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      耐力訓(xùn)練對ApoE-/-致AS小鼠IL-18和IL-10表達(dá)的影響*

      2016-09-15 06:56:54劉善云張洪俠王亞慧
      關(guān)鍵詞:白介素耐力切片

      王 敏,劉善云,張洪俠,王亞慧,劉 凱

      耐力訓(xùn)練對ApoE-/-致AS小鼠IL-18和IL-10表達(dá)的影響*

      王 敏1,2,劉善云1△,張洪俠3,王亞慧1,劉 凱1

      (1.天津體育學(xué)院健康與運(yùn)動科學(xué)系 ,天津300381;2.江蘇省漣水中學(xué) ,淮安223400;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部 ,天津300193)

      目的:深入觀察耐力訓(xùn)練對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)致動脈粥樣硬化(AS)小鼠白介素18(IL-18)和白介素10(IL-10)的影響 ,探討運(yùn)動防治AS的可能機(jī)制。方法:選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只:隨機(jī)分為2組(n=10):AS模型組(AC組)和運(yùn)動干預(yù)組(AE組),AE組進(jìn)行跑臺耐力訓(xùn)練;選取8周齡C57BL/6J雄性小鼠10只作為正常對照組(CC組)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)12周,取主動脈制作冰凍切片,分別用于觀察主動脈AS斑塊和病理變化以及主動脈IL-18、IL-10蛋白表達(dá);采用ELISA法檢測血清IL-18、IL-10水平。結(jié)果:①12周高脂膳食致ApoE-/-小鼠發(fā)生典型的AS病變,耐力訓(xùn)練使AS斑塊面積顯著減少(P<0.01),病變程度顯著減輕。②與CC組比較,AC組、AE組小鼠血清IL-18和IL-10水平均顯著升高(P<0.01),且AC組IL-18/IL-10比值顯著升高(P<0.01)。AE組血清IL-18水平及IL-18/IL-10比值均顯著低于AC組(P<0.01)。③與CC組比較,AC組、AE組小鼠主動脈IL-10和IL-18蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01),AE組IL-10表達(dá)顯著高于AC組(P<0.05),IL-18表達(dá)顯著低于AC組(P<0.05)。結(jié)論:耐力訓(xùn)練通過降低血液和主動脈IL-18及提高IL-10水平,增強(qiáng)了主動脈血管抗炎能力,從而發(fā)揮抗AS的作用。

      耐力訓(xùn)練;動脈粥樣硬化 (AS);白介素18(IL-18);白介素10(IL-10);載脂蛋白 E基因敲除(ApoE-/-);小鼠

      【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.009

      動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)已被證實(shí)是與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)的慢性炎癥性疾病,如何控制機(jī)體炎癥已成為AS防治的新靶點(diǎn)[1,2]。作為完整的有機(jī)體,體內(nèi)存在完善的免疫炎癥平衡系統(tǒng),促炎因子與抗炎因子的失衡可能是AS重要的致病因素。白介素18(interleukin-18,IL-18)是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥因子,已被證實(shí)參與AS病變?nèi)^程,而IL-10作為抗炎癥因子通過抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生而發(fā)揮抗AS作用。IL-18/IL-10比值能較客觀地反映機(jī)體炎癥/抗炎癥系統(tǒng)的動態(tài)平衡狀態(tài)[3,4]。

      近年研究顯示,運(yùn)動具有抗炎癥效果,長期運(yùn)動引起骨骼肌的抗炎癥作用對防治慢性炎癥性疾病產(chǎn)生有益的影響[5,6],但運(yùn)動能否通過增強(qiáng)機(jī)體抗炎能力而發(fā)揮抗AS的作用還缺乏深入研究。本研究在復(fù)制實(shí)驗(yàn)動物AS模型的基礎(chǔ)上,深入觀察長期耐力訓(xùn)練對實(shí)驗(yàn)動物血液和主動脈IL-18、IL-10的影響,以期從運(yùn)動的抗炎角度闡明運(yùn)動防治AS的可能機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

