分泌量明顯升高；同時加入濃度為0.64、3.20、16、80、400、2000、10 000 ng/ml的hIL- 17RA中和抗體后，炎性因子分泌量隨著抗體濃度的升高而逐漸降低，并且成濃度梯度依賴性(圖7)。在細(xì)胞分泌的蛋白水平上，抗hIL- 17RA單克隆抗體可以結(jié)合到細(xì)胞表面的hIL- 17RA受體上，中和其配體hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F誘導(dǎo)HFF- 1細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌，且最高中和率達(dá)90%左右。

圖 2抗體親和力的OCTET結(jié)合和解離曲線

Fig 2Affinity curve of IL- 17RA antibody detected by OCTET

圖 3IL- 17RA抗體的競爭結(jié)合活性分析

Fig 3Competition binding analysis of IL- 17RA antibody

黑色線條：依次加入hIL- 17RA抗體、生物素標(biāo)記的hIL- 17A蛋白和二抗孵育的實驗組；黑色陰影：與生物素標(biāo)記的hIL- 17A蛋白和二抗孵育的陽性對照組；灰色線條：只與二抗孵育的陰性對照組

black line： experiment group incubated with hIL- 17RA antibody，biotin-conjugated hIL- 17A and second antibody in sequence；black shadow： positive control group with biotin-conjugated hIL- 17A and second antibody in sequence；gray line： negative control group only incubated with second antibodyA. hIL- 17RA抗體 (1 μg/ml)；B. hIL- 17RA抗體(0.333 μg/ml)

A. hIL- 17RA antibody(1 μg/ml)；B.hIL- 17RA antibody(0.333 μg/ml)

圖 4IL- 17RA抗體的流式分析

Fig 4Analysis of IL-17RA antibody by fluorescence-activated cell sorter

M:marker;1：人IL- 17RA；2：鼠IL- 17RA;3：猴IL- 17RA;4：牛血清白蛋白(陰性對照)

M:marker;1： human IL- 17RA；2： mouse IL- 17RA；3：cynomolgus IL- 17RA；4： bull serum albumin (negative control)

圖 5抗體交叉結(jié)合反應(yīng)的蛋白印跡分析

Fig 5The species cross-reactivity of antibody was identified by Western blot

圖 6抗體交叉結(jié)合反應(yīng)的ELISA分析

Fig 6The species cross-reactivity of antibody was identified by ELISA analysis

陰性對照(基準(zhǔn)值)：空細(xì)胞；陽性對照(抗體濃度為0)：只加配體孵育

negative control(baseline)：null cells；positive control(without antibody)： only incubated with ligands

A.IL- 6；B.IL- 8；C.CXCL1

圖 7IL- 17RA 抗體的中和活性分析

Fig 7Neutralizing activity analysis of IL- 17RA antibody

討　　論

目前很多中和IL- 17A的單克隆抗體已進(jìn)入臨床研究階段[7]，諾華的Secukinumab對于銀屑病適應(yīng)證的新藥申請已在歐洲批準(zhǔn)上市。但是針對IL- 17RA靶點的藥物尚不多見。近年有研究表明，只使用針對IL- 17A靶點的單抗，對于克羅恩病無效，而且相對于安慰劑，還有一定的不良反應(yīng)[8]。如果同時封閉IL- 17A和IL- 17F，而不是單獨中和IL- 17A或IL- 17F，可以改善減輕早期腸炎患者的痛苦[9]。在由吸煙導(dǎo)致的慢性阻塞性肺炎中，氣道的中心和遠(yuǎn)端部位IL- 17A、IL- 17F均有所升高，上皮細(xì)胞這兩個因子及其受體IL- 17R的升高也有著不可忽視的作用[10- 11]。另有研究顯示，慢性牙周炎患者的牙齦組織中IL- 17A和IL- 17F的mRNA水平比健康人高，而且IL- 17F和IL- 17A作用相似，可以誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞中核因子-κB中p65和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化，使重要炎性因子IL- 6、CXCL8和CCL20的分泌量增加[12]，表明IL- 17A和IL- 17F在慢性牙周炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。以上這些均表明只針對單一配體IL- 17A或IL- 17F靶點的單抗尚不足以對很多炎癥性病變有效，這就需要一個能封閉多因子的靶點中和抗體發(fā)揮作用。IL- 17RA抗體可以結(jié)合到IL- 17RA上，不僅可以阻斷IL- 17A與IL- 17RA的結(jié)合，同時也可以阻斷IL- 17F及其二聚體與IL- 17RA受體的結(jié)合，作用范圍更廣。

