過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白的Dl對成熟表皮細(xì)胞去分化為表皮干細(xì)胞的作用*

趙阿龍，葉 明，張翠萍，馬 奎，周云超，譚志軍，付小兵

過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白的Dl對成熟表皮細(xì)胞去分化為表皮干細(xì)胞的作用*

趙阿龍1，2，葉 明3△，張翠萍2△，馬 奎2，周云超2，譚志軍1，2，付小兵2

（1.天津醫(yī)科大學(xué) ，天津300070；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點實驗室 ，3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤一科 ，北京100048）

目的 :觀察過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）對成熟表皮細(xì)胞去分化為表皮干細(xì)胞的調(diào)控作用。方法 :構(gòu)建攜帶CCND1基因的真核表達(dá)載體PEGFP-N1-CCND1，將PEGFP-N1-CCND1轉(zhuǎn)染人成熟表皮細(xì)胞，5 d后 ，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞計數(shù)法觀察細(xì)胞的增殖情況；免疫熒光法檢測表皮干細(xì)胞標(biāo)志抗原β1整合素和成熟表皮細(xì)胞標(biāo)志抗原CK10的表達(dá)變化。結(jié)果 :轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-CCND1后 ，細(xì)胞體積變小，核漿比例增大 ；細(xì)胞增殖較快 ，細(xì)胞數(shù)量比對照組增加了4倍（P＜0.01）；表型檢測結(jié)果顯示 ，轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-CCND1組，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白β1整合素表達(dá)陽性 ，成熟表皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CK10表達(dá)陰性 ，而轉(zhuǎn)染空載體組則相反。結(jié)論 :CCND1過表達(dá)能夠誘導(dǎo)成熟表皮細(xì)胞去分化為表皮干細(xì)胞。

CCND1；去分化 ；表皮干細(xì)胞 ；成熟表皮細(xì)胞

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.019

表皮干細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面修復(fù)和組織工程領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞。但這些干細(xì)胞在皮膚組織中含量很少，尤其大面積皮膚缺損的病人，表皮干細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，這大大限制了它的臨床應(yīng)用。成熟表皮細(xì)胞去分化可以提供大量的表皮干細(xì)胞，據(jù)報道，Wnt/β-catenin通路在成熟表皮細(xì)胞去分化過程中起著重要的調(diào)控作用，細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）是β-catenin的下游靶基因［1］，而CCND1是否參與表皮細(xì)胞的去分化目前還不清楚。本研究構(gòu)建了攜帶CCND1基因的真核表達(dá)載體PEGFP-N1-CCND1，并將PEGFP-N1-CCND1轉(zhuǎn)染人成熟表皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)、表型和增殖功能。

1 材料和方法

1.1 材料

Epilife培養(yǎng)基、0.025%胰蛋白酶和胰蛋白酶終止劑（美國Gibco公司），兔抗人整合素β1抗體和兔抗人角蛋白ck10，Lipofectamine（美國Invitrogen公司），取自包皮過長病人術(shù)后的正常成人包皮，并征得當(dāng)事人同意，簽署知情同意書。

1.2 PEGFP-N1-CCND1載體的構(gòu)建鑒定

由上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司完成。提取人腦組織mRNA，逆轉(zhuǎn)錄制備 cDNA。根據(jù) CCND1（基因號: BC014078）的序列，應(yīng)用primer 5設(shè)計引物CCND1-F（Bgl2）: GAAGATCTATGGAACACCAGCTCCTGTG；CCND1-R（Kpn1）: GGGGTACCGTGATGTCCACGTCCCGCAC然后PCR擴(kuò)增CCND1目的序列，產(chǎn)物用Bgl2和Kpn1核酸內(nèi)切酶雙酶切后純化處理，連接入同樣雙酶切處理并去磷酸化PEGFP-N1載體中，構(gòu)建過表達(dá)穿梭質(zhì)粒PEGFP-N1-CCND1。隨后轉(zhuǎn)入至感受態(tài)細(xì)菌DH5a，涂布含Amp的LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。選取平板上1-9號菌落進(jìn)行PCR（引物:CCND1-F/CCND1-R）。挑出陽性基因純化回收，并取出3μl用Bgl2/Kpn1雙切后與3μl PEGFP-N1一起跑膠，并對酶切鑒定正確的克隆送公司做測序［2］。

