沉默GLUT-1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株TE-TE-1313增殖和遷移的影響△

陳濤　劉小興　陳虞梅　施一平　萬良榮　劉建軍上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，放療科，上海007

沉默GLUT-1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株TE-TE-1313增殖和遷移的影響△

陳濤1*#劉小興2*陳虞梅1施一平1萬良榮1劉建軍1
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院1核醫(yī)學(xué)科，2放療科，上海200127

目的研究沉默葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter protein-1，GLUT-1）的表達(dá)對(duì)食管鱗癌TE-13細(xì)胞增殖、周期及遷移的影響及可能的作用機(jī)制。方法采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將特異性針對(duì)GLUT-1基因的GLUT-1-shRNA轉(zhuǎn)入TE-13細(xì)胞，建立穩(wěn)定干擾GLUT-1表達(dá)的TE-13細(xì)胞株，分成GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GLUT-1-shRNA對(duì)TE-13細(xì)胞GLUT-1 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。CCK-8法、FCM法和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)沉默GLUT-1表達(dá)后對(duì)TE-13細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和遷移的影響；同時(shí)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞遷移以及乏氧相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果采用慢病毒將GLUT-1-shRNA轉(zhuǎn)入TE-13細(xì)胞后，可明顯下調(diào)GLUT-1蛋白（t=6.713，P<0.01）和mRNA的表達(dá)水平（t= 4.181，P<0.05）。與陰性對(duì)照組相比，GLUT-1干擾后細(xì)胞的增殖至72 h（t=3.097，P<0.05）和96 h（t=3.497，P<0.05）明顯被抑制，同時(shí)細(xì)胞的遷移能力可見下降，但是細(xì)胞周期至24 h未見影響；基質(zhì)金屬蛋白酶的MMP-9（t= 6.895，P<0.01）和缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α（t=13.74，P<0.001）的表達(dá)明顯下調(diào)，但是MMP-2的表達(dá)沒有變化（t= 2.582，P>0.05）。結(jié)論沉默GLUT-1的表達(dá)可抑制食管磷癌細(xì)胞株TE-13細(xì)胞的增殖和遷移，并明顯下調(diào)細(xì)胞內(nèi)MMP-9和HIF-1α蛋白的表達(dá)，為尋找靶向治療食管癌新靶點(diǎn)提供了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

食管鱗癌；GLUT-1；增殖；細(xì)胞周期；遷移

Oncol prog,2016,14(1)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界上排名惡性腫瘤的第七位[1]。中國(guó)是世0界上食管癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率位列惡性腫瘤的第四位[2]。食管癌惡性程度高、預(yù)后差，盡管隨著手術(shù)方式以及放、化療等治療模式的不斷改進(jìn)，其遠(yuǎn)期生存率有所提高，但是經(jīng)過幾次大樣本的調(diào)查之后發(fā)現(xiàn)，總的術(shù)后5年生存率仍舊為25%～40%[3-4]。近年來各種分子靶向治療方法有效地控制了腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，在延長(zhǎng)腫瘤患者生存期、降低患者病痛方面取得了一定的效果[5]。但是，關(guān)于食管癌的分子靶向治療的研究甚少。因此，尋求新的食管癌分子靶向治療方法迫在眉睫。

惡性腫瘤組織生長(zhǎng)速度快，對(duì)能量的需求遠(yuǎn)大于正常組織，即使是在有氧狀態(tài)下，惡性腫瘤細(xì)胞仍以活躍的葡萄糖酵解這一特征性生化代謝模式作為其能量的主要提供者[6]。然而，1分子葡萄糖經(jīng)無氧糖酵解產(chǎn)生的三磷酸腺苷（ATP）僅為有氧三羧酸循環(huán)的1/18[7]，因此，為了滿足腫瘤細(xì)胞的這種代謝特征，需要攝取大量的葡萄糖[8-9]。大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞攝取葡萄糖的過程都需要膜結(jié)合糖蛋白家族即易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族（facilitates glucose transporters，GLUT）的參與[10]。

