急性冷暴露對大鼠肺組織中水通道蛋白AQP-1和AQP-5表達(dá)的影響*

林陽生，張 莉+，楊 華，張 瑩，李 曦，張永強(qiáng)，楊丹鳳△

急性冷暴露對大鼠肺組織中水通道蛋白AQP-1和AQP-5表達(dá)的影響*

林陽生1，張 莉1+，楊 華2，張 瑩1，李 曦1，張永強(qiáng)1，楊丹鳳1△

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 ，天津30050；2.解放軍第222醫(yī)院 ，吉林132000）

目的:探討急性冷暴露后肺組織超微結(jié)構(gòu)變化以及對水通道蛋白-1（AQP-1）和AQP-5表達(dá)的影響。方法:12只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為室溫（23℃±2℃）對照組和-25℃2 h冷暴露組（n=6）；記錄冷暴露后大鼠直腸溫度；透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)改變；RT-PCR法和Western blot法測定大鼠肺組織AQP-1和AQP-5基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:急性冷暴露后大鼠的體心溫度與對照組相比，明顯降低（P＜0.05）；肺組織超微結(jié)構(gòu)亦發(fā)生改變，基底膜明顯增厚，肺泡I上皮細(xì)胞（AT-I）核固縮，肺泡II上皮細(xì)胞（AT-II）胞漿空泡化增多；冷暴露后大鼠肺組織AQP-1的基因和蛋白表達(dá)未見明顯變化，AQP-5的基因和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論:急性冷暴露肺組織AQP-5基因和蛋白表達(dá)降低與寒冷暴露引發(fā)肺組織結(jié)構(gòu)損傷可能存在一定因果關(guān)系。

急性冷暴露；肺；水通道蛋白；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.012

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在寒冷地區(qū)及冬季，呼吸系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺部疾患、支氣管哮喘和支氣管炎等的發(fā)病率和死亡率增高，且程度加重，其中寒冷因素是主要誘因之一［1-3］。此外，大量過冷空氣吸入，嚴(yán)重時還可引起進(jìn)行性肺動脈高壓，甚至右心衰竭［4］。但截至目前，寒冷因素導(dǎo)致上述現(xiàn)象的確切機(jī)制尚不完全清楚。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一組存在于細(xì)胞膜上，可選擇性高效率轉(zhuǎn)運水分子的小分子孔道蛋白，也稱作水孔蛋白。其廣泛存在于哺乳動物的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，參與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展。截至目前，發(fā)現(xiàn)存在于肺組織的AQPs有6種:AQ P1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8及AQP9，其中AQP1 與AQP5表達(dá)于全肺，并與肺部損傷、急性肺水腫以及肺部腫瘤等肺部疾病關(guān)系密切［5-7］。但關(guān)于AQP1、AQP5表達(dá)情況與寒冷所致肺部疾患間的關(guān)系尚未見報道。本研究擬通過大鼠急性冷暴露模型，考察急性冷暴露后是否會引起大鼠肺組織損傷，以及對肺組織AQP1、AQP5表達(dá)影響情況，為寒冷誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病增加或加重的預(yù)防措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康雄性清潔級Wistar大鼠（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供）12只，體重180～220 g。實驗室常溫（23±2）℃飼養(yǎng)4 d，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)實驗室環(huán)境后用于實驗。Trizol（Invitrogen），PCR引物（上海生工），RIPA組織裂解液（北京索萊寶），兔抗AQP1抗體（Santa），兔抗AQP5抗體（Merck Millipore），Actin兔多克隆抗體（北京易寶），羊抗兔IgG辣根標(biāo)記物（百奇生物），HRP底物化學(xué)發(fā)光液（Merck Millipore）。

1.2 實驗分組及冷暴露方法

12只大鼠隨機(jī)分為常溫對照組和冷暴露組（n =6）。冷暴露組置于溫度為-25℃無風(fēng)的低溫艙中，對照組以相同方式暴露在 （23±2）℃環(huán)境艙內(nèi)。每組暴露時間為2 h，每只動物均采用單籠暴露方式。

