厄貝沙坦對抗糖尿病大鼠心肌纖維化作用及機制*

張冠軍，張蔚屏，王開成，于 影，謝雪峰，高 琴△

厄貝沙坦對抗糖尿病大鼠心肌纖維化作用及機制*

張冠軍1，2，張蔚屏1，王開成2，于 影1，謝雪峰3，高 琴1△

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 ，安徽 蚌埠233030；2.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院 ，江蘇無錫214187；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院2012級生物科學(xué)系 ，安徽 蚌埠233030）

目的:觀察厄貝沙坦對抗糖尿病大鼠心肌纖維化的作用，并分析細(xì)胞外調(diào)節(jié)信號激酶（ERK）通路在其中的作用。方法:健康雄性SD大鼠32只，隨機分成兩組:正常對照組（CON，n=10），實驗組（n=22）。實驗組糖尿病造模成功20只，隨機分為2組（n=10）:糖尿病組（DM）、厄貝沙坦+糖尿病組（Ir+DM）。8周后測定空腹血糖（FBG）水平，計算各組大鼠體重（BW）、心體比（H/B）和左室重量指數(shù)（LVWI）；Masson染色觀察心肌形態(tài)及纖維化的發(fā)生；ELISA檢測心肌組織膠原Ⅰ（colⅠ）、膠原Ⅲ（colⅢ）含量；Western blot檢測心肌組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與CON組相比，DM組大鼠FBG水平、H/B、LVWI顯著升高，體重顯著減輕，colⅠ、colⅢ含量顯著增加，心肌組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)及p-ERK1/2/ERK1/2比值增加（P＜0.05，P＜0.01），ERK1/2無明顯變化。Masson染色顯示DM組心肌膠原纖維粗大，交織成網(wǎng)狀，排列分布不均，沉積增多。與DM組大鼠相比，厄貝沙坦干預(yù)后大鼠體重明顯增加，H/B、LVWI、心肌組織colⅠ、colⅢ含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），p-ERK1/2蛋白表達(dá)及p-ERK1/ 2/ERK1/2比值降低（P＜0.01），且心肌形態(tài)改善明顯。結(jié)論:糖尿病可誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生，厄貝沙坦可通過抑制ERK的活化減輕糖尿病誘導(dǎo)的心肌纖維化損傷。

糖尿?。恍募±w維化；厄貝沙坦；ERK通路；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.008

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為一種慢性進行性內(nèi)分泌疾病近年來已成為糖尿病（diabetesmellitus，DM）并發(fā)癥研究領(lǐng)域的熱點之一，其病理改變包括細(xì)胞凋亡、心肌肥大和心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）的發(fā)生等。心肌纖維化是臨床上引起糖尿病心肌病的重要因素之一，是誘導(dǎo)心室舒張功能不全的重要原因［1］，也是決定心血管疾病患者預(yù)后的主要因素之一［2］。

厄貝沙坦作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床應(yīng)用廣泛，主要用于治療高血壓以及合并高血壓的Ⅱ型糖尿病腎病等。厄貝沙坦可改善腎血管性高血壓所致的心肌纖維化［3］。厄貝沙坦是否可逆轉(zhuǎn)糖尿病誘導(dǎo)的心肌纖維化國內(nèi)外報道較少。

Ras/MEK/ERK通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要路徑之一，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程。ERK1/2主要被各種生長因子、過氧化氫、離子射線等磷酸化而激活，激活的p-ERK1/2可促進某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Xin［4］等人觀察到高糖誘導(dǎo)的糖尿病心肌纖維化可能與激活ERK信號通路有關(guān)。Vivian［5］等也觀察到在糖尿病心肌纖維化過程中，p-ERK1/2呈增加趨勢。厄貝沙坦是否可以通過降低ERK1/2活性而對抗糖尿病心肌纖維化的發(fā)生？因此，本實驗擬建立糖尿病大鼠模型，觀察厄貝沙坦是否可對抗糖尿病心肌纖維化的發(fā)生，并進一步分析厄貝沙坦是否通過抑制ERK信號通路而對抗糖尿病誘導(dǎo)的心肌纖維化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司；厄貝沙坦片（Irbesartan tablets）購自賽諾菲（杭州）制藥有限公司分裝，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字J20130049；膽固醇、膽酸鹽購自安徽安特食品股份有限公司；colⅠ，colⅢELISA試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗體購自Anbo公司；羊抗小鼠及羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Millipore公司。采用易速得血糖分析儀及配套的臺欣試紙測定大鼠空腹血糖變化。

