有機(jī)化工廢水COD高效降解菌的分離篩選及應(yīng)用

張為艷，劉鵬程，鄭鳳娟，吳　敏，張文武

（1.杭州秀川科技有限公司，浙江杭州311121；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

有機(jī)化工廢水COD高效降解菌的分離篩選及應(yīng)用

張為艷1，2，劉鵬程1，鄭鳳娟1，吳敏2，張文武1，2

（1.杭州秀川科技有限公司，浙江杭州311121；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

利用有機(jī)化工廢水培養(yǎng)基從新疆高海拔鹽湖樣品中分離篩選到COD降解菌18株，對COD降解率高的8株菌株混合后處理廢水，與其他普通活性污泥相比，COD去除率更高（86.3%）。經(jīng)16S rDNA初步鑒定，該8株菌分別屬于擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria。將該混合菌群用于生物曝氣池試驗(yàn)，添加尿素0.75 g/L作為氮源，其COD降解率可達(dá)82.5%；添加金槍魚蛋白胨0.5 g/L可使COD降解率提高到92.2%。

有機(jī)化工廢水；菌株篩選；COD降解

化工行業(yè)作為我國經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但同時(shí)也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染〔1〕。特別是化工產(chǎn)業(yè)在生產(chǎn)過程中排放的大量有機(jī)廢水，嚴(yán)重危害人類的健康及生態(tài)環(huán)境的平衡?；U水種類繁多，組分復(fù)雜，含有許多有毒、劇毒或致癌物質(zhì)，且廢水的有機(jī)物濃度高，一旦排進(jìn)水體，會(huì)在水中氧化分解，消耗大量溶解氧，嚴(yán)重的會(huì)造成水生生物死亡。此外，化工行業(yè)用水量非常巨大，排放的污水量也非常大，水質(zhì)、水量波動(dòng)性大，難以治理，對生態(tài)安全和人體健康造成嚴(yán)重的威脅。

如何處理排放量巨大的化工有機(jī)廢水是目前面臨的一個(gè)嚴(yán)峻課題。對于有機(jī)化工廢水的處理技術(shù)也有較多研究〔2-3〕，主要包括破壞法（生化法、氧化法和焚燒法等）和回收法（膜分離法、萃取法和吸附法等）。其中生化法具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到關(guān)注，而生化法的核心是菌種，因此，菌種的篩選和工藝及相關(guān)條件的優(yōu)化是最關(guān)鍵的因素。筆者用有機(jī)化工廢水培養(yǎng)基從高海拔鹽湖樣品中分離篩選COD降解菌，以期獲得對化工有機(jī)廢水COD降解率高的菌株及混合菌群，并將其用于生物曝氣試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)廢水及水質(zhì)

試驗(yàn)廢水采自湖北省某化工廠，為強(qiáng)酸性高濃度廢水，pH為1，鹽度4%，廢水中含有機(jī)溶劑甲醇、甲苯及正丁醇等，COD為16160mg/L，TP為3.2mg/L，NH3-N未檢出。

1.2菌株來源、馴化與分離純化

菌株分離樣品采自新疆高海拔鹽湖，其中阿牙克庫木湖鹽度4.25%，鯨魚湖鹽度2.1%，阿其克庫勒湖鹽度7.18%，阿其克庫勒湖7.82%，艾比湖鹽度3.5%，伊吾湖鹽度6.94%。

培養(yǎng)基：將試驗(yàn)廢水pH調(diào)節(jié)至7.0左右，向其添加1 g/L酵母粉、1 g/L蛋白胨，121℃滅菌20 min。若為固體培養(yǎng)基，則向其添加2%的瓊脂粉。

將各鹽湖的樣品按等比例混合，以10%的接種量接種于無菌廢水培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d，取10%培養(yǎng)物重新接種于無菌廢水培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，如此重復(fù)3次獲得馴化菌群。菌株分離采用梯度稀釋涂布法，將馴化后的菌液進(jìn)行 0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋，分別取200 μL各梯度稀釋后的菌液涂布于固體平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出明顯菌落。用接種環(huán)挑取形態(tài)不同的單菌落，對其進(jìn)行劃線純化至新鮮固體平板中，重復(fù)純化1次，至獲得純的單菌落。

