激活SUR2B/Kir6.1通道擴(kuò)張肺微動脈的分子機(jī)制*

陳 筠，王 尚，崔文玉，龍超良，張雁芳，張 浩，汪 海，△

激活SUR2B/Kir6.1通道擴(kuò)張肺微動脈的分子機(jī)制*

陳 筠1，王 尚1，崔文玉2，龍超良1，張雁芳1，張 浩1，汪 海1，2△

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 心血管藥物研究中心，北京100850；2.北京賽德維康醫(yī)藥研究院心血管藥物研究中心 ，北京100039）

目的:以ATP敏感性鉀通道（KATP）SUR2B/Kir6.1亞型開放劑埃他卡林（Ipt）為工具藥，研究激活SUR2B/ Kir6.1通道擴(kuò)張肺微動脈作用特征，并探討其可能的分子機(jī)制。方法:利用離體微血管壓力-直徑監(jiān)測灌流技術(shù)，檢測Ipt對大鼠四級肺微動脈的舒張效應(yīng)（n=6～8），觀察內(nèi)皮損傷后或用KATP通道拮抗劑格列苯脲（Gli）、環(huán)氧合酶（COX）抑制劑吲哚美辛（Indo）、一氧化氮合酶（NOS）抑制劑L-Nω-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）預(yù)孵后肺微動脈舒張率的變化。結(jié)果:Ipt能夠擴(kuò)張肺微動脈，最大舒張率為（60.53±2.08）%。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用明顯減弱，最大舒張率為（9.47±1.56）%，與對照組相比存在顯著性差異（P＜0.01）。預(yù)孵Gli、Indo、L-NAME后，最大舒張率分別下降為（17.49±1.47）%、（37.00±3.88）%、（24.91±2.30）%，與對照組相比均存在顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論:其選擇性開放KATP通道SUR2B/Kir6.1擴(kuò)張肺微動脈作用具有內(nèi)皮細(xì)胞依賴性，與其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）和前列環(huán)素（PGI2）相關(guān)。

肺微動脈；埃他卡林；內(nèi)皮細(xì)胞；ATP敏感性鉀通道；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.013

肺動脈高壓是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的慢性疾病，其中位生存時間僅為2.8年，因此尋找有效的針對新靶點(diǎn)治療肺動脈高壓的藥物至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，KATP通道是調(diào)節(jié)阻力血管舒縮功能的重要靶標(biāo)之一，肺動脈高壓的形成與KATP通道功能的下降有關(guān)；本室自行設(shè)計(jì)合成的新型KATP通道SUR2B/Kir6.1亞型開放劑埃他卡林（Iptakalim，Ipt）能夠在不影響體循環(huán)的情況下，選擇性降低肺動脈高壓。Ipt可顯著抑制長期低氧所致的肺動脈高壓，可防治野百合堿誘發(fā)的大鼠肺動脈高壓及右心衰竭，也可顯著拮抗和逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮素1（endothelial-1，ET-1）誘導(dǎo)的肺動脈高壓和離體大鼠肺動脈環(huán)的收縮反應(yīng)。但其擴(kuò)張肺微動脈作用的分子機(jī)制尚不十分清楚。本文利用DMT120CP微血管壓力-直徑灌流監(jiān)測系統(tǒng)平臺研究Ipt擴(kuò)張肺微動脈的作用特征及其分子機(jī)制，為Ipt作為新型藥物治療肺動脈高壓臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、內(nèi)皮素1（endothelial-1，ET-1）、格列苯脲（glibenclamide，Gli）、LNω-硝基精氨酸甲酯（L-Nω-Nitro-argininemethyl ester，L-NAME）、吲哚美辛（indomethacin，Indo）、Triton-X均購自美國Sigma公司。埃他卡林（Iptakalim，Ipt）由北京賽德維康醫(yī)藥研究院提供，純度＞99.5%。營養(yǎng)緩沖液（PSS），成分（mmol/L）:NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2 PO41.2，NaHCO311.0，MgSO4 1.2，Glucose 11.1，pH 7.4。采用丹麥DMT公司生產(chǎn)的DMT120CP微血管壓力-直徑灌流監(jiān)測系統(tǒng)記錄血管管徑變化。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠，體重（180～200）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SCXK-（軍）2014-004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（18～25）℃，日光燈照明，每12 h黑暗交替。自由攝食、飲水。

