miR- 125a- 5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

賈叢偉，孫　洋，張婷婷，盧朝輝，陳　杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京 100730

?

·論著·

miR- 125a- 5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

賈叢偉，孫洋，張婷婷，盧朝輝，陳杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京 100730

目的探討miR- 125a- 5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法熒光定量PCR檢測(cè)胰腺癌組織中miR- 125a- 5p的表達(dá)水平,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8檢測(cè)下調(diào)miR- 125a- 5p水平對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)miR- 125a- 5p表達(dá)水平對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期和凋亡的影響，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)miR- 125a- 5p在胰腺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。結(jié)果miR- 125a- 5p在胰腺癌組織的表達(dá)高于癌旁正常組織(P<0.05)。下調(diào)miR- 125a- 5p表達(dá)水平后，胰腺癌細(xì)胞系Panc- 1和MIA PaCa- 2的生長(zhǎng)受到抑制(P<0.05)，早期凋亡率分別增加13.6%和11.0%(P<0.05)，細(xì)胞集落數(shù)目分別下降27.3%和27.8% (P<0.05)，Panc- 1細(xì)胞S期細(xì)胞百分比降低11.8% (P<0.05)。結(jié)論miR- 125a- 5p在胰腺癌組織中高表達(dá)，下調(diào)miR- 125a- 5p表達(dá)水平使胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，集落形成能力下降，細(xì)胞周期受到阻滯，凋亡比例增加，提示miR- 125a- 5p在胰腺癌中發(fā)揮癌基因的作用。

胰腺癌；miR- 125a- 5p；癌基因

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：415-421

胰腺癌是一種惡性程度高、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)，胰腺癌分別位居男性、女性腫瘤發(fā)病率的第11位和第8位，而其死亡率卻均高居第4位[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子。成熟的miRNA通過(guò)與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默[2]，參與多種生命活動(dòng)，與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系[3- 4]。miR- 125a- 5p是近年受到廣泛關(guān)注的一個(gè)miRNA，其在肺癌、胃癌、食管癌等疾病中的作用機(jī)制已經(jīng)日漸明朗[5- 6]。到目前為止，還極少有miR- 125a- 5p在胰腺癌中研究的相關(guān)報(bào)道。本研究探討miR- 125a- 5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。

材料和方法

材料10對(duì)胰腺癌及癌旁新鮮組織取自2010年7月至2013年5月北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本，液氮中冰凍保存。4株胰腺癌細(xì)胞系Panc- 1、MIA PaCa- 2、BxPC- 3和AsPC- 1均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。miR- 125a- 5p抑制劑是類似小干擾RNA的片段，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，其序列為5’-UCACAAGUUAG GGUCUCAGGGA- 3’。

細(xì)胞培養(yǎng)Panc- 1、MIA PaCa- 2和AsPC- 1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibico，美國(guó))中，BxPC- 3培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Gibico，美國(guó))中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

轉(zhuǎn)染將細(xì)胞分為3組，轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑(100 nmol/L)的抑制劑組、轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列(negative control，NC)(100 nmol/L)的陰性對(duì)照組和只加轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照組，按lipo2000(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6 h更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后提取RNA。

熒光定量PCR檢測(cè)miR- 125a- 5p表達(dá)水平使用Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))提取組織和細(xì)胞的總RNA，超純水(無(wú)RNA酶、DNA酶)溶解，檢測(cè)濃度和純度。使用Taqman microRNA RT Kit(ABI，美國(guó))，以管家基因U6作為內(nèi)參，用miR- 125a- 5p引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAGGTT- 3’)。使用SYBR?Green PCR Master Mix(ABI，美國(guó))作為核酸染料，配制好反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上游引物(5 μmol/L)2 μl，下游引物(5 μmol/L)2 μl，SYBR Green PCR Master mix 10 μl，加ddH2O至20 μl。在ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增(上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAA- 3’；下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT- 3’)，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))；記錄循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，采用2-△△Ct方法，比較樣品間的表達(dá)差異。

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8檢測(cè)細(xì)胞活性Panc- 1、MIA PaCa- 2細(xì)胞系分組同前，轉(zhuǎn)染后以約3000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h后更換為含10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8的培養(yǎng)基，然后再置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm的光密度值。