1.3分離菌株對試驗(yàn)廢水的處理

由于廢水pH低，故先向廢水中加入5 g/L CaCO3（方解石，0.044 mm，325目）反應(yīng)3 h，將廢水pH調(diào)至7.0左右，CaCO3處理結(jié)束后過濾除去沉淀，加入0.5 g/L尿素調(diào)節(jié)廢水的碳氮比約為200∶5，得到處理后的廢水。分別將分離的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至菌濃度OD600為 0.5左右，與處理后的試驗(yàn)廢水按體積比1∶2混合，置于250 mL錐形瓶中在28℃、120 r/min搖床處理，分別取0、24、48 h的樣品測定其COD。通過比較COD去除率，獲得COD高效降解菌（48 h COD去除率＞60%）的純菌株。將獲得的COD高效降解菌進(jìn)行等比例混合，用廢水對其馴化1周。取馴化后的混合菌群對試驗(yàn)廢水進(jìn)行處理，分別測定0、24、48 h后的COD。

同時(shí)進(jìn)行普通活性污泥的廢水COD降解試驗(yàn)，作為比較。其中普通活性污泥取自杭州市余杭鎮(zhèn)污水處理廠好氧段的活性污泥，前期利用試驗(yàn)廢水對該污泥進(jìn)行馴化至穩(wěn)定狀態(tài)。

1.4高COD去除率菌株的初步鑒定

選取48 h COD去除率＞60%的菌株，利用酚/氯仿/異戊醇法提取各菌株DNA，利用引物27F和1492R對各DNA進(jìn)行16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增〔4〕，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將有條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送往測序公司（杭州鉑尚生物測序有限公司）測序，測序結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站的blast在線比對軟件（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列比對，對各菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.5混合菌群的生物曝氣池工藝應(yīng)用試驗(yàn)

采用圖1所示簡易裝置模擬生物曝氣池工藝，應(yīng)用上述COD降解混合菌進(jìn)行污水處理模擬試驗(yàn)。廢水已調(diào)節(jié)pH至7.0左右，接菌量20%，容器有效容積2 L。啟動(dòng)曝氣，體系連續(xù)出水，控制水力停留時(shí)間為48 h。

圖1　生物曝氣池模擬試驗(yàn)

1.6考察氮源對試驗(yàn)廢水COD降解情況的影響

由于該試驗(yàn)廢水的氮含量特別低，故添加不同量的尿素和金槍魚蛋白胨（自制），研究適合COD降解試驗(yàn)的最優(yōu)條件。

（1）添加尿素作氮源。尿素添加量分別為0、0.25、0.5、0.75、1 g/L，處理48 h后取樣測定COD，觀察尿素最適添加量。

（2）添加金槍魚蛋白胨作氮源。金槍魚蛋白胨的添加量分別為0、0.25、0.5、0.75、1 g/L，處理48 h后取樣測定COD，觀察金槍魚蛋白胨最適添加量。

試驗(yàn)中COD的檢測采用重鉻酸鉀法〔5〕。混合菌群處理試驗(yàn)廢水時(shí)，其COD為3次平行試驗(yàn)的測定平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株分離結(jié)果及其對試驗(yàn)廢水COD的去除效果

試驗(yàn)共挑取18個(gè)單菌落，分別命名為PAS1～PAS18，分別進(jìn)行純化，獲得純培養(yǎng)物。試驗(yàn)廢水的初始COD為16 160 mg/L，加入CaCO3處理3 h后COD為11 350 mg/L。取各菌株分別處理試驗(yàn)廢水，48hCOD去除率＞60%的菌株有8株，分別為PAS1、PAS5、PAS6、PAS8、PAS11、PAS12、PAS15、PAS17，其具體COD去除率見表1。

表1　各菌株48 h對試驗(yàn)廢水COD的去除率

將這8株菌株混合后對試驗(yàn)廢水進(jìn)行降解，COD由11 350 mg/L降為1 550 mg/L，其COD去除率比各單菌株的去除效果都好（COD去除率高達(dá)86.3%，見圖2）。與普通活性污泥相比，混合菌群的48hCOD去除率明顯高于普通污泥（62.3%），見圖3。

圖2　混合菌群對試驗(yàn)廢水的COD降解效果

圖3　混合菌群與普通活性污泥對COD的降解能力比較

2.2菌種鑒定結(jié)果

對試驗(yàn)廢水COD去除效果較好的8株菌進(jìn)行16S rDNA初步鑒定，這8株菌分別為Bacillus sp. PAS11、Flavobacterium sp.PAS5、Hyphomicrobium sp. PAS12、Ochrobactrumsp.PAS8、Pseudomonassp.PAS1、Sphingobacterium sp.PAS17、Staphylococcus sp.PAS6 和Stappia sp.PAS15。它們分別屬于擬桿菌門Bacteroidetes（Flavobacterium sp.PAS5和Sphingobacterium sp.PAS17）、厚壁菌門Firmicutes（Bacillus sp.PAS11 和Staphylococcussp.PAS6）和變形菌門Proteobacteria （Hyphomicrobium sp.PAS12、Ochrobactrum sp.PAS8、Pseudomonas sp.PAS1和Stappia sp.PAS5）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔6-9〕，對處理廢水的活性污泥進(jìn)行可培和非培的研究，表明多數(shù)細(xì)菌屬于擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