      選取8周齡雄性ApoE基因敲除(apolipoprotein Egene knockout,ApoE-/-)小鼠20只(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心),隨機(jī)分為AS模型組(AC組)和運(yùn)動干預(yù)組(AE組)(n=10),飼喂高脂高膽固醇飼料(膽固醇為0.15%,脂肪為21%)。另選取10只同品系8周齡C57BL/6J雄性小鼠作為正常對照組(CC組),飼喂標(biāo)準(zhǔn)動物飼料。將各組小鼠分籠飼養(yǎng),每籠3~5只,自由進(jìn)食進(jìn)水(飲用潔凈水)。每天進(jìn)行紫外線消毒20min,室溫(22~24)℃,相對濕度40%~60%,自然光照。

      1.2 運(yùn)動方案

      令A(yù)E組小鼠在跑臺上進(jìn)行耐力訓(xùn)練(ZH-PT動物跑臺,安徽正華儀器設(shè)備有限公司)。運(yùn)動負(fù)荷為:由跑臺速度10m/min、運(yùn)動時間30min/count(第1~2周),逐漸增加至13m/min、1 h/count(第3~12周)。每周訓(xùn)練5次,每天上午訓(xùn)練1次,共持續(xù)12周。

      1.3 取材及組織處理

      實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后將動物處死并取材,AE組停止運(yùn)動24 h,分別取血和主動脈等組織。采取腹腔注射10%水合氯醛,摘眼球取血,從眼眶靜脈叢采血約1.5~2 ml,離心分離血清,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      主動脈標(biāo)本制作和切片制備:動物取血后,立即將小鼠固定于手術(shù)臺,打開腹腔和胸腔,取出全心臟及主動脈根部(靠近主動脈瓣尖部約0.5 cm),剝離血管外附著組織后進(jìn)行固定和包埋,液氮速凍后放置-80℃冰箱保存,以備制作冰凍切片。切片制作過程[7]:從心底部開始作橫斷面連續(xù)切片(從主動脈瓣尖出現(xiàn)起作連續(xù)橫切),切片厚度7μm,在顯微鏡下觀察并選取切片,每間隔10張選取1張,分別用于主動脈斑塊面積評估和病理分析以及炎癥因子表達(dá)測定等。

      1.4 檢測指標(biāo)與方法

      1.4.1 血清IL-18和IL-10水平測定 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測定血清IL-18和IL-10水平(美國R&D分裝)。

      1.4.2 主動脈斑塊面積評估及病理形態(tài)學(xué)分析

      取各組主動脈根部油紅O(ORO)染色切片5張,采用計算機(jī)全自動圖像分析系統(tǒng)Leica Qwin V3對主動脈斑塊面積進(jìn)行評估。以斑塊面積占血管腔總面積的比值表示斑塊大小。取各組主動脈切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)特征及不同階段的AS病變。

      1.4.3 主動脈IL-18和IL-10蛋白表達(dá)測定 取各組主動脈切片,采用免疫組化法測定主動脈IL-18 和IL-10蛋白表達(dá)。陽性細(xì)胞染成棕黃色,細(xì)胞核為藍(lán)色。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取4個視野,利用IPP 6.0軟件測量染色部位陽性表達(dá)率,用每組切片平均光密度(MOD)值表示陽性細(xì)胞表達(dá)量[8]。

      1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

      2 結(jié)果

      2.1 耐力訓(xùn)練對ApoE-/-小鼠AS形成的干預(yù)效果

      實(shí)驗(yàn)動物主動脈ORO染色切片顯示,CC組小鼠主動脈無任何AS斑塊。而20周齡ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜上可見大量被染成紅色的脂質(zhì)斑塊,斑塊面積占血管腔總面積的(40.39±10.13)%。AE組小鼠主動脈斑塊面積(21.37±1.70)%顯著低于AC組(表1)。主動脈HE染色切片顯示,CC組小鼠主動脈壁內(nèi)膜光滑,未發(fā)生任何AS病變。AC組小鼠主動脈內(nèi)膜明顯增厚,可見許多脂紋-纖維斑塊期病變以及少量由膽固醇結(jié)晶(針狀空隙)和泡沫細(xì)胞構(gòu)成的粥樣斑塊。與AC組比較,AE組主動脈病變程度顯著減輕,多為脂紋期和纖維斑塊期病變(圖1,見彩圖頁Ⅲ)。