碘化丙啶單染檢測(cè)細(xì)胞周期Panc- 1和MIA PaCa- 2細(xì)胞系分組同前，轉(zhuǎn)染后以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，轉(zhuǎn)染72 h后用4℃磷酸鹽緩沖液清洗，胰酶消化，收集細(xì)胞至離心管中，加入70%冰乙醇固定，4℃過(guò)夜，4℃ 800×g離心后棄上清，4℃磷酸鹽緩沖液清洗，于400 μl結(jié)合緩沖液中重懸，加入50 μl RNA酶(Sigma，美國(guó))37℃孵育30 min，避光加入50 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)(50 μg/ml)(Sigma，美國(guó))，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞(FACSAriaⅡ，BD，美國(guó))周期。

膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率按PI單染操作步驟收集細(xì)胞至離心管，離心后棄上清，4℃磷酸鹽緩沖液清洗，按膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅰ(BD，美國(guó))說(shuō)明進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，避光各加入5 μl異硫氰酸熒光素和PI，混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀(C6，BD，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)Panc- 1、MIA PaCa- 2細(xì)胞系設(shè)陰性對(duì)照組和抑制劑組，首先將下層軟瓊脂培養(yǎng)液(10%胎牛血清+0.5%軟瓊脂溶液+1×DMEM培養(yǎng)基)鋪于6孔板，放入4℃冰箱，凝固后，轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染24 h后，以1×104/L的細(xì)胞密度加入上層軟瓊脂培養(yǎng)液中(10%胎牛血清+0.35%軟瓊脂溶液+1×DMEM培養(yǎng)基)，混合均勻后加入鋪有下層軟瓊脂的6孔板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每孔加入200 μl噻唑藍(lán)溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，顯微鏡下觀察集落形成情況，計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

miR- 125a- 5p在胰腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)10例胰腺癌標(biāo)本的基本資料見表1。熒光定量PCR結(jié)果顯示miR- 125a- 5p在胰腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.42，P=0.000)(圖1)。同時(shí)，miR- 125a- 5p在4種胰腺癌細(xì)胞系(AsPC- 1、BxPC- 3、MIA PaCa- 2、Panc- 1)中的相對(duì)表達(dá)水平均高于正常胰腺組織(設(shè)正常胰腺組織為1，4個(gè)細(xì)胞系分別為AsPC- 1=1.37、BxPC- 3=1.61、MIA PaCa- 2=1.46、Panc- 1=1.41)(t=8.81，P=0.003)。

表 1　10例胰腺癌標(biāo)本的基本資料Table 1　General information of 10 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma

圖 1miR- 125a- 5p在胰腺癌組織(T)和癌旁組織(N)中的相對(duì)表達(dá)量

Fig 1The relative expression of miR- 125a- 5p in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues(T) and adjacent normal tissues(N)

轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)、增殖的影響細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8結(jié)果顯示，Panc- 1細(xì)胞中抑制劑組的24、48、72 h數(shù)值分別為0.370、0.502、1.083；MIA PaCa- 2細(xì)胞中抑制劑組的24、48、72 h數(shù)值分別為0.542、0.681、1.198。相對(duì)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑后，Panc- 1和MIA PaCa- 2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后生長(zhǎng)開始受到抑制，并隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用進(jìn)一步增大，培養(yǎng)72 h時(shí)抑制作用最大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞系凋亡的影響膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑 72 h后，Panc- 1

與陰性對(duì)照和空白對(duì)照比較，aF=13.56，aP=0.02；bF=89.89，bP=0.00；cF=9.87，cP=0.04

aF=13.56，aP=0.02；bF=89.89，bP=0.00；cF=9.87，cP=0.04 compared with normal control and mock groups

圖 2轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑后各組Panc- 1(A)和MIA PaCa- 2(B)細(xì)胞的相對(duì)增殖數(shù)量

Fig 2Relative proliferation of Panc- 1(A) and MIA PaCa- 2(B) cell after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

細(xì)胞中，陰性對(duì)照組和抑制劑組異硫氰酸熒光素單陽(yáng)性細(xì)胞比例(即早期凋亡)分別是3.6%和17.2%；異硫氰酸熒光素、碘化丙啶雙陽(yáng)性細(xì)胞比例(即晚期凋亡)分別是5.0%和9.6%。與陰性對(duì)照組相比，Panc- 1細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別升高了13.6 %和4.6 %(早期凋亡：χ2=8.99，P=0.00；晚期凋亡：χ2=1.80，P=0.18)(圖3)。MIA PaCa- 2細(xì)胞中，陰性對(duì)照組和抑制劑組的早期凋亡率分別是5.4%和16.4%；晚期凋亡率分別是7.4%和12.4%。與陰性對(duì)照組相比，MIA PaCa- 2細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別升高了11.0 %和5.0%(早期凋亡：χ2=6.44，P=0.01；晚期凋亡：χ2=1.45，P=0.23)(圖4)。

轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑后，Panc- 1細(xì)胞中抑制劑組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的S期細(xì)胞比例分別為28.2%、37.0%和40.0%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，抑制劑組S期細(xì)胞的比例均明顯下降(P<0.05)(圖5)，但MIA PaCa- 2細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑后，抑制劑組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的S期細(xì)胞比例分別為26.1%、28.2%和26.0%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

FL1-A：通道1-A，代表碘化丙啶染色；FL2-A：通道2-A，代表膜聯(lián)蛋白V染色；Q1-UL：點(diǎn)數(shù)1-左上，為碎片及損傷細(xì)胞；Q1-UR：點(diǎn)數(shù)1-右上，為晚期凋亡及死亡細(xì)胞；Q1-LL：點(diǎn)數(shù)1-左下，為陰性對(duì)照的正常細(xì)胞；Q1-LR：點(diǎn)數(shù)1-右下，為早期凋亡細(xì)胞

FL1-A： flow 1-A，represents propidium iodide staining；FL2-A：flow 2-A，represents annexin V staining；Q1-UL：quantumdots 1-up left，are pieces and damaged cells；Q1-UR：quantumdots 1-up right，are late apoptosis and death cells；Q1-LL：quantumdots 1-low left，are negative control cells；Q1-LR：quantumdots 1-low right，are early apoptosis cells

A. 陰性對(duì)照組;B. miR- 125a- 5p抑制劑組

A. negative control group;B. miR- 125a- 5p inhibitor group

圖 3轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)Panc- 1細(xì)胞早期凋亡的影響

Fig 3Effect on the early apopotosis rate of Panc- 1 cell after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

A.陰性對(duì)照組；B. miR- 125a- 5p抑制劑組

A. negative control group；B. miR- 125a- 5p inhibitor group

圖 4轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)MIA PaCa- 2細(xì)胞早期凋亡的影響

Fig 4Effect on the early apopotosis rate of MIA PaCa- 2 cell after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

A.miR- 125a- 5p抑制劑；B. 空白對(duì)照；C. 陰性對(duì)照

A.miR- 125a- 5p inhibitor；B. mock；C.negative control

圖 5轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)Panc- 1細(xì)胞周期的影響

Fig 5Effect on the cell cycle of Panc- 1 after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

A. miR- 125a- 5p抑制劑；B. 空白對(duì)照；C. 陰性對(duì)照

A.miR- 125a- 5p inhibitor；B. mock；C.negative control

圖 6轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)MIA PaCa- 2細(xì)胞周期的影響

Fig 6Effect on the cell cycle of MIA PaCa- 2 after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞集落形成能力的影響轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑后胰腺癌細(xì)胞的集落形成顯著低于陰性對(duì)照組(圖7、8)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，Panc- 1細(xì)胞中，抑制劑組和陰性對(duì)照組的集落數(shù)分別為(566±44)個(gè)和(778±25)個(gè)，轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑對(duì)集落數(shù)目的抑制率為27.3%；MIA PaCa- 2細(xì)胞中，抑制劑組和陰性對(duì)照組的集落數(shù)分別為(323±35)個(gè)和(447±50)個(gè)，轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)集落數(shù)目的抑制率為27.8%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A. miR- 125a- 5p抑制劑組；B. 陰性對(duì)照組

A. miR- 125a- 5p inhibitor group；B. negative control group

圖 7轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)Panc- 1細(xì)胞集落形成能力的影響

Fig 7Effect on the colony formation ability of Panc- 1 cell after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

A. miR- 125a- 5p抑制劑組；B. 陰性對(duì)照組

A. miR- 125a- 5p inhibitor group；B. negative control group

圖 8轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑對(duì)MIA PaCa- 2細(xì)胞集落形成能力的影響

Fig 8Effect on the colony formation ability of MIA PaCa- 2 cell after transfection with the miR- 125a- 5p inhibitor