1.3 人表皮細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

按文獻(xiàn)所述的方法［3，4］獲取成熟表皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞。按LipofectamineTM 2000試劑說明，將4μg的PEGFP-N1加至250μl的OPTI-MEM培基中，混勻。將10μl的LipofectamineTM 2000加至另外250μl的OPTI-MEM中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將PEGFP-N1-CCND1懸液和LipofectamineTM 2000懸液混合，總體積500μl，輕輕混勻，室溫靜置20 min。將PEGFP-N1-CCND1和LipofectamineTM 2000混合液加至6孔板的孔內(nèi)，前后左右晃動孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，吸去轉(zhuǎn)染液，每孔中加入3 ml Epilife培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。待細(xì)胞生長狀態(tài)好轉(zhuǎn)，加入含有濃度為200mg/ml G418 的Epilife培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 d。期間2 d換一次含有G418的培養(yǎng)基，鏡下觀察待有細(xì)胞團(tuán)塊狀生長，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞 ，隨機(jī)倒掉培養(yǎng)基，加入4 ml Epilife完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d。隨后用0.025%胰蛋白酶將團(tuán)塊狀生長細(xì)胞定點消化下來，傳代培養(yǎng)，并把此組設(shè)為對照組。同時把空載體也按上述步驟轉(zhuǎn)染成熟表皮細(xì)胞，設(shè)為空載體組。把表皮干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，設(shè)為表皮干細(xì)胞組。將各組細(xì)胞用0.025%的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液 ，胰蛋白酶終止液終止消化并離心，Epilife培養(yǎng)基重懸，以5×105cells/well密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d取出細(xì)胞 ，消化成單細(xì)胞懸液計數(shù)。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟表皮細(xì)胞效率的測定

熒光顯微鏡下分辨率調(diào)到400倍，隨機(jī)選擇10個視野，觀察每個視野細(xì)胞總數(shù)和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)，以百分率表示每個視野成熟表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.5 免疫細(xì)胞熒光檢測

分別將PEGFP-N1-CCND1轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞，空載體轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞分別接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h。吸走培養(yǎng)液，多聚甲醛固定15min。羊抗血清封閉1 h，分別加入羊抗人整合素β1抗體和角蛋白CK10抗體，冰箱4℃孵育過夜［5］。第2天從冰箱中取出 ，加入二抗PE孵育2 h，用Dapi染核［6］。隨后把各組細(xì)胞拿到共聚焦顯微鏡下觀看發(fā)光情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析及 q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 平板挑菌與酶切鑒定

選取的1-9號菌落進(jìn)行PCR，結(jié)果1，2，3，7，8號為陽性（圖1A）。通過CCND1（基因號BC014078）的序列查出CCDN1序列為888 bp，根據(jù)PEGFP-N1-CCND1用雙切酶Bgl2/Kpn1雙切后和PEGFP-N1（圖1C）的結(jié)果顯示:PEGFP-N1-CCND1雙切后產(chǎn)生約900 bp的CCND1片段和較大的PEGFP-N1片段（圖1B），同時測序鑒定結(jié)果也顯示序列為888 bp，與CCND1（基因號BC014078）的序列一致。

Fig.1 Vector synthesis and IdentificationA:For the purpose gene by bacteria breeding；B:Enzyme digestion analysisof PEGFP-N1-CCND1；C:Plasmid structure for vector construction

2.2 細(xì)胞增殖情況

將培養(yǎng)5 d后的實驗組，空載體組和表皮干細(xì)胞組細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，消化成單細(xì)胞懸液計數(shù)?？梢钥闯鯬EGFPN1-CCND1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量是空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的4倍，但與表皮干細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Number of the cells 5 days later（±s）