      2.2 各組小鼠血清IL-18和IL-10水平的變化

      與CC組比較,AC組和AE組小鼠血清IL-18、IL-10水平均顯著升高(P<0.01)。與AC組比較,AE組IL-18水平顯著降低(P<0.01),IL-10水平呈升高趨勢,但無顯著性差異。與CC組相比,AC組小鼠血清IL-18/IL-10比值顯著升高(P<0.01),AE組與CC組無顯著性差異;與AC組比較,AE組IL-18/IL-10比值顯著降低(P<0.01,表2)。

      Tab.1 Effects of endurance training on aortic plaque area in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      Tab.1 Effects of endurance training on aortic plaque area in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      AC:Atherosclerosismodel group;AE:Atherosclerosis exercise group**P<0.01 vs AC group

      ?

      Tab.2 Effects of endurance training on the serum levels of IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      Tab.2 Effects of endurance training on the serum levels of IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      AC:Atherosclerosismodel group;AE:Atherosclerosis exercise group;CC:Atherosclerosis control group;IL:Interleukin**P<0.01 vs CC group;##P<0.01 vs AC group

      ?

      2.3 各組小鼠主動脈IL-18和IL-10蛋白表達(dá)的變化

      CC組小鼠主動脈壁只有少量IL-18和IL-10蛋白表達(dá)量;AC組和AE組主動脈IL-18、IL-10蛋白表達(dá)量均顯著高于CC組(P<0.01)。與AC組比較,AE組IL-18表達(dá)顯著降低,IL-10表達(dá)顯著升高(P <0.05,表3)。

      Tab.3 Effects of endurance training on the protein expressionsof IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      Tab.3 Effects of endurance training on the protein expressionsof IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice(±s,n =10)

      AC:Atherosclerosismodel group;AE:Atherosclerosis exercise group;CC:Atherosclerosis control group;IL:Interleukin**P<0.01 vs CC group;#P<0.05 vs AC group

      Group IL-18 IL-10 CC 0.21±0.01 0.18±0.04 AC 0.46±0.07** 0.39±0.09**AE 0.37±0.06**# 0.48±0.11**#

      3 討論

      采用基因敲除技術(shù)培育成功的ApoE-/-小鼠是目前AS研究中較理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,8周齡ApoE-/-小鼠經(jīng)12周高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)后,AS模型組主動脈內(nèi)膜可見大量的AS斑塊及不同時期的AS病變,表明本實(shí)驗(yàn)中已成功復(fù)制實(shí)驗(yàn)動物AS模型。與模型組相比,運(yùn)動干預(yù)組主動脈斑塊面積顯著縮小,AS病變程度顯著減輕,表明12周耐力訓(xùn)練能夠有效地抑制或延緩ApoE-/-小鼠AS病變的形成。

      許多研究已表明,炎癥貫穿AS發(fā)生發(fā)展的全過程,炎癥在介導(dǎo)AS發(fā)病機(jī)理中扮演重要的角色[1,2]。IL-18是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥因子,已被證實(shí)參與AS病變?nèi)^程[9],血清IL-18水平升高可使動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性增加[10]。而IL-10作為抗炎癥因子,可通過抑制多種促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、下調(diào)細(xì)胞黏附分子表達(dá)和抑制免疫反應(yīng)等,從而發(fā)揮抗AS的作用。IL-18/IL-10比值能較客觀地反應(yīng)機(jī)體炎癥/抗炎癥系統(tǒng)的動態(tài)平衡狀態(tài),其比值增大表明了炎癥/抗炎癥失衡以及炎癥反應(yīng)的增強(qiáng),二者平衡失調(diào)可能是促使AS病變進(jìn)展的重要原因[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ApoE-/-小鼠體內(nèi)存在較高的炎癥水平以及促炎癥細(xì)胞因子/抗炎癥細(xì)胞因子平衡系統(tǒng)的失調(diào)。但與AS模型組比較,運(yùn)動干預(yù)組IL-18水平和IL-18/IL-10比值均顯著降低,表明12周耐力訓(xùn)練可能通過降低血清炎癥因子水平、糾正機(jī)體促炎癥因子/抗炎癥因子平衡系統(tǒng)失調(diào),進(jìn)而阻礙AS病變的進(jìn)程。