2.3混合菌群生物曝氣池工藝應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果及氮源試驗(yàn)結(jié)果

混合菌群對廢水的生物曝氣池工藝應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明，48 h COD去除率較低（67.0%），這是由于廢水含氮量低，而試驗(yàn)中未額外添加氮源。故需進(jìn)一步研究氮源對COD降解率的影響。此外試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)該混合菌群的沉降性不佳，難以形成菌膠團(tuán)。

氮源對COD降解率的影響如圖4所示。

圖4　氮源對COD降解率的影響

從圖4可以看出，未添加氮源的空白對照組其48 h COD去除率為67.0%，添加尿素可以促進(jìn)混合菌株降解COD，最適尿素添加量為0.75 g/L，其48 h COD降解率可達(dá)到82.5%。添加金槍魚蛋白胨的效果更加明顯，最適金槍魚蛋白胨添加量為0.5 g/L，其48 h COD降解率可達(dá)到92.2%。

3　結(jié)論

（1）試驗(yàn)廢水為有機(jī)化工廢水，pH為1左右，加入NaOH調(diào)節(jié)pH后廢水中會(huì)出現(xiàn)絮狀物，改加CaCO3不但成本降低，其處理效果也較好，同時(shí)對COD也有一定的去除效果。（2）向有機(jī)化工廢水中加入適量蛋白胨和酵母粉作為培養(yǎng)基，從鹽湖樣品中馴化、分離篩選出18株對該廢水COD有降解能力的菌株，其中有8株菌對廢水COD 48 h去除率＞60%，效果最好的菌株為 PAS6，其去除率高達(dá)81.6%。經(jīng)16S rRNA初步鑒定，這8株菌分別屬于擬桿菌門Bacteroidetes（Flavobacterium sp.PAS5和Sphingobacterium sp.PAS17）、厚壁菌門Firmicutes （Bacillus sp.PAS11和Staphylococcus sp.PAS6）和變形菌門 Proteobacteria（Hyphomicrobium sp.PAS12、Ochrobactrum sp.PAS8、Pseudomonas sp.PAS1和St-appia sp.PAS5）。將此8株菌混合后對試驗(yàn)廢水進(jìn)行處理，其48 h COD的去除率達(dá)到86.3%。（3）由于試驗(yàn)廢水氮含量特別低，故需向其補(bǔ)充氮源，研究了尿素和金槍魚蛋白胨對廢水處理效果的影響，結(jié)果表明，在未添加氮源的條件下，48 h COD去除率為67.0%；添加0.75 g/L尿素可使48 h COD降解率達(dá)到82.5%；添加0.5 g/L金槍魚蛋白胨后廢水48 h COD去除率可達(dá)92.2%，表明金槍魚蛋白胨為最適氮源。（4）生物曝氣池工藝試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合菌群的沉降性不佳，難以形成菌膠團(tuán)。工程應(yīng)用中可以考慮結(jié)合MBR工藝來增加曝氣池中菌體的濃度。

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Separation，screening and application of efficient degradation microorganisms for improving COD removing rates from organic chemical wastewater

Zhang Weiyan1，2，Liu Pengcheng1，Zheng Fengjuan1，Wu Min2，Zhang Wenwu1，2
（1.Hangzhou Trend Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 311121，China；2.College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

18 strains of COD degrading bacteria have been separated and screened from high altitude salt lake samples in Xinjiang Province by using organic chemical wastewater medium for treating wastewater，after mixed with 8 strains of bacteria which have high COD degrading rates.Compared to other ordinary activated sludge，the mixed strains show higher COD removing rate（86.3%）.Being identified preliminarily by 16S rDNA analysis，it shows that these 8 strains of bacteria belong to the varieties，including Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes and Proteobacteria.The mixed bacterial floras are used in bio-aeration pool tests.The COD removing rate could reach 82.5%，by adding 0.75 g/L of urea as nitrogen sources.The COD degrading rate could be improved to 92.2%，by adding 0.5 g/L of tuna peptone.

organic chemical wastewater；strain screening；COD degradation

X703

A

1005-829X（2016）08-0052-03

杭州市社會(huì)發(fā)展科研專項(xiàng)（20150533B68）

張為艷（1987—），博士。電話：0571-88579916，E-mail：zhangweiyan13@126.com。通訊作者：張文武，博士，電話：0571-88579916，E-mail：wenwu.zhang@trendbiotech.com。

2016-06-21（修改稿）