1.2 糖尿病模型復(fù)制及分組

健康清潔級雄性SD大鼠（160～180 g）32只，購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組10只和實驗組22只，對照組（control，CON）大鼠常規(guī)飲食，實驗組大鼠給予高糖、高脂、高膽固醇飲食（67%基礎(chǔ)飼料+ 20%白砂糖+10%豬油+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鹽），4周后實驗組大鼠禁食12 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg（對照組大鼠給予同等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射），72 h后靜脈取血測定空腹血糖，連續(xù)3 d血糖≥16.7 mmol/L且進食、飲水、尿量明顯增多即為糖尿病大鼠造模成功［6，7］。每周測血糖，＜16.7mmol/L者剔除。剔除血糖不合格大鼠2只，將模型復(fù)制成功的20只大鼠隨機分為糖尿病組（DM，n=10）和厄貝沙坦+糖尿病組（Ir+DM，n =10），Ir+DM組給予厄貝沙坦50 mg/（kg·d）灌胃［8］，CON和DM組給予等體積的生理鹽水，繼續(xù)飼養(yǎng)8周。

1.3 空腹血糖檢測

糖尿病造模8周后，禁食12 h，清晨稱量大鼠體重，測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平。

1.4 心體比、左室重量指數(shù)檢測

4%水合氯醛以1 ml/100 g麻醉大鼠，打開心腔，取心臟，剔除多余組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重心臟質(zhì)量及左室質(zhì)量，以全心質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為心臟指數(shù)（heart weight/body weight，H/B，mg/g），以左室質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為左室重量指數(shù)（left ventricularweight index，LVWI，mg/g）。

1.5 ELISA檢測心肌組織中colⅠ、colⅢ含量水平

適量組織加生理鹽水研碎取上清，按照大鼠colⅠ、colⅢELISA檢測試劑盒說明書進行余下操作。

1.6 Masson染色

大鼠處死后，取心尖部，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，Masson染色，鏡下觀察心肌組織的變化及膠原分布。

1.7 Western blot檢測心肌組織ERK1/2、p-ERK1/ 2蛋白表達(dá)

取各組標(biāo)本0.1 g研磨，4℃離心（12 000 r/min，30min），取上清，BCA法測定蛋白濃度，以總蛋白0.08mg上樣，樣品蛋白變性、配膠、電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋一抗ERK1/2（1∶500）、p-ERK1/2（1∶500），加一抗，4℃過夜，次日TBST洗膜4次，加二抗（1∶10 000），水浴搖床，洗膜。ECL試劑顯色，曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)測量所得條帶的灰度值，計算p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)的相對量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖、體重、心體比、左室重量指數(shù)水平

與CON組大鼠相比，DM組大鼠的FBG、H/B、LVWI顯著升高，BW顯著減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與DM組相比，Ir+DM組的H/B、LVWI明顯降低，BW顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)BG水平無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。

Tab.1 Changesof FBG levels，BW，H/B and LVWIin differentgroups（±s，n=10）

Tab.1 Changesof FBG levels，BW，H/B and LVWIin differentgroups（±s，n=10）

CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+diabetesmellitus；FBG:Fasting blood glucose；BW:Bodyweight；H/B:Heartweight/bodyweight；LVWI:Leftventricularweight index**P＜0.01 vs CON；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DM