      血管內(nèi)皮是各種炎癥因子攻擊的主要靶器官。已有研究表明,IL-18參與AS斑塊形成的過程,在不穩(wěn)定斑塊中IL-18的表達(dá)明顯高于穩(wěn)定斑塊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),發(fā)生AS的ApoE-/-小鼠主動脈有大量的炎癥因子IL-18表達(dá),表明IL-18與AS病變形成有密切關(guān)系,而12周耐力訓(xùn)練可顯著減少主動脈IL-18表達(dá),并使抗炎癥因子IL-10的表達(dá)增加。近年研究認(rèn)為,有氧運(yùn)動具有調(diào)節(jié)血脂以外的抗AS途徑,長期規(guī)律的有氧運(yùn)動具有顯著的抗炎癥效應(yīng),因此在防治慢性炎癥性疾病中發(fā)揮有益的作用[12,13]。本研究表明 ,長期規(guī)律的耐力訓(xùn)練可能通過減少血管局部炎癥因子表達(dá),減輕血管內(nèi)膜的炎癥反應(yīng),并增強(qiáng)血管內(nèi)皮的抗炎癥能力,進(jìn)而對ApoE-/-小鼠AS形成起到良好的干預(yù)效果。

      [1]杜立杰,王學(xué)東 .炎癥與動脈粥樣硬化[J].中華心血管雜志,2006,11(1):62-65.

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      [3]董 軍,姜 華,陳樹濤.老年冠心病與血清炎性因子的關(guān)系[J].中華老年心腦血管病雜志,2015,17 (1):90-91.

      [4]諸曉楓,李紅莉.IL-18、IL-10及其比值與冠狀動脈粥樣硬化斑塊易損性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,9(22):4387-4390.

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      The effects of endurance training on IL-18 and IL-10 in atherogenic ApoE-/-mice

      WANGMin1,2,LIU Shan-yun1△,ZHANG Hongia3,WANG Ya-hui1,LIU Kai1
      (1.Sport Department of Health and Exercise Science,Tianjin University of Sport,Tianjin 300381;2.Lian ShuiMiddle School,HuaiAn 223400;3.Teaching Departmentof Clinic,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

      【ABSTRACT】Objective:To investigate theeffectsof endurance training on interleukin-18(IL-18)and IL-10 in atherogeniceapolipoprotein E gene knockout(ApoE-/-)mice and explore its possiblemechanism preventing atherosclerosis occurrence.Methods:Twentymale ApoE-/-mice (age:8 weeks)were randomly divided into atherosclerosis(AS)model group(AC)and exercise group(AE)and chosemale C57BL/6Jmice (age:8 weeks)as controlgroup(CC).After12 weeks,the aortic trunk closed heartwas prepared for frozen section,whichwere used to observe the changesof plaque area and pathology.The expressionsof IL-18 and IL-10 proteins and the levelsofblood IL-18 and IL-10weremeasured by ELISA.Results:①Twelveweeks high fatdietsignificantly resulted in typical AS lesion,however,endurance trainingmarkedly decreased ASplaque area and pathology in ApoE-/-mice(P<0.01).②Compared with CC group,serum IL-18 and IL-10 levelswere significantly increased in AC group and AE group and IL-18/IL-10 ratiowas also increasedmarkedly in AE group(P<0.01).Serum IL-18 level and IL-18/IL-10 ratio in AE groupwere all significantly lower than those in AC group(P<0.01).③Comparedwith CC group,the expressions of IL-10 and IL-18 proteins in aortawere significantly increased in ACgroup and AEgroup(P<0.01).Theexpression of IL-10 protein in aorta in AE groupwasmarkedly higher than that in AC group but IL-18 protein expressionwas significantly lower.Conclusion:Endurance training can prevent ASappeared through enhancing aortic anti-inflammatory capability by decreasing serum and aortic IL-18 levelsand by increasing serum and aortic IL-10 level.

      endurance training; atherosclerosis; interleukin-18; interleukin-10; apolipoprotein E gene knockoutmice

      G804.3

      A

      1000-6834(2016)03-225-04

      天津市科技計劃項目(08JCYBJC06000);天津體育學(xué)院博士科研基金項目

      2015-03-30

      2015-10-19

      Tel:022-23012352;E-mail:liu shanyun@163.com

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