1.3 大鼠體心溫度測定

暴露后即測大鼠直腸溫度，將測溫探頭蘸取少許甘油后，輕柔地插入大鼠肛門3 cm處，待數(shù)值穩(wěn)定后讀數(shù)。

1.4 大鼠肺臟器系數(shù)的測定

實驗結(jié)束24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。大鼠稱重后，打開胸腔取出全肺，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干后稱全肺濕重，以全肺濕重占大鼠體重之比計算大鼠肺臟器系數(shù)。

1.5 透射電鏡觀察大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)

取右肺中葉，用刀片迅速切取1 mm3的小塊肺組織，4℃磷酸鹽緩沖液清洗，3%戊二醛固定，1%餓酸后固定，常規(guī)脫水、包埋，鉛鈾雙染，于透射電鏡觀察并攝片。

1.6 RT-PCR檢測肺組織AQP-1，AQP-5 mRNA表達(dá)水平

稱取約100mg肺組織，用液氮研磨成粉末狀后進(jìn)行總RNA的提取，操作步驟嚴(yán)格按Trizol試劑說明書進(jìn)行，紫外分光光度計測定RNA純度并定量。采用降落PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序為（1）94℃5 min；（2）94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，共30個循環(huán)；（3）72℃7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖（TAE緩沖液）凝膠中進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢驗各條帶的積分吸光度值，以AQP-1、AQP-5與βactin灰度的比值作為RT-PCR的半定量結(jié)果。引物設(shè)計如下:AQP-1上游引物5′-TCACCTCCTCCCTGCTCG-3′，下游引物 5′-AAGTCGCTGCTGCGTGGG-3′，擴(kuò)增基因片段長度為370 bp；AQP-5上游引物5′-CCTCATCTTCGTCTT CTTTG-3′，下游引物 5′-CCTATTAAGAGGGCCAGAGT-3′，擴(kuò)增基因片段長度為174 bp；β-actin上游引物5′-TTGTCACCAACTGGGA CGATATGG-3′，下游引物5′-GATCTTGATCTT CATGGTGCTAGG-3′，擴(kuò)增基因片段長度為746 bp。以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.7 Western blot法檢測肺組織AQP-1，AQP-5蛋白表達(dá)

以每100mg肺組織加入1ml RIPA組織裂解液（含PMSF）提取肺組織蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。60μg提取蛋白于12%SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入AQP-1、AQP-5（1∶500）多克隆抗體，以β-actin作為內(nèi)參照，4℃過夜。1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗處理后，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。測得結(jié)果與內(nèi)參照相比的比值作為最終結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行 t檢驗分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體心溫度的比較

經(jīng)-25℃2 h急性冷暴露后，冷暴露組大鼠體心溫度為（28.07±4.15）℃，常溫對照組大鼠體心溫度為（37.33±0.25）℃，冷暴露組與對照組相比體心溫度顯著降低（P＜0.05），平均降幅達(dá)9℃之多，已達(dá)到中度低體溫狀態(tài)。

2.2 兩組大鼠肺臟器系數(shù)比較

經(jīng)-25℃2 h急性冷暴露后，冷暴露組大鼠肺臟器系數(shù)為0.45±0.03，常溫對照組大鼠肺臟器系數(shù)為0.47±0.03，兩者間無顯著差異。

2.3 兩組肺組織超微結(jié)構(gòu)比較

電鏡觀察，對照組可以清晰地看到正常的肺泡上皮細(xì)胞屏障，基底膜和肺微血管內(nèi)皮屏障；但冷暴露組肺氣血屏障處上皮基底膜明顯增厚（圖1），肺泡I型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，核出現(xiàn)固縮現(xiàn)象（圖2）；肺泡II型上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)嗜鋨性板層小體排布明顯增多，并出現(xiàn)空泡化（圖3）；肺組織明顯可見中性粒細(xì)胞（圖4）。上述結(jié)果表明，大鼠經(jīng)-25℃2 h的急性冷暴露后，肺組織發(fā)生了損傷。