討　　論

胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，其相關(guān)分子機(jī)制研究具有重要臨床意義。本研究小組長(zhǎng)期從事胰腺癌分子機(jī)制的研究，已篩選出一些作為癌基因或抑癌基因參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的miRNAs，并發(fā)現(xiàn)一些miRNAs的異常表達(dá)與診斷及預(yù)后相關(guān)。2007年，Bloomston等[7]用組織芯片篩查出miR- 125a在胰腺癌及胰腺炎組織中的表達(dá)高于正常胰腺組織，但未進(jìn)一步研究其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。隨后的研究報(bào)道，miR- 125a- 5p在胃癌[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]、肺癌[5]、結(jié)腸癌[11]等腫瘤中可抑制腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用，在不同腫瘤中表達(dá)程度亦不相同，提示miR- 125a- 5p在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮不同的作用。為探討miR- 125a- 5p在胰腺癌中的表達(dá)及作用，本研究從表達(dá)和功能方面進(jìn)行研究。

首先，本研究收集10對(duì)胰腺癌及癌旁正常組織，提取總RNA，運(yùn)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)miR- 125a- 5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR- 125a- 5p在胰腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，這與Bloomston等[7]的芯片篩選結(jié)果一致。隨后檢測(cè)了4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系(Panc- 1、MIA PaCa- 2、AsPC- 1和BxPC- 3)中miR- 125a- 5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系miR- 125a- 5p的表達(dá)均高于癌旁正常組織。

為了解miR- 125a- 5p在胰腺癌中表達(dá)增高在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并更好地研究miR- 125a- 5p的功能，本研究首先使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8實(shí)驗(yàn)初步探討miR- 125a- 5p與胰腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p抑制劑下調(diào)miR- 125a- 5p的表達(dá)水平后，抑制劑組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，增殖率明顯降低，表明下調(diào)miR- 125a- 5p的表達(dá)水平可抑制Panc- 1、MIA PaCa- 2兩個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)及增殖能力。

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8反映的是活細(xì)胞數(shù)量變化情況，多種因素均可導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量變化，包括影響細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡等。研究證實(shí)miR- 125a- 5p下游有與凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)的一些靶基因，包括Rock- 1基因、E2F3基因等，并發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR- 125a- 5p影響下游通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[12]。為進(jìn)一步探討miR- 125a- 5p抑制劑抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，碘化丙啶單染法檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑 72 h后，與陰性對(duì)照組相比，抑制劑組Panc- 1和MIA PaCa- 2早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例均升高；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Panc- 1的S期細(xì)胞比例明顯降低，而在MIA PaCa- 2細(xì)胞系中，細(xì)胞周期各期的比例卻未發(fā)生變化。兩個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生不一樣的結(jié)果可能與細(xì)胞背景不同有關(guān)。以上結(jié)果提示下調(diào)miR- 125a- 5p表達(dá)水平抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的功能，部分通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，部分通過(guò)影響細(xì)胞周期，引起G0/G1期阻滯實(shí)現(xiàn)。

每個(gè)miRNA都有多個(gè)靶基因，miRNA最終體現(xiàn)出的功能是多個(gè)靶基因間形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)綜合作用的結(jié)果，因此miRNA對(duì)腫瘤的影響也是多方面的。為研究miR- 125a- 5p除影響增殖外，是否影響腫瘤細(xì)胞的集落形成能力，本研究進(jìn)一步通過(guò)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR- 125a- 5p在胰腺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR- 125a- 5p 抑制劑的兩種胰腺癌細(xì)胞Panc- 1和MIA PaCa- 2形成的集落數(shù)目顯著低于陰性對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下調(diào)miR- 125a- 5p的表達(dá)水平可以抑制胰腺癌細(xì)胞的集落形成能力，表明miR- 125a- 5p可以通過(guò)增加胰腺癌細(xì)胞集落形成能力促進(jìn)胰腺癌的惡性轉(zhuǎn)化。

綜上，本研究揭示了miR- 125a- 5p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的部分作用機(jī)制，提示在胰腺癌中異常高表達(dá)的miR- 125a- 5p可能通過(guò)影響細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖；并通過(guò)增加胰腺癌細(xì)胞集落形成能力，促進(jìn)胰腺癌惡性轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果顯示miR- 125a- 5p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中通過(guò)多種途徑發(fā)揮癌基因的作用，miR- 125a- 5p有可能成為胰腺癌的治療靶點(diǎn)。

[1]Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2015 [J]. CA Cancer J Clin，2015，65(1)：5- 29.

[2]Bartel DP. MicroRNAs： genomics，biogenesis，mechanism，and function [J]. Cell，2004，116(2)：281- 297.