Group　FBG（mmol/L）　BW（g）　H/B（mg/g）　LVWI（mg/g）CON　5.85±1.06　264.17±8.52　2.79±0.15　1.54±0.10 DM　32.17±2.15**　220.83±5.34**　4.30±0.12**　2.20±0.16**Ir+DM　30.28±1.43　242.17±3.31##　3.36±0.10##　1.87±0.17#

2.2 ELISA檢測心臟組織中colⅠ及colⅢ的含量

與CON組相比，DM組大鼠心臟組織中colⅠ及colⅢ的含量顯著增加（P＜0.01），厄貝沙坦干預(yù)后colⅠ及colⅢ含量顯著下降（P＜0.01，表2）。

Tab.2 Comparison of colⅠand colⅢcontent inmyocardial tissue among various groups（ng/g，±s，n =10）

Tab.2 Comparison of colⅠand colⅢcontent inmyocardial tissue among various groups（ng/g，±s，n =10）

CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+ diabetesmellitus**P＜0.01 vs CON；##P＜0.01 vs DM

Group　 ColⅠ　ColⅢCON　132.3±8.4　33.6±2.6 DM　286.1±8.4**　79.3±2.6**Ir+DM　177.1±7.2##　46.8±3.0##

2.3 各組大鼠心臟Masson染色

Masson染色后，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色。CON組心肌排列整齊且分布均勻，膠原纖維散在分布或呈條索狀，DM組膠原纖維粗大，交織成網(wǎng)狀或堆積成片狀，排列分布不均，沉積增多，厄貝沙坦干預(yù)后心肌形態(tài)改善明顯（圖1，見彩圖頁Ⅲ）。

2.4 心臟組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化

與CON組相比，DM組大鼠心肌p-ERK1/2蛋白表達(dá)及 p-ERK1/2/REK1/2比值顯著增加（P＜0.01），ERK1/2蛋白表達(dá)變化不明顯；與DM組相比，Ir+DM組大鼠心肌p-ERK1/2蛋白表達(dá)及p-ERK1/2/REK1/2比值均顯著降低（P＜0.01），ERK1/2變化不明顯（圖2）。

3 討論

糖尿病心肌病由Rubler等在1972年首次提出［9］，是獨立于高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病等之外的一種特異性心肌病變。心肌纖維化即心臟局部成纖維細(xì)胞過度增殖，心肌細(xì)胞間質(zhì)膠原沉積等，是臨床上引起糖尿病心肌病的重要因素之一，在糖尿病患者的心衰及猝死中起著重要作用，目前具體機制尚不清楚。因此，探討心肌纖維化發(fā)病機制，研究其可能的治療措施，對于改善糖尿病患者的預(yù)后具有重要意義。

Fig.2 The representiveWestern blot results（±s，n=10）A，B，C:Quantitative analysis of p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expressions；D:The ratio of p-ERK1/2/ERK1/2 in myocardial tissues of diabetic rats；CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+diabetesmellitus

本實驗建立2型糖尿病模型，在8周時FBG測量值顯著高于正常組，提示模型復(fù)制且維持成功。糖尿病大鼠心臟心體比、左室重量指數(shù)降低，Masson染色觀察到膠原纖維粗大，心肌組織colⅠ、colⅢ含量均顯著增加，提示糖尿病已經(jīng)引起心肌纖維化的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)的腹膜纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以上調(diào)ERK1/2磷酸化水平，而應(yīng)用特異性ERK抑制劑（PD98059）后腹膜纖維化程度明顯降低。厄貝沙坦作為AngⅡ受體拮抗劑，在受體水平阻斷AngⅡ的生物作用［10］。Tang［11］在實驗中觀察到厄貝沙坦可以減輕糖尿病心肌病的損傷程度。ERK1/2的磷酸化參與了小鼠糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)病過程［12］。在白藜蘆醇及塞利路爾的抗心肌纖維化研究中也發(fā)現(xiàn)，兩者通過抑制ERK及ERK激酶的活化從而阻斷ERK信號通路并最終發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用［13］。Zhang［14］在ACE2缺陷引起的小鼠心肌纖維化研究中也發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)量、colⅠ及colⅢ含量顯著升高，厄貝沙坦治療后表達(dá)量及含量都下調(diào)，且纖維化程度降低。本實驗中DM組大鼠心肌纖維化同時，心肌組織 p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加，p-ERK1/2/ERK1/2比值上調(diào)，提示ERK通路的激活可能參與了糖尿病引起的心肌纖維化。給予厄貝沙坦治療后，糖尿病大鼠心體比，左室重量指數(shù)均提高，病理改變減輕，心肌組織colⅠ、colⅢ含量皆減少，提示糖尿病心肌纖維化的發(fā)生減輕。同時觀察到心肌p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低，p-ERK1/2/ERK1/2比值下調(diào)，提示厄貝沙坦可能通過抑制ERK通路的激活對抗糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。