1.3 離體肺動脈環(huán)的制備

大鼠斷頸處死后，打開胸腔，迅速取出肺組織置于4℃通以95%O2和5%CO2的PSS液中。在體視顯微鏡下，選取4～5級肺微動脈（管徑約180～220 μm），用維納斯剪小心剝離干凈血管周圍粘連組織，剪取約2mm的血管環(huán)固定在DMT120CP微血管壓力-直徑灌流監(jiān)測系統(tǒng)浴槽內(nèi)的玻璃電極上，兩端分別用尼龍繩結(jié)系緊。兩端的中空玻璃電極同時加壓灌流，模擬血管生理狀態(tài)。給予血管一定的預(yù)灌注壓（10mmHg），以每5分鐘升高10mmHg的速度，將灌注壓升至40mmHg，恒溫37℃，每20分鐘換一次液，平衡1 h左右。采用1 nmol/L ET-1預(yù)收縮，收縮后血管給予ACh（10-5mol/L）檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性。從中選取ET-1收縮幅度達(dá)到60%以上，ACh舒張幅度達(dá)到80%以上的內(nèi)皮完整、活性良好的血管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（n=6～8）。

1.4 Ipt內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張肺微動脈作用特征的觀察

用0.1%Triton X-100灌流肺微動脈5S以去除內(nèi)皮（n=8），給予肺微動脈40 mmHg灌注壓，ACh （10-5mol/L）不再引起血管舒張反應(yīng)表示內(nèi)皮去除成功，采用1 nmol/L ET-1預(yù)收縮造成血管收縮模型，模型穩(wěn)定后，累積性加入不同濃度的Ipt（10-11～ 10-4mol/L），記錄不同濃度藥物對血管管徑變化的影響。

1.5 Gli、L-NAME、Indo對Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用的影響的測定

給予肺微動脈40 mmHg灌注壓，血管平衡后，分別加入10-5mol/L的Gli（n=7）、10-4mol/L的indo （n=8）、10-4mol/L的L-NAME（n=6）預(yù)孵育30min，采用1 nmol/L ET-1預(yù)收縮造成血管收縮模型，模型穩(wěn)定后，再累積性加入不同濃度的Ipt（10-11～10-4mol/L），記錄不同濃度藥物對血管管徑變化的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 Ipt內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張肺微動脈作用

在10-11～10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，Ipt對1 nmol/L ET-1預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的肺微動脈具有一定的擴(kuò)張作用（圖1A），其最大舒張率為（60.53±2.08）%；內(nèi)皮損傷后的肺微動脈，Ipt的舒張作用明顯減弱，最大舒張率僅為（9.47±1.56）%。與內(nèi)皮完整組相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 Gli對Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用的影響

KATP通道拮抗劑Gli（10-5mol/L）能顯著抑制Ipt （10-11～10-4mol/L）擴(kuò)張肺微動脈的作用，最大舒張率僅為（17.49±1.47）%，與對照組（60.53±2.08）%相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，圖1B）。

2.3 Indo對Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用的影響

在10-11～10-4mol/L范圍內(nèi)，預(yù)孵COX阻斷劑Indo（10-4mol/L）后，Ipt的擴(kuò)血管作用減弱，但仍保留一定的舒張作用，最大舒張率為（37.00±3. 88）%，與對照組（60.53±2.08）%相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，圖1C）。

2.4 L-NAME對Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用的影響

在10-11～10-4mol/L范圍內(nèi)，預(yù)孵NOS抑制劑L-NAME（10-4mol/L）后，Ipt的擴(kuò)血管作用減弱，但仍保留一定的舒張作用，最大舒張率為（24.91±2. 30）%，與對照組（60.53±2.08）%相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，圖1D）。