GLUT的功能是攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入胞質(zhì)，到達(dá)細(xì)胞葡萄糖代謝的主要場(chǎng)所——線粒體，它是關(guān)鍵的細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)器[10]。目前發(fā)現(xiàn)GLUT家族共有14種亞型，其中GLUT-1在人類不同來源的惡性腫瘤中表達(dá)水平明顯升高[11-12]。應(yīng)用食管癌術(shù)后的組織病理免疫組化分析研究表明[13-14]，腫瘤細(xì)胞膜表面GLUT-1過度表達(dá)與食管癌的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后生物學(xué)行為密切相關(guān)。Kato等[15]通過正電子發(fā)射斷層顯像（PET）與術(shù)后病理比較發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌氟化去氧葡萄糖（FDG）攝取程度與GLUT-1密切相關(guān)，且FDG高攝取及GLUT-1高表達(dá)的食管癌患者預(yù)后明顯差于FDG低攝取及GLUT-1低表達(dá)者。因此，調(diào)低或抑制食管癌細(xì)胞膜表面GLUT-1蛋白的表達(dá)，是否能夠降低或抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及侵襲遷移成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究選擇食管鱗癌細(xì)胞株TE-13作為惡性腫瘤研究對(duì)象，采用以慢病毒為載體介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)，通過控制腫瘤細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面GLUT-1蛋白合成的靶基因，抑制或調(diào)低腫瘤細(xì)胞膜表面GLUT-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而觀察RNA干擾GLUT-l蛋白表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株TE-13的生長(zhǎng)增殖、遷移以及相關(guān)蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）等表達(dá)的影響，尋找抑制食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的新路徑和方法。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器

人食管鱗癌細(xì)胞株TE-13購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。攜帶有針對(duì)GLUT-1基因的shRNA（GLUT-1-shRNA）和陰性對(duì)照（negative control，NC）的shRNA（NC-shRNA）的重組慢病毒載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。GLUT-1-shRNA序列為5′-GCATCAACGCTGTCTTCTATT-3′；NC-shRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；RNA抽提試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人β-actin、HIF-1α、MMP-9和MMP-2單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人GLUT-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞組織快速裂解液（RAPI裂解液）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chainReaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio Tek公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton-Dickinson公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將食管鱗癌TE-13細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2病毒轉(zhuǎn)染接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5× 104/孔的密度接種于12孔板中，分別于接種后次日更換培養(yǎng)液并向各組細(xì)胞中分別加入病毒液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection）為20。實(shí)驗(yàn)分為2組：①GLUT-1-shRNA組，以攜帶有GLUT-1-shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染TE-13細(xì)胞；②陰性對(duì)照組，以攜帶有NC-shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染TE-13細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)液，72 h后加入嘌呤霉素（終質(zhì)量濃度為2 μg/ml）篩選細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為80%，行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TE-13細(xì)胞中GLUT-1 mRNA的表達(dá)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組TE-13細(xì)胞，按1× 105/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細(xì)胞2遍，加入Trizol提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)比值為260 nm/280 nm的光密度（optical density，OD）值為1.8～2.0，檢測(cè)總RNA的濃度和純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 1 mg進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。GLUT-1基因上游引物序列為5′-TGTGGATTGAGGGTAGGAGGT-3′，下游引物序列為5′-TGAGCAAGAGGACACTGATGA-3′，內(nèi)參照GAPDH上 游 引 物 序 列 為 5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′，每組樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件如下：第一步，95℃預(yù)變性30 s；第二步，95℃5 s、60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct值，用2-δδCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中GGLLUUTT-- 11、MMMMPP-- 22、MMMMPP-- 99和HHIIFF-- 11 α蛋白的表達(dá)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組TE-13細(xì)胞，按1×105/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2遍，用RAPI提取細(xì)胞蛋白，取裂解好的蛋白樣品上樣，進(jìn)行10%SDSPAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），麗春紅染色觀察各電泳帶的蛋白表達(dá)量。以5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入小鼠抗人GLUT-1多克隆抗體和兔抗人MMP-2、MMP-9、HIF-1α單克隆抗體（稀釋比例均為1∶1000）以及內(nèi)參照β-actin單克隆抗體（稀釋比例為1∶1000），4℃孵育過夜，TBST漂洗4次，每次10 min，再加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，均按1∶3000稀釋），室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次10 min，最后以化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像儀顯像。使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照βactin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.3CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，以3000/孔接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后，分別在24、48、72 和96 h時(shí)間點(diǎn)，每孔加入CCK-8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值，以此反映細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4FCM法檢測(cè)細(xì)胞周期將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組TE-13細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，分別于12、24 h收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%的乙醇溶液于-20℃固定細(xì)胞3 h，離心收集細(xì)胞，PBS漂洗1次，加入500μl含50μg/ml碘化丙啶及100μg/mlRNase A的PBS，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力收集GLUT-1-shRNA組和陰性對(duì)照組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后按6×104/孔的密度將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入1ml含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后取出小室，PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛溶液固定15 min，用棉簽擦去上層細(xì)胞，加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min。自來水沖洗3次，顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5軟件對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)-據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后TE-13細(xì)胞GLUT-1表達(dá)明顯降低