因此，厄貝沙坦可以對抗糖尿病大鼠心肌纖維化損傷，可能是通過抑制ERK信號通路的激活實現(xiàn)的。當(dāng)然，糖尿病心肌纖維化的發(fā)病原因非常復(fù)雜，具體機制尚有待進一步明確。

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Themechanism of irbesartan against diabetes induced myocardial fibrosis in ratmodel

ZHANGGuan-jun1，2，ZHANGWei-ping1，WANG Kai-cheng2，YU Ying1，XIEXue-feng3，GAOQin1△
（1.Departmentof Physiology，Bengbu Medical Cllage，Bengbu 233030；2.Intensive Care Unit，Huishan People's Hospital ofWuxi，Wuxi 214187；3.Department of Life Sciences，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China）

【ABSTRACT】Objective:To observe the protective effectof irbesartan onmyocardial fibrosis in diabetic rats，and analyze the role of extracellular signal-regulated kinase（ERK）pathway in this protection.Methods:Thirty twomale SD ratswere randomly divided into two groups: normal control group（CON，n=10），experimentalgroup（n=22）.Twenty diabetic ratswhich hadmodelled successfullywere randomly divided into two groups:diabetic group（DM，n=10），irbesartan+DM group（Ir+DM，n=10）.After 8 weeks，fasting blood glucose （FBG）level，bodyweight（BW），the ratio of heartweight/body weight（H/B）and left ventricularweight index（LVWI）weremeasured. Themyocardialmorphological and fibrotic changeswere observed by Masson staining.Col Iand col III contentswere evaluated using ELISA method，and the protein expressionsof ERK1/2，p-ERK1/2 in heart tissuewere tested byWestern blot.Results:Comparedwith CON group，in diabetic rats，the levelsof FBG，H/B and LVWIwere increasedwhile BW was decreased.The contentsof col Iand col IIIwere increased aswellas the protein expression of p-ERK1/2 and the ratio of p-ERK1/2/ERK1/2（P＜0.05，P＜0.01），which had the statistic differences，while ERK1/2 protein expressionwas not changed.Masson staining showedmyocardial collagenwas increased，arranged in disorder and uneven distribution.However，in Ir+DM group，BW was increased obviously，H/B，LVWI，the contents of col Iand col IIIwere decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01），p-ERK1/2 protein expression and the ratio of p-ERK1/2/ERK1/2 were decreased（P＜0.01），which had the statistic differences.Meanwhilemyocardialmorphologywas improved significantly.Conclusion:Diabetes can induce the happening of myocardial fibrosis，and irbesartan can induce the damage ofmyocardial fibrosis through inhibitting the activation of ERK.

diabetes； myocardial fibrosis； irbesartan； ERK pathway； rat

R363.2

A

1000-6834（2016）03-221-04

國家自然科學(xué)基金（81000074）；安徽省自然科學(xué)基金（1508085MH169）；蚌埠醫(yī)學(xué)院博士啟動基金（Bykf13A05）；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計劃項目（Byycxz1303）；國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（201410367009）

2015-01-09

2015-10-15

Tel:0552-3175268；E-mail:bbmcgq@126.com