Fig.1 Effects of pulmonary arterial rings responses to iptakalim （±s，n=8）A:Endothelium denuded；B:Pretreatment with Gli（10-5mol/L）；C:Pretreatmentwith Indo（10-4mol/L）；D:Pretreatmentwith L-NAME（10-4mol/L）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，Ipt能夠在不影響體循環(huán)的情況下選擇性降低肺動脈高壓。本研究對Ipt擴(kuò)張肺微動脈的分子途徑進(jìn)行了初步探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Ipt能夠擴(kuò)張ET-1預(yù)收縮的肺微動脈，該作用能被特異性KATP通道拮抗劑Gli拮抗。Ipt擴(kuò)張肺微動脈作用具有內(nèi)皮依賴性，NOS抑制劑L-NAME、COX抑制劑Indo均能抑制Ipt的擴(kuò)血管作用。

KATP是由內(nèi)向整流型亞單位kir6.x與磺酰脲受體SUR組成的八聚體復(fù)合物［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鉀離子通道的活性降低在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用［2］。肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中，K+通道功能下降，K+通道關(guān)閉，胞內(nèi)K+外流減少，引起細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性Ca2+通道開放，胞內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致肺血管平滑肌收縮，增殖、肺血管重構(gòu)［3］。所以，人們認(rèn)為KATP通道是治療肺動脈高壓藥物的一類重要分子靶標(biāo)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)Ipt的擴(kuò)血管作用能被特異性KATP通道拮抗劑Gli拮抗，提示Ipt擴(kuò)血管作用的分子靶標(biāo)是KATP。其機(jī)制可能是Ipt選擇性作用于Kir6.1/SUR2B［5］，開放細(xì)胞KATP通道，引起胞內(nèi)K+外流，血管平滑肌細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣離子通道關(guān)閉，胞內(nèi)Ca2+濃度下降，血管平滑肌松弛，血管舒張、血壓下降［6］。

肺血管內(nèi)皮是多種血管活性物質(zhì)合成和代謝的主要場所。內(nèi)皮細(xì)胞能合成和釋放如TXA2、ET等縮血管物質(zhì)，也能合成和釋放NO、PGI2、EDHF等舒血管物質(zhì)。許多血管活性物質(zhì)和藥物在調(diào)節(jié)血管張力中的作用具有內(nèi)皮依賴性［7，8］。本文研究新型抗肺動脈高壓藥物Ipt發(fā)現(xiàn)，其擴(kuò)張肺微動脈作用與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)，內(nèi)皮損傷后，Ipt擴(kuò)血管作用顯著降低，提示Ipt主要依賴功能完整的內(nèi)皮發(fā)揮其舒血管效應(yīng)。NO是目前報(bào)道的一類重要的內(nèi)皮依賴性血管舒張因子。內(nèi)皮細(xì)胞激活NOS，將底物L(fēng)-精氨酸（L-arginine，L-Arg）轉(zhuǎn)化生成NO，通過NO-sGC-cGMP通路減少胞內(nèi)鈣離子濃度，引起血管平滑肌舒張［9］。Ipt的內(nèi)皮依賴性擴(kuò)張肺微動脈作用可能與NO有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該分子途徑，本研究用NOS抑制劑L-NAME（10-4mol/L）預(yù)處理后觀察Ipt的擴(kuò)張肺微動脈作用，發(fā)現(xiàn)Ipt擴(kuò)血管作用被L-NAME部分阻斷。提示Ipt可能激活NO途徑引發(fā)血管舒張效應(yīng)。結(jié)合前期研究，Ipt可能作用于內(nèi)皮細(xì)胞KATP通道，引起細(xì)胞膜超極化［10］，激活TRPV1通道開放，Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，通過鈣離子-鈣調(diào)素增強(qiáng)NOS活性，釋放NO增加，引起血管舒張。