2.4 兩組肺組織AQP-1和AQP-5mRNA和蛋白水平的比較

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與對照組相比冷暴露后大鼠肺組織AQP-1mRNA表達(dá)水平無顯著改變，AQP-5mRNA表達(dá)水平，顯著降低（P＜0.05）。進(jìn)一步采用Western blot方法，經(jīng)半定量分析表明，與對照組相比，冷暴露組AQP-1蛋白表達(dá)無差異，但AQP-5在冷暴露組大鼠肺組織中的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，表1）。

Fig.1 Ultrastructure changes of air-blood barrier in rat lung after cold exposure（×20 000）A:Control；B:Cold exposure；←:Epithelial basement membrane thickening

Fig.2 Ultrastructure changes of alveolar type Iepithelial cell in rat lung after cold exposure（×12000）A:Control；B:Cold exposure

Fig.3 Ultrastructure changes of alveolar type IIepithelial cell in rat lung after cold exposure（×6 000）A:Control；B:Cold exposure；←:Cell proliferation and vacuolization on the cytoplasm of alveolar type II epithelial cells

Fig.4 Ultrastructure changesof pulmonarymicrovascularendothelial cell in rat lung after cold exposure（×6 000）A:Control；B:Cold exposure

Tab.1 Analysisof the relativemRNA and protein of AQP-1 and AQP-5 in rat lung after cold exposure（±s，n=4）

AQP:Aquaporin*P＜0.05 vs control

3 討論

呼吸道是機(jī)體與外界相通的氣體通道，因此也極易受外界環(huán)境因素的影響。暴露于寒冷空氣對呼吸道生理功能亦存在潛在威脅。研究發(fā)現(xiàn)，急性和慢性冷暴露均會引起呼吸道一系列生理和病理反應(yīng)，促使呼吸系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺部疾患、支氣管哮喘和支氣管炎等的發(fā)病率和死亡率增多，且程度加重［8］。本實驗通過建立-25℃2 h的大鼠急性冷暴露模型，考察急性冷暴露后是否會引起大鼠肺組織損傷。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過-25℃2 h急性冷暴露后，大鼠核心體溫已顯著下降，出現(xiàn)了低體溫，低體溫發(fā)生可能會對機(jī)體各組織器官結(jié)構(gòu)和功能造成潛在影響。進(jìn)一步考察肺組織超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)急性冷暴露組肺氣血屏障發(fā)生了結(jié)構(gòu)損傷:如上皮基底膜增厚；肺泡I型上皮細(xì)胞核出現(xiàn)固縮；肺泡II型上皮細(xì)胞增生，胞漿內(nèi)嗜鋨性板層小體排布增多，出現(xiàn)空泡化。板層小體是肺泡II型上皮細(xì)胞合成、攜帶和分泌肺泡表面活性物質(zhì)的細(xì)胞器，板層小體空泡化提示表面活性物質(zhì)合成減少或是釋放過多，使肺泡表面張力增加，肺泡順應(yīng)性降低，出現(xiàn)肺泡塌陷，進(jìn)一步加重肺損傷。連接肺泡上皮和血管內(nèi)皮之間的薄層基底膜增厚，會延長氣體通過速率，這樣將不利于氣體交換，可能會加重相應(yīng)呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。我們推斷在-25℃2 h急性冷暴露情況下，大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷將可能會對肺組織生理功能造成一定影響，成為誘發(fā)或加重一些呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的潛在危險因素。