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GLUT-1-shRNA的TE-13細(xì)胞中GLUT-1 mRNA的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯下調(diào)（t=4.181，P<0.05；圖1A）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GLUT-1-shRNA的TE-13細(xì)胞中GLUT-1蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組（t=6.713，P<0.01；圖1B）。

2.2沉默GLUT- 1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-13增殖的影響

24、48、72、96h時(shí)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GLUT-1-shRNA的TE-13細(xì)胞在24、48 h的增殖水平未見明顯變化，但是在72、96 h時(shí)GLUT-1-shRNA組細(xì)胞的增殖水平表現(xiàn)為明顯抑制（t=3.097，P<0.05；t=3.497，P< 0.05）。（圖2）

圖1　shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后TE-TE-1313細(xì)胞GLUT-GLUT-1 1表達(dá)

圖2 CCK-8法檢測(cè)陰性對(duì)照組與GLUT-1-shRNA組TE-13細(xì)胞增殖的比較

2.3沉默GLUT-1表達(dá)對(duì)食管鱗癌TE-13細(xì)胞周期分布的影響

FCM法檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默GLUT-1的表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-13細(xì)胞周期在12、24 h時(shí)均無影響。（圖3）

圖3　FCM檢測(cè)陰性對(duì)照組與GLUT-1-shRNA組TE-1313細(xì)胞周期的比較

2.4沉默GLUT- 1表達(dá)對(duì)食管鱗癌TTEE--1133細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），直觀評(píng)價(jià)見GLUT-1-shRNA組細(xì)胞較陰性對(duì)照組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)減少。

圖4　4　Transwellswell法檢測(cè)陰性對(duì)照組與GLUT-1-shRNAshRNA組TE-13細(xì)胞遷移的比較（×100100）

2.5沉默GLUT- 1表達(dá)對(duì)食管鱗癌TE-13細(xì)胞中MMP- 2、MMP- 9和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果見圖5。與陰性對(duì)照組相比，沉默GLUT-1表達(dá)后對(duì)TE-13細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)無影響（t=2.582，P>0.05），而MMP-9和HIF-1α蛋白的表達(dá)水平則均被明顯下調(diào)（t=6.895，P<0.01；t=13.74，P<0.001），詳見圖6。

圖 5　陰性對(duì)照組與GLUT- 1-shRNA組TE-13細(xì)胞MMP-2、MMP- 9和HIF-1α表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

圖6　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)陰性對(duì)照組與GLUT-1-shRNA組TE-13細(xì)胞MMP-2、MMP-9和HIF-1α 表達(dá)的比較

3　討論

GLUT是分布在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的一類跨膜糖蛋白，幾乎存在所有的組織中，其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞能量代謝提供基本的葡萄糖供應(yīng)[10]。惡性腫瘤組織為了滿足其無序、快速增殖以及無氧糖酵解為主要能量代謝途徑的要求，通常在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面呈現(xiàn)GLUT-1蛋白的異常高表達(dá)，來增加葡萄糖的攝取，并與腫瘤的惡性進(jìn)展程度和侵襲轉(zhuǎn)移表現(xiàn)密切相關(guān)[6,11-12]。本研究利用慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞TE-13，干擾其GLUT-1的表達(dá)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GLUT-1-shRNA慢病毒后的TE-13細(xì)胞的GLUT-1蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下降，表明本研究成功地建立了GLUT-1蛋白穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞株。后續(xù)的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示：相比陰性對(duì)照組，GLUT-1干擾后TE-13細(xì)胞的增殖在72、96 h表現(xiàn)為明顯的抑制，考慮是由于TE-13細(xì)胞膜表面GLUT-1蛋白表達(dá)降低后，減少了葡萄糖通過GLUT-1進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量，降低了細(xì)胞的能量供給，即糖酵解的速率；同時(shí)，由于糖酵解速率的降低，致使糖酵解過程中產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖、丙酮酸數(shù)量減少，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速增殖所需的脂肪酸、核苷酸等合成降低，最終抑制了食管癌細(xì)胞的增殖[6]。這個(gè)結(jié)果有力地證實(shí)了選擇調(diào)低或抑制食管癌細(xì)胞GLUT-1蛋白的表達(dá)，將會(huì)有效抑制食管癌細(xì)胞的增殖。但是檢測(cè)的細(xì)胞周期結(jié)果顯示，沉默GLUT-1表達(dá)后TE-13的細(xì)胞周期在12、24 h未見明顯變化，這與增殖實(shí)驗(yàn)中TE-13細(xì)胞在48 h內(nèi)未見明顯增殖表現(xiàn)相吻合，可能由TE-13細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖特性所決定。