[3]Zhang W，Dolan ME. The emerging role of microRNAs in drug responses [J]. Curr Opin Mol Ther，2010，12(6)：695- 702.

[4]Rederstorff M，Huttenhofer A. Small non-coding RNAs in disease development and host-pathogen interactions [J]. Curr Opin Mol Ther，2010，12(6)：684- 694.

[5]Zhu WY，Luo B，An JY，et al. Differential expression of miR- 125a- 5p and let- 7e predicts the progression and prognosis of non-small cell lung cancer [J]. Cancer Invest，2014，32(8)：394- 401.

[6]Fassan M，Pizzi M，Realdon S，et al. The HER2-miR125a5p/ miR125b loop in gastric and esophageal carcinogenesis [J]. Hum Pathol，2013，44(9)：1804- 1810.

[7]Bloomston M，F(xiàn)rankel WL，Petrocca F，et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis [J]. JAMA，2007，297(17)：1901- 1908.

[8]Hashiguchi Y，Nishida N，Mimori K，et al. Down-regulation of miR- 125a- 3p in human gastric cancer and its clinicopathological significance [J]. Int J Oncol，2012，40(5)：1477- 1482.

[9]Hsieh TH，Hsu CY，Tsai CF，et al. miR- 125a- 5p is a prognostic biomarker that targets HDAC4 to suppress breast tumorigenesis [J]. Oncotarget，2015，6(1)：494- 509.

[10]Zheng J，Zhou Z，Xu Z，et al. Serum microRNA- 125a- 5p，a useful biomarker in liver diseases，correlates with disease progression [J].Mol Med Rep，2015，12(1)：1584- 1590.

[11]Tong Z，Liu N，Lin L，et al. miR- 125a- 5p inhibits cell proliferation and induces apoptosis in colon cancer via targeting BCL2，BCL2L12 and MCL1 [J]. Biomed Pharmacother，2015，75：129- 136.

[12]Xu Y，Huang Z，Liu Y.Reduced miR- 125a- 5p expression is associated with gastric carcinogenesis through the targeting of E2F3[J].Mol Med Rep, 2014，10(5)：2601- 2608.

Effects of miR- 125a- 5p on Cell Proliferation，Apoptosis and Cell Cycle of Pancreatic Cancer Cells

JIA Cong-wei，SUN Yang，ZHANG Ting-ting，LU Zhao-hui，CHEN Jie

Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

CHEN JieTel： 010- 69155389，E-mail： xhblk@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of miR- 125a- 5p on cell proliferation，apoptosis and cell cycle of pancreatic cancer cells.MethodsThe expression level of miR- 125a- 5p in pancreatic cancer was determined using quantitative real-time polymerase chain reaction analysis in 4 pairs of pancreatic cancer tissues and matched adjacent normal tissues samples. The expression of miR- 125a- 5p was downregulated in pancreatic cancer cell lines by transfection with miR- 125a- 5p inhibitor. Cell counting kit- 8 assays was conducted to detect the growth ability of pancreatic cancer cell lines. Flow cytometry was applied to detect the cell cycle and apopotosis. Soft agar colony formation test was employed to assess the role of miR- 125a- 5p in process of malignant transformation.ResultsMiR- 125a- 5p was significantly highly expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues than adjacent normal tissues(P<0.05). After the expression level of miR- 125a- 5p in Panc- 1 and MIA PaCa- 2 was downregulated，the growth ability was suppressed(P<0.05)，early apopotosis rate was promoted by 13.6% and 11.0% respectively(P<0.05)，the amount of colony formation was reduced by 27.3% and 27.8%，respectively(P<0.05)，and the percentage of S stage of Panc- 1 was reduced by 11.8% (P<0.05).ConclusionsThe expression of miR- 125a- 5p is high in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues. After the expression level of miR- 125a- 5p is downregulated，the growth ability，colony formation，and cell cycle of Panc- 1 and MIA PaCa- 2 are suppressed，and the early apopotosis rate will be promoted. Therefore，miR- 125a- 5p may play an oncogenic role in pancreatic ductal adenocarcinoma.

pancreatic ductal adenocarcinoma；miR- 125a- 5p；oncogene

國(guó)家自然科學(xué)基金(30973470、81172334)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30973470，81172334)

陳杰電話：010- 69155389，電子郵件： xhblk@163.com

R735.9

A

1000- 503X(2016)04- 0415- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.009

2015- 08- 15)