AQP是一個廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞膜上的一類小分子孔道蛋白家族。目前已在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了13種AQP分子，它們廣泛存在于于哺乳動物的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他組織細(xì)胞中［9］。AQP的表達(dá)異常與肺損傷疾病關(guān)系密切。目前關(guān)于AQP在肺部炎癥中作用的研究主要集中在AQP-1和AQP-5［10］。其中AQP1主要表達(dá)于胸膜臟層周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腔膜面、基側(cè)膜面以及胸膜臟層的間皮細(xì)胞，以及氣管腔上皮細(xì)胞頂膜面和支氣管黏膜下腺上皮細(xì)胞，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞頂膜面也有表達(dá)。AQP-5則主要分布在肺泡I型上皮細(xì)胞，其基因或蛋白的表達(dá)降低是肺泡I型上皮細(xì)胞損傷的特異性標(biāo)志。有研究發(fā)現(xiàn)AQP-1或是AQP-5的缺失導(dǎo)致肺通透性明顯降低，嚙齒動物既腺病毒感染之后，肺組織中AQP-1和AQP-5的表達(dá)下調(diào)［5］。小鼠肺上皮細(xì)胞暴露于TNF-α之后［11］，AQP-5表達(dá)降低呈現(xiàn)時間和劑量上的依賴性；同樣的結(jié)果也發(fā)生在脂多糖引起的急性肺損傷［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，-25℃的急性冷暴露條件下，盡管作為反映肺水平衡的間接指標(biāo)-肺臟器系數(shù)未發(fā)生明顯改變，但超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，肺組織已發(fā)生了一定程度的損傷，分析可能由于損傷程度仍較輕微，加之肺組織強(qiáng)大的代償能力，而未引發(fā)嚴(yán)重肺損傷發(fā)生。繼之分別在基因和蛋白水平考察了冷暴露后肺組織AQP-1和AQP-5表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AQP-1的表達(dá)情況未受影響，而AQP-5的基因和蛋白表達(dá)均顯著降低。我們推測分布于肺組織細(xì)胞膜蛋白AQP-5無論在轉(zhuǎn)錄過程還是在轉(zhuǎn)錄后翻譯過程中對冷的刺激較為敏感，參與寒冷暴露對肺組織的損傷。AQP的調(diào)節(jié)機(jī)制可以大致分為兩種，一種是通過翻譯后蛋白修飾作用（如磷酸化/脫磷酸化），調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運活性；另一種機(jī)制則是改變單位面積上轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量。

總之，急性冷暴露后導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞損傷和AQP-5基因和蛋白表達(dá)水平表達(dá)異常均可能影響肺組織正常生理功能，從而有可能成為誘發(fā)或加重一些呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的潛在危險因素，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。

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Effects of acute cold exposure on the expression of AQP-1 and AQP-5 in rat lung tissues

LIN Yang-sheng1，ZHANG Li1+，YANG Hua2，ZHANG Ying1，LIXi1，ZHANG Yong-qiang1，YANGDan-feng1△
（1.Institute of Health and EnvironmentalMedicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050；The 222thHospital of Chinese People's Liberary Army，Jilin 132000，China）

【ABSTRACT】Objective:To study the effectof acute cold exposure on the expression of aquaporin-1（AQP-1）and AQP-5 in lung tissues and the changesof ultrastructural pathological changes after cold exposure in rats.Methods:TwelvemaleWistar ratswere randomly divided into controlgroup（23±2）℃and cold（-25℃）exposure group，the exposure timewas 2 h.Rectal temperatures of the ratsweremeasured immediately after cold exposure.The ultrastructural pathological changes of pulmonary tissuewere observed by transmission electronicmicroscope.ThemRNA expression of AQP-1 and AQP-5 wasmeasured by RT-PCR.The protein expression of AQP-1 and AQP-5wasmeasured by Western blot.Results:The body core temperatures（28.07±4.15）℃of the cold exposure group were decreased significantly compared with the controlgroup（37.33±0.25）℃（P＜0.05）.In acute cold exposure group，themain pathological changesof pulmonary ulstructure included pulmoary epithelialbasementmembrane thickening，and karyopyknosisof AT-Icells，and vacuolization on the cytoplasm of（AT-II）cells. After acute cold exposure，the levels of bothmRNA and potein expressions of AQP-5 were decreased significantly（P＜0.05）compared with those in the control group.while AQP-1 expression level showed no statistical significance between control group and cold exposure group. Conclusion:Theremightbe some cause and effect relationship between lung tissue damage by cold exposure and the levels ofmRNA and potein expressionsof AQP-5 decreased after acute cold exposure.

acute cold exposure； lung； aquaporin； rat

R339.5

A

1000-6834（2016）03-234-04

2011ZXJ09105-03B

2015-12-21

2016-02-15

Tel:022-84655058；E-mail:fengdyd@126.com；+:共同第一作者