已知腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與，多階段、多步驟完成的復(fù)雜過程[16]。其中糖酵解過程生成的乳酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外可造成腫瘤組織微環(huán)境酸化，從而為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移做好了環(huán)境準(zhǔn)備。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞或周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附及促進(jìn)新生血管形成來促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其中MMP-2、MMP-9是金屬蛋白酶家族中與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的因子。對(duì)人體不同部位和組織所進(jìn)行的研究顯示，MMP表達(dá)類型和組織類型之間存在著特定的緊密聯(lián)系。溫洪濤等[17]采用免疫組織化學(xué)和Westem blot法檢測(cè)了41例食管鱗癌組織及相應(yīng)正常食管組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：食管鱗癌組織中MMP-9的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及靜脈侵襲顯著相關(guān)；而食管鱗癌組織中MMP-2的陽性表達(dá)率與蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于MMP-9，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及靜脈侵犯無關(guān)。而Liao等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制肺腺癌細(xì)胞A549的GLUT-1蛋白表達(dá)，通過GLUT-1/MT1-MMP/MMP-2通路降低MMP-2的表達(dá)，從而達(dá)到降低腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的目的。雖然目前尚未見有關(guān)食管鱗癌GLUT-1/MT1-MMP/ MMP通路的研究報(bào)道，但是我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：沉默GLUT-1表達(dá)后，食管鱗癌TE-13細(xì)胞的MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，而MMP-2蛋白的表達(dá)未見明顯的變化，提示我們?cè)谑彻荀[癌細(xì)胞應(yīng)該存在著GLUT-1/MT1-MMP/MMP-9的調(diào)控通路，可能在調(diào)控食管鱗癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移上起著重要的作用，這有待于進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。同時(shí)進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，沉默GLUT-1表達(dá)，使TE-13細(xì)胞的遷移能力降低，提示沉默GLUT-1表達(dá)后TE-13細(xì)胞遷移一定程度被抑制。研究表明，腫瘤細(xì)胞的遷移和對(duì)周圍組織、血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，其發(fā)生與進(jìn)展需要與細(xì)胞增殖、分化、移動(dòng)的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變和促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)的外界因素二者的共同作用[19]。武寧等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的二甲雙胍能夠促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞遷移，并與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞MMP-9蛋白高表達(dá)密切相關(guān)。因此，我們考慮沉默GLUT-1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移降低可能是由于GLUT-1蛋白表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取減少，細(xì)胞能量供給及增殖減低以及腫瘤細(xì)胞MMP-9表達(dá)降低等多因素所致。這些結(jié)果提示我們?nèi)绻訥LUT-1蛋白作為治療靶點(diǎn)，有可能通過抑制食管癌細(xì)胞增殖和MMP-9的表達(dá)，降低甚至阻止食管癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附的能力，從而降低食管癌的侵襲能力，預(yù)防或減少食管癌的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。