Tab.1 Number of the cells 5 days later（±s）

**P＜0.01 vs control group

Group　Cells（×105）Control　6±1 Experimental　24±2**Epidermal stem cells　25±2**

2.3 CCND1對成熟表皮細(xì)胞形態(tài)的影響

表皮干細(xì)胞培養(yǎng)6代后細(xì)胞開始出現(xiàn)老化跡象，胞體變寬大扁平、胞核變小、核漿比例減小、代謝緩慢且生長停滯；而PEGFP-N1-CCND1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞核變大，胞體形態(tài)縮小，核漿比例增大，趨近于表皮干細(xì)胞的形態(tài)；空載體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞則沒有明顯變化。說明成熟表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-CCND1后，形態(tài)類似于表皮干細(xì)胞（圖2）。

Fig.2 Morphological characteristics of epidermal cells in the four groups（×200）A:Non transfection group；B:Empty vector transfection group；C:CCND1 transfection group；D:Positive control group；CCND1:Cyclin D1

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟表皮細(xì)胞的效率

通過倒置相差熒光顯微鏡計數(shù)表明，PEGFP-N1-CCND1 和PEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟表皮細(xì)胞后 ，其轉(zhuǎn)染效率為30.23%±4.11%和30.15%±4.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。

2.4 細(xì)胞標(biāo)志蛋白β1和CK10的表達(dá)情況

激光共聚焦顯微鏡下，PEGFP-N1-CCND1轉(zhuǎn)染細(xì)胞表皮干細(xì)胞標(biāo)志蛋白β1整合素表達(dá)陽性，而作為成熟表皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CK10表達(dá)陰性，這與表皮干細(xì)胞的表型類似。空載體轉(zhuǎn)染組卻與上兩組相反，β1的表達(dá)陰性，CK10表達(dá)陽性。說明成熟表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-CCND后，具有了表皮干細(xì)胞的表型特征（圖3，見彩圖頁Ⅴ）。

3 討論

長期以來，人們一直認(rèn)為人和哺乳動物細(xì)胞在發(fā)生終末分化后便不可逆轉(zhuǎn)，新近的研究顯示終末分化的細(xì)胞也存在去分化的潛能。研究表明，Oct4、Sox2、KLf4、Myc等幾個因子可以重新把體細(xì)胞編程為iPSCs細(xì)胞［7］。Edel報道了CCND1的高表達(dá)也可以提高iPSCs的重編程的效率［8］。報道指出抑制CCND1的表達(dá)是細(xì)胞分化的標(biāo)志［9］。本實驗嘗試通過調(diào)高CCDN1的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的去分化以探討其可行性。

前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟表皮細(xì)胞發(fā)生去分化過程中CCND1的表達(dá)顯著增高，據(jù)此推測基因CCND1與表皮細(xì)胞的去分化有關(guān)聯(lián)。因此，本研究中調(diào)高了成熟表皮細(xì)胞中的CCND1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEGFP-N1-CCND1誘導(dǎo)后的成熟表皮細(xì)胞形態(tài)和增殖速度都發(fā)生類似于表皮干細(xì)胞的變化，并且具有了表皮干細(xì)胞的表型特征。這些結(jié)果表明，CCND1可以誘導(dǎo)成熟表皮細(xì)胞去分化為表皮干細(xì)胞。這提供了一個獲取大量表皮干細(xì)胞有效的方法，從而更好的開展創(chuàng)面修復(fù)和皮膚的組織工程。但是，本研究還將更深入探索CCND1誘導(dǎo)后的表皮細(xì)胞在動物體內(nèi)是否也具有類似表皮干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

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cyclin D1；dedifferentiation；epidermal stem cells；mature skin cells

R34

A

1000-6834（2016）03-263-03

國家973計劃資助項目（2012CB518105）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81571905，81121004，81230041，81171798）

2015-11-11

2016-02-23

Tel:010-66867391，010-66848690；E-mail:yeming304 @163.com），zcp666666@sohu.com