本研究首先構(gòu)建表達(dá)hIL- 17RA抗原，然后免疫動物獲得抗hIL- 17RA單克隆抗體。該單抗在非還原電泳中出現(xiàn)了一條稍離散的條帶，稍微離散的條帶經(jīng)高效液相色譜法和質(zhì)譜分析由重鏈糖基化造成。抗體與細(xì)胞膜上天然蛋白IL- 17RA結(jié)合的實驗中，陽性對照熒光強度不夠強可能是因為hIL- 17A相對分子質(zhì)量太小，不容易標(biāo)記所致。實驗結(jié)果與預(yù)期相符：hIL- 17RA抗體阻斷了hIL- 17A與hIL- 17RA的結(jié)合，故而熒光信號減弱，間接表明抗hIL- 17RA單克隆抗體能夠與細(xì)胞膜上天然蛋白hIL- 17RA結(jié)合。競爭結(jié)合抗hIL- 17RA單克隆抗體的百分競爭率越高，表明其與hIL- 17RA競爭結(jié)合活性越高。該高親和力單抗的交叉結(jié)合結(jié)果表明本研究制備的抗體不僅與猴蛋白的線性表位有交叉結(jié)合，而且與猴和鼠蛋白的構(gòu)象表位均有交叉結(jié)合反應(yīng)，這預(yù)示著抗hIL- 17RA單克隆抗體可與其他物種天然蛋白結(jié)合，為以后的動物藥效實驗起到了一定的指導(dǎo)作用。另外，抗hIL- 17RA單克隆抗體還具備較好的生物活性，能夠明顯阻斷hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F與其細(xì)胞膜上受體hIL- 17RA的結(jié)合，有效抑制3個配體誘導(dǎo)的炎性因子IL- 6、IL- 8、CXCL1的分泌。IL- 17RA受體共有4個配體，抗hIL- 17RA單克隆抗體對于其他配體下游通路的阻斷作用尚有待繼續(xù)研究。

綜上，本研究成功制備得到1株具有優(yōu)良生物活性的抗人IL- 17RA的中和抗體，該中和單抗的成功制備，為IL- 17RA靶點相關(guān)通路的研究提供了科研工具，也為后期藥物的進(jìn)一步開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。

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Preparation and Activity Detection of A Novel Monoclonal Antibody to Human Interleukin- 17RA

XU Zhen-zhen1，SUN Chun-yun2，XIE Liang-zhi1

1Cell Engineering Center，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China2New Drug R&D Department，Sinocelltech Ltd.，Beijing 100176，China

XIE Liang-zhiTel：010- 51029808，E-mail：liangzhi@yahoo.com

ObjectiveTo develop a neutralizing antibody to human interleukin- 17RA (hIL- 17RA) and investigate the biological activity of the antibody.MethodsThe anti-hIL- 17RA antibody was produced by recombinant technology while its binding affinity to hIL- 17RA was measured by OctetRED system. The antibody’s blocking activity to hIL- 17RA and cross-reaction between species were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay，Western blot，fluorescence activated cell sorter，while its neutralization activity was measured by inhibiting the secretion of cytokine in human foreskin fibroblast cells- 1. ResultsThe antibody’s affinity constant was less than 1.0×10-12mol/L，with certain cross-reaction among species. Secretion of interleukin(IL)- 6，IL- 8，and chemokine(CXC motif) ligand 1 elicited by IL- 17A，IL- 17A/F，and IL- 17F in human foreskin fibroblast cells- 1 was neutralized by the antibody.ConclusionA novel neutralizing antibody to hIL- 17RA was obtained，which provides research tools for studying hIL- 17RA signal pathways and lays a foundation for drug development targeting hIL- 17RA.

interleukin- 17RA；interleukin- 17A；interleukin- 17F；antibody；human foreskin fibroblast cells- 1

十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09402301) Supported by the Key Project of the “Twelfth Five-year Plan ”for Medical Science Development of China (2013ZX09402301)

謝良志電話：010- 51029808，電子郵件：liangzhi@yahoo.com

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1000- 503X(2016)04- 0428- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.011

2016- 03- 04)