PGI2是另一類重要的內(nèi)皮依賴性血管舒張因子，花生四烯酸在COX的作用下生成環(huán)內(nèi)過氧化物，在前列環(huán)素酶的催化下進(jìn)一步生成PGI2。PGI2與膜受體結(jié)合，激活GC，cAMP升高，引起胞內(nèi)鈣離子濃度下降 ，血管平滑肌松弛，血管舒張［11］。本研究用COX抑制劑Indo（10-4mol/L）預(yù)處理后觀察Ipt的擴(kuò)張肺微動脈作用，發(fā)現(xiàn)Ipt的擴(kuò)血管作用被Indo部分阻斷，提示Ipt可能激活環(huán)氧合酶途徑引發(fā)血管舒張效應(yīng)。前期Ipt在大鼠腸系膜微動脈上的研究表明，Ipt的舒血管作用與環(huán)氧合酶途徑無關(guān)，肺微動脈與腸系膜動脈研究結(jié)果存在差異，其原因可能與不同組織的信號通路途徑不同有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Ipt是極具前景的肺動脈高壓新治療藥物。它能夠舒張ET-1預(yù)收縮的肺微動脈，其機(jī)制是激活KATP通道SUR2B/Kir6.1亞型開放，引起胞內(nèi)K+外流，Ca2+濃度下降，血管平滑肌松弛達(dá)到降低肺動脈壓的作用；Ipt的內(nèi)皮依賴性舒張肺微動脈作用與內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO和PGI2有關(guān)。

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Molecular mechanism of pulmonary arterioles relaxation through SUR2B/Kir6.1 channel opening

CHEN Jun1，WANG Shang1，CUIWen-yu2，LONG Chao-liang1，ZHANG Yan-fang1，ZHANG Hao1，WANG Hai1，2△
（1.Cardiovascular Drug Research Center，Institute of Health and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850；2.Cardivascular Drug Research Center，Thadweik Academy of Medicine，Beijing 100039，China）

【ABSTRACT】Objective:To study the dilatation characteristicsof ATP-sensitive potassium channel（KATP）SUR2B/Kir6.1 subtype opener iptakalim（Ipt）in pulmonary arterioles，and to explore its possiblemechanism.Methods:Vessels pressure-diametermonitoring perfusion techniquewas used to observe the dilatation effects of Ipt in rats fourth pulmonary arterioles（n=6～8）.After the pulmonary arterioleswere pre-treated with removing endothelium or pre-incubated with KATPchannel blocker glibenclamide（Gli），cyclo-oxygenase（COX）inhibitor indomethacin（Indo）and nitric oxide synthase（NOS）inhibitor L-Nω-Nitro-argininemethyl ester（L-NAME），the dilatation effects of Iptwere observed.Results:Pulmonary arterioles could be relaxed by Ipt，themaximal relaxation ratewas（60.53±2.08）%.Compairedwith control group，the effects of Ipt in endothelium denuded arterioleswere significantly decreased，themaximal relaxation ratewas（9.47±1.56）%（P ＜0.01）.Themaximal relaxation ratewere decreased to（17.49±1.47）%，（37.00±3.88）%and（24.91±2.30）%respectively afterGli，Indo，L-NAMEwere pre-incubated（P＜0.01）.Conclusion:Pulmonary arterioles can be relaxed by Ipt.The selective activation of KATPSUR2B/Kir6.1 subtype by Iptwas involved in itsmechanisms.The endothelium-dependently dilatation of Iptwas related to nitric oxide（NO）and prostacyclin（PGI2）released by endothelial cells.

pulmonary arterioles； Iptakalim； endothelial cells； ATP-sensitive potassium channel； rats

R331；R972.4

A

1000-6834（2016）03-238-04

軍隊(duì)醫(yī)藥衛(wèi)生 “十二五”重大專項(xiàng)（AWS11J003）；國家973項(xiàng)目（2012CB518200）

2015-10-28

2016-01-18

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