惡性腫瘤細(xì)胞常處于失控性生長(zhǎng)及高代謝狀態(tài)，故缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境特征之一，與腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[21]。葡萄糖酵解不僅適合于腫瘤組織廣泛存在的低氧環(huán)境，而且缺氧時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和GLUT-1的過度表達(dá)將促進(jìn)糖代謝增加滿足腫瘤生長(zhǎng)能量代謝的需要。HIF-1α是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能激活許多缺氧反應(yīng)性蛋白的表達(dá)，使組織產(chǎn)生一系列適應(yīng)反應(yīng)而得以在缺氧狀態(tài)下生存[22]。一般情況下，腫瘤組織因缺氧導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)增加，過度表達(dá)的HIF-1α通過與不同缺氧反應(yīng)蛋白如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和GLUT-1等啟動(dòng)子和增強(qiáng)子上的HIF-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，提高這些蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，維持癌細(xì)胞的能量代謝，為癌細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)低食管鱗癌TE-13細(xì)胞GLUT-1蛋白的表達(dá)，其HIF-1α的表達(dá)亦呈現(xiàn)明顯的降低。雖然這一結(jié)果的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究加以說明?？紤]可能是由于GLUT-1蛋白表達(dá)降低，使得腫瘤細(xì)胞代謝、增殖能力下降，導(dǎo)致其乏氧程度得到改善，進(jìn)而引起HIF-1α蛋白表達(dá)降低；或者因沉默GLUT-1表達(dá)，導(dǎo)致與HIF-1α相結(jié)合的GLUT-1靶點(diǎn)減少所致。

本研究通過慢病毒為載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)獲得了能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾食管鱗癌TE-13細(xì)胞GLUT-1蛋白表達(dá)的sh-RNA；通過對(duì)沉默GLUT-1表達(dá)后TE-13細(xì)胞在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的觀察，提示我們通過調(diào)低或抑制食管鱗癌細(xì)胞膜GLUT-1蛋白的表達(dá)水平，能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并調(diào)低與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-9蛋白的表達(dá)，在一定程度上為尋求以調(diào)低GLUT-1蛋白表達(dá)為治療腫瘤靶點(diǎn)建立了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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The effects of GLUT-1 knockdown on proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma cell line TE-13△

CHEN Tao1*#LIU Xiao-xing2*CHEN Yu-mei1SHI Yi-ping1WAN Liang-rong1LIU Jian-jun11
Department of Nuclear Medicine,2Department ofRadiation Oncology,Renji Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127,China.

ObjectivectiveTo investigate the effects of glucose transporter protein-1(GLUT-1)knockdown on cell proliferation,cycle and migration of the esophageal squamous carcinoma cell line TE-13,and to study the background mechanism.MethodethodCell line TE-13 were transfected with a lentiviral vector carrying the GLUT-1-shRNA which is specific to GLUT-1 gene,then the stably interfered GLUT-1 expression cells were selected and all cells were divided into 2 groups: GLUT-1-shRNA group and negative control group.Real-time PCR and western blot analysis were used to determine the mRNA and protein levels of GLUT-1 in negative control and GLUT-1-shRNA transfected TE-13 cells.The cell proliferation,cell cycle and migration were analyzed by CCK-8 assay,flow cytometry,transwell analysis,respectively.Furthermore,the levels of proteins that were involved in migration or hypoxia were analyzed by western blot.ResultesultLentivirus mediated shRNA knockdown of GLUT-1 significantly downregulated the mRNA level(t=4.181,P<0.05)and protein level(t=6.713,P<0.01)of GLUT-1.Compared with negative control,the proliferation(72 h:t=3.097,P<0.05;96 h:t=3.497, P<0.05)of migration of TE-13 cells was significantly inhibited by GLUT-1 shRNA knockdown.However,the cell cycle showed no significant changes in 24 h after transfection.Moreover,the expression of MMP-9(t=6.895,P<0.01)and HIF-1α(t=13.74,P<0.001)were significantly downregulated by GLUT-1 shRNA knockdown,while the expression of MMP-2 (t=2.582,P>0.05)remained unchanged before and after GLUT-1 knockdown.ConclusionusionGLUT-1 knockdown by shRNA significantly inhibits the proliferation and migration of TE-13 cells.And the levels of MMP-9 and HIF-1α are significantly downregulated by GLUT-1 knockdown,which provides preliminary theoretical basis in searching for targeted therapy for esophageal carcinoma.

ds:Esophageal squamous cell carcinoma;GLUT-1;proliferation;cell cycle;migration

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.01.15

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基金（12ZR1418100）

*兩位作者對(duì)本文的貢獻(xiàn)等同

（corresponding author），郵箱：drchen1207@sina.cn